Fortebio-分子相互作用仪
Fortebio Octet BLI 实验设计及数据获取-小分子动力学
Small Molecule Kinetics Assay:概述：Octet可检测分子量为150 Da~1000 Da的小分子与蛋白间相互作用。
该SOP的目的在于为小分子动力学检测提供通用标准化流程，针对具体分子及特殊情况，可能需要进一步考虑更多细节及优化。
此外，该SOP假定所有使用者已经过ForteBio应用科学家上机培训，如若不然，请在培训完成后参考该SOP。
考量及建议：1.检测小分子时，应当使用SSA sensor（Cat# 18-0008 and 18-0009），该sensor是ForteBio公司目前唯一具备检测小分子灵敏度的传感器。
2.用于与小分子结合的蛋白或抗体必须先进行生物素化。
请参阅ForteBio技术说明书。
3.建议assay buffer为PBS+0.1%BSA+0.02%TW20+5%DMSO（如果为水溶性小分子，则无需加DMSO等有机溶剂）；4.设置protocol时，须设置两组SSA sensor，运行中第1组为实际检测用sensor，第2组为生物胞素（biocytin）封闭后、用作阴性对照的sensor。
5.检测sensor与对照sensor间运行步骤数以及各步运行时间必须一致——任何偏差将导致数据无法分析。
6.用于loding的生物素化蛋白浓度建议采用50ug/ml。
如蛋白很小或容易产生空间位阻，可能需要进行定量。
如蛋白较宝贵，其用量可以更低，但随后的结合效率可能会有所折扣（17kDa的蛋白在推荐浓度下3min后可产生2nm的shift）。
蛋白生物素化7.如果需要有机溶剂溶解小分子，稀释样品时DMSO最终浓度建议保持在5%以内（例如：溶于100%DMSO中20mM的样品，按照1:20溶于PBS后其浓度为1mM，DMSO为5%）。
8.建议对样品进行两轮筛选。
例如，第1轮宽泛筛选，浓度为100,10,1,0.1uM，确定样品大概Kd范围；第2轮更精细筛选：30,10,3.3,1.1uM（或者2被剃度稀释）获取高度可信的Kd。
分析测试中心收费标准
超高分辨率显微镜
GE API OMX V4
450元/小时
200元/小时
试运行价格
光谱小动物活体成像系统
CRi Maestro
500元/小时
300元/小时
设备名称
仪器型号
收费标准
备注
所外
所内
分子相互作用仪
Fortebio Octet RED
200元/探针
100元/小时
120元/探针
50元/小时
扫描电镜（能谱）
HITACHI U8010
500 元/小时
200 元/小时
扫描制样
固定脱水
150元/个
100元/个
所外包干
500元/个
所内包干
300元/个
（试运行价格）
喷金
150元/个
100元/个
电镜观察
250元/个
150元/个
超高速冷冻离心机
Beckman XL-100K
150元/小时
80元/小时
150元/个
100元/个
所外包干
500元/个
所内包干
300元/个
制片+染色
150元/个
100元/个
电镜观察
250元/个150元/个冷冻源自薄切片Leica EM UC7
500元/个
300元/个
不含免疫标记（试运行价格）
电镜负染制片
100 元/个
50 元/个
如含样品观察所外200元/个，所内100元/个
750元/小时
500元 /小时
半小时起算
BD FACS AriaIII（分析）
60元/样本
30元/样本
fortebio
Fortebio技术概览引言Fortebio是一家生物科技公司，致力于提供先进的生物分析和生物传感技术解决方案。
该公司的核心技术包括光学生物传感技术，用于监测生物分子的相互作用。
本文将对Fortebio 公司的技术进行概览，并介绍其应用领域和优势。
技术原理Fortebio的核心技术基于表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）现象，这是一种用于研究生物分子相互作用的光学技术。
SPR技术通过检测生物分子的表面等离子体共振现象，可以实时监测和分析生物分子之间的相互作用。
Fortebio的SPR技术基于Biolayer Interferometry（BLI）原理，该原理通过改变表面反射的光信号，实现对生物分子相互作用的监测。
BLI技术具有高灵敏度、快速响应和实时监测等优点，已广泛用于生物学研究、药物开发和临床诊断等领域。
