生物显微技术 第四章 免疫组化
免疫组化步骤总结
免疫组化步骤总结免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测和定位特定分子在组织和细胞中的表达情况。
本文将对免疫组化的步骤进行总结，以帮助读者更好地了解和应用这一技术。
免疫组化步骤主要包括样本制备、抗原修复、阻断非特异性结合、一抗孵育、二抗孵育、信号放大、显色与染色、显微镜观察和结果分析等环节。
下面将对这些步骤进行详细介绍。
1. 样本制备：首先，需要选择合适的组织样本或细胞，可以通过切片、细胞培养等方法获得。
然后，将样本固定在载玻片上，常用的固定剂有福尔马林和乙醛等。
固定后，需要进行脱水和透明化处理，使样本适合于免疫组化的进一步步骤。
2. 抗原修复：有些抗原在固定和加工过程中可能会丧失免疫反应性，需要进行抗原修复。
常用的方法有热处理、酶解等，目的是使抗原恢复其免疫原性，提高抗体的特异性和敏感性。
3. 阻断非特异性结合：在进