应用领域Fortebio的技术广泛应用于生物领域的各个方面，包括但不限于以下应用领域：蛋白质相互作用研究Fortebio的技术可以实时监测和分析蛋白质之间的相互作用。
通过测量蛋白质的结合动力学和亲和力，研究人员可以深入了解蛋白质的功能和作用机制。
这对于药物开发、蛋白质工程和生物学研究都具有重要意义。
药物研发Fortebio的技术可以帮助加速药物研发过程。
通过实时监测药物与靶标蛋白的相互作用，研究人员可以评估药物的亲和力和效力，优化药物设计和筛选潜在药物候选物。
这有助于加快药物研发的速度和降低研发成本。
病原体检测与诊断Fortebio的技术还可以应用于病原体的检测和诊断。
通过与病原体相关的抗原或抗体的相互作用，可以提高病原体的检测灵敏度和特异性。
这对于传染病的快速诊断和筛选病原体也具有重要意义。
基因组学研究Fortebio的技术可以用于研究基因组学。
通过检测DNA的结合与修饰，研究人员可以了解基因的表达调控机制和细胞过程。
这对于基因组学研究和疾病诊断有重要意义。
分析测试中心收费标准
500元 /小时
半小时起算
BD FACS AriaIII（分析）
60元/样本
30元/样本
分析流式细胞仪
贝克曼
BCEpics XL
20元/样本
10元/样本
中国科学院武汉病毒研究所分析测试中心
2013年6月
全自动微生物鉴定仪
BIOLOG GEN 3 Omnilog Combo Plus
500元/板
300元/板
圆二色谱仪
Applied Photophysics Chirascan
300元/小时
150元/小时
差示扫描量热仪
TANANO DSC
200元/小时
70元/小时
分选流式细胞仪
BD FACS AriaIII（分选）
扫描电镜（能谱）
HITACHI U8010
500 元/小时
200 元/小时
扫描制样
固定脱水
150元/个
100元/个
所外包干
500元/个
所内包干
300元/个
（试运行价格）
喷金
150元/个
100元/个
电镜观察
250元/个
150元/个
超高速冷冻离心机
Beckman XL-100K
150元/小时
80元/小时
分析测试中心收费标准
设备名称
仪器型号
收费标准Biblioteka 备注所外所内200千伏透射电子显微镜
FEI Tecnai G220 TWIN
500元/小时
200元/小时
HITACHI H-7000FA
冷冻透射电镜
FEI Tecnai G220 TWIN
800元/小时
q-exactive 质谱仪 原理
q-exactive 质谱仪原理Q-Exactive是一种高分辨率质谱仪，常用于生物分析、药物研发和其他化学分析领域。
以下是Q-Exactive质谱仪的基本原理：1.质谱部分：Q-Exactive使用了一种称为Orbitrap的质谱技术。
Orbitrap技术是一种高分辨率和高灵敏度的质谱技术。
它基于一个稳定的静电场，通过在两个电极之间加电荷使离子绕轴心轨道运动。
质谱仪能够测量离子的频率和幅度，从而确定其质荷比。
2.Ionization（离子化）：样品中的分子首先被离子化，通常使用电喷雾离子源（ElectrosprayIonization，ESI）或者大气压化学电离（Atmospheric Pressure Chemical Ionization，APCI）等技术。
3.质谱分离：离子通过一系列的离子光学设备，如四极杆和激发的离子单色仪，被分离和筛选。
这有助于选择性地将特定离子引入Orbitrap。
4.Orbitrap分析：离子进入Orbitrap，其轨道上形成一个高频率的、稳定的静电场。
当离子在这个静电场中运动时，它们会产生一个与离子数成正比的电流。
这个电流信号被测量并转换为质谱图。
5.数据处理：质谱图的数据可以通过计算机进行处理，以提取有关分析物的信息。
这包括质量-电荷比，相对丰度等。
优点：1.高分辨率：Q-Exactive提供非常高的分辨率，有助于更准确地确定化合物的质量。
2.高灵敏度：对低浓度的化合物也具有较高的检测灵敏度。
3.广泛适用性：可用于蛋白质鉴定、代谢组学、药物研发等多个领域。
注意：实际的仪器配置和工作原理可能因不同型号的Q-Exactive和使用的具体实验条件而有所不同。
详细的操作手册和仪器文献可提供更具体的信息。
Octet BLI 小分子结合动力学检测实验设计Small Molecule Kinetics
Small Molecule Kinetics Assay:概述：Octet RED系列可检测分子量为150 Da~1000 Da的小分子与蛋白间相互作用。
该SOP的目的在于为小分子动力学检测提供通用标准化流程，针对具体分子及特殊情况，可能需要进一步考虑更多细节及优化。
此外，该SOP假定所有使用者已经过ForteBio应用科学家上机培训，如若不然，请在培训完成后参考该SOP。
考量及建议：1.采用RED系列检测小分子时，应当使用SSA sensor（Cat# 18-0008 and 18-0009），该sensor是ForteBio公司目前唯一具备检测小分子灵敏度的传感器。
2.用于与小分子结合的蛋白或抗体必须生物素化。
请参阅ForteBio技术说明书。
3.建议assay buffer为PBS+5%DMSO；4.设置protocol时，须设置两组SSA sensor，运行中第1组为实际检测用sensor，第2组为生物胞素（biocytin）封闭后、用作阴性对照的sensor。
5.至关重要的是，检测sensor与对照sensor间运行步骤数以及各步运行时间必须一致-任何偏差将导致所得数据无法于Octet RED软件上分析。
6.用于loding的生物素化蛋白浓度建议采用50ug/ml。
如蛋白很小或容易产生空间位阻，可能需要进行定量。
如蛋白较宝贵，其用量可以更低，但随后的结合效率可能会有所折扣（17kDa的蛋白在推荐浓度下3min后可产生2nm的shift）。
7.稀释样品，DMSO最终浓度为5%（例如：溶于100%DMSO中20mM的样品，按照1:20溶于PBS后其浓度为1mM，DMSO为5%）。
8.建议对样品进行两轮筛选。
例如，第1轮宽泛筛选，浓度为100,10,1,0.1uM，确定样品大概Kd范围；第2轮更精细筛选：30,10,3.3,1.1uM，获取高度可信的Kd。
（注意：所用浓度仅用于发挥导向性作用，实际浓度取决于初筛所获得Kd）。
Fortebio Octet 生物膜干涉技术(BLI)常见问题解答-第二版
生物膜干涉技术(BLI) 常见问题解答（第二版）目录缩写说明 (2)动力学相关术语 (2)传感器和仪器相关术语 (2)生化相关术语 (3)1 实验基本常识 (3)1.1如何自学 (3)1.2关于动力学 (3)1.3关于耗材与样品要求 (5)1.4关于生物膜干涉技术 (7)1.5软件与硬件性能参数 (8)1.6关于应用 (11)1.7关于基本操作 (11)2 动力学实验设计与操作 (15)2.1 关于固化和传感器的选择 (15)2.2 关于结合和解离 (19)2.3 关于传感器再生 (20)2.4 小分子检测 (21)2.5 动力学实验操作 (23)2.6 动力学实验数据处理 (29)2.7实验常见问题（动力学部分） (39)3 定量实验设计与操作 (44)3.1定量实验设计 (44)3.2 定量实验操作 (46)3.3定量实验数据处理 (48)3.4实验常见问题（定量部分） (51)4 仪器维护与硬件问题 (51)5 联系我们 (55)缩写说明动力学相关术语k on或k a：结合速率常数，单位M-1s-1k off或者k d：解离速率常数，单位s-1K D：亲和力常数（解离平衡常数），单位Mk obs：表观结合常数[C]：分析物浓度Ligand：配体，即固化在传感器上的物质Analyte：分析物，即与固化物质结合的物质R max：理论上分析物结合信号的最大值，即所有ligand均被analyte结合后所获得的信号Req：分析物结合达到平衡时的信号值Initial slope：起始斜率BLI：生物膜干涉技术Baseline：平衡步骤Association：结合步骤Dissociation：解离步骤Loading：固化步骤传感器和仪器相关术语SA：链霉亲和素传感器SSA：超级链霉亲和素传感器APS：氨基丙基硅烷传感器AR2G：氨基偶联传感器AHC：抗人免疫球蛋白Fc段传感器AHQ：人免疫球蛋白定量传感器AMQ：鼠免疫球蛋白定量传感器AMC：抗鼠免疫球蛋白Fc段传感器NTA：镍离子传感器anti-His：抗组氨酸标签传感器anti-GST：抗GST标签传感器Capture类传感器：除去SA，SAX，SSA，AR2G，APS外的传感器Octet：Octet家族仪器，包含Octet RED，RED96，QK，QKe，QK384，RED384，HTX，K2RED系列仪器：RED，RED96，RED384，K2QK系列仪器：QK，QKe，QK384生化相关术语EDC：1-(3-二甲基氨丙基) -3-乙基-碳化二亚胺NHS：N-羟基琥珀酰亚胺HRP：辣根过氧化物酶DAB：二氨基联苯胺，一种HRP的底物，在HRP催化后可以生成金属沉淀EMSA：电泳迁移率实验，用来研究DNA和蛋白的结合Epitope binning：表位分析His-tag：组氨酸标签Co-IP：免疫共沉淀PBS：磷酸盐缓冲液BSA：牛血清白蛋白hIgG：人免疫球蛋白mIgG：鼠免疫球蛋白1:1反应：一份的ligand与一份的analyte形成一份的产物，即两者只有一个结合位点2:1反应：Ligand上有2个可以和analyte的结合位点，并且两者独立1:2反应：Analyte上有2个可以和ligand结合的位点，并且两者独立1 实验基本常识1.2关于动力学1.2.1 k on, k off, K D值各代表什么意义？生物分子间的相互作用一般视为可逆反应。
Fortebio生物分子相互作用检测平台-中文版
- 两个板位可独立使用96-plate或 384plate
Octet 系统与工作站联用
• Automated door and plate stage • Works with articulated arm and
track-style robotic systems • Plate stage presents the biosensor
/wiki/Interference
Biolayer Interferometry（BLI）技术的原理
改变膜厚度对干涉光的影响
100% 0
Wavelength
Relative Intensity
Biolayer Interferometry（BLI）技术的原理
实时无标记生物分子相互作用检测平台
Fortebio Octet 检测平台
ForteBio Octet QK、Qke、RED平台内部
Fortebio Octet 384全自动检测平台
• 使用96或384不同的微孔板类型 • 通量更高，样品消耗更少； • 384 tilted well 使用384微孔板，反应体系更小；
tray, sample and reagent plates for robot • Octet software has automation hooks enabled to interact with robot software
Octet 检测平台型号差异
Molecular Weight Range
Octet Solution
ForteBio Inc.—艾瑞生物技术（上海）有限公司
• 公司的历史：
• 2004年成立，在美国加州Menlo Park, 英国London, 和中国 • 上海建有生产和技术中心
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实时检测，非标记的 生物分子互作检测平台
Octet 可分析多种生物分子间的相互作用
Size
1000 nm 200 nm 75 nm
MW
Cells Bacteria Virus IgM IgA
1,000,000
Bacteria Virus Antibody - Antigen Receptor - Ligand DNA - DNA
Octet 系统和特点
Octet 系统的优点
• 更高的通量, 更快的实验流程
• 8-16个样品同时检测，是非标记技术中通量最高的 • 15-30分钟可以完成96个样品的分析
• 没有溶液控制系统，不需要清洗和维护流路，直接开始读取数据
• 操作简单
• 适应多用户的情况，经过半天的培训就可以操作和使用 • 不需要特别优化实验条件，传感器是抛弃式的 直接检测粗制的样品，甚至是样品中存在不溶解的成分 耐受各种溶液环境，只有结合到传感器表面的分子才会被检测 病毒颗粒等大分子样品也能得到动力学结果 检测共价键结合的样品
7 nm
IgG, IgD, IgE
100,000
DNA - Protein Antibody Fragment - Antigen Antigen – Fusion Protein Antibody - Peptide
Antibody Fragments
Proteins Peptides Nucleotides (DNA)ຫໍສະໝຸດ Octet系统可提供的数据
亲和力测定
• Binding KD • On and off rates • Rank order
结合特异性
• Yes / No kinetic screening • Epitope binning / mapping
蛋白质浓度定量（混合物）
• Picogram to milligram dynamic range • Contaminant testing
– SDi 2010 Market Report survey – 成长最快速的非标记技术公司
• 公司发展的远景：成为每个实验室都能拥有的分子互作 系统
专业的服务
•在中国有2名硬件工程师，3名应用工程师 •除了提供批量生产的生物传感器以外， 还可以为用户定制传感器 •提供实验方法开发和优化服务
国内用户名单
军事医学科学院 2台 Novo Nordisc中国研发中心 中国生物制品药品检定所 神州细胞工程有限公司 中科院武汉病毒所 厦门大学 天津商业大学 上海药明康德新药开发有限公司 GSK中国研发中心 Novartis中国研发中心 上海旭华生物科技有限公司 江苏太平洋美诺克生物药业有限公司 江苏泰康生物医药有限公司
Mab #2
2
3 4 5 6 7 8 9 10
0.7435
0.7431 0.7822 0.7702 0.6712 0.7221 0.7654 0.7515 0.7729
Regeneration solution = 1mM HCl
Avg. nm Shift StDev %CV 0.7427 0.0346 4.7%
• 更宽的应用范围
• • • •
• 更低使用和维护的成本
• 相对其他的非标记检测系统，耗材的成本低 • 系统稳定，未来的使用和维护成本也低
传感器种类12种
Application Quantitation Sensor Type Anti-Human IgG Fc Anti-Murine IgG (Fab’)2 Protein A/G/L Streptavidin (SA) Anti-Penta-HIS (HIS) Regeneration Yes Yes Yes Yes
Kinetics
Streptavidin (SA) Super Streptavidin (SSA) Amine Reactive (AR) Aminopropylsilane (APS) Anti-hIgG Fc Capture Surface (AHC) Anti-mouse Capture Surface
Octet生物分子相互作用系统
ForteBio Inc.
• 2004年由华人物理学家创立, 2009年开始在中国销售 • 专利的生物膜干涉 Bio-Layer Interferometry (BLI)技术 • 总部在美国硅谷 • 全球超过350个用户，中国14个用户 • 全球第二的专业非标记技术厂商
Dip and Read Immunogenicity Kit Dip and Read Residual Protein A Detection Kit
Yes Yes Yes Yes Yes
No No
Kits
为目前种类最多的供应商
可以根据用户的应用设计传感器
传感器可再生使用
ADA ID Mab #2 Cycle # 1 nm Shift 0.7049
1 nm 1,000
Small Molecules
Atoms
Multiple Antibody Pairings
150
Antibody - Small Molecule
1
0.1 nm
Protein - Small Molecule
Current Octet assays within blue area
Octet 产品简介
Octet Instruments • 5种型号 - Octet QK, Octet Qke, Octet RED, Octet QK384, Octet RED 384 • 使用通用的样品板(96 and 384 well) • 没有流路系统 • 样品经过检测后，仍然留在原处，可以回收再使用 Biosensors • 浸入样品即检测，1至16个样品可以同时检测 • 10种传感器可供选择，分析不同种类的样品 • 传感器为抛弃式设计，既可以检测共价键结合的样品 也可以再生使用 Software and computer • 常用实验方法已经预制在模板中 • 不需要单独购买软件 Validation options • 经过验证, 提供IQOQ服务, 符合美国FDA CFR Part 11 标准
Mab #2 Mab #2 Mab #2 Mab #2 Mab #2 Mab #2 Mab #2 Mab #2
Streptavidin (SA) sensor 表面固定了生物素化的蛋白质药物 10%的猴血清样品，含有抗该药物的抗体 可同时平行优化8种传感器再生条件 每个传感器表面结合抗体以后进行再生，如此反复10次 由于8个传感器上的数据可以同时检测，因此3分钟内就可以得到8个数据 最终每个样品的检测成本仅为4元人民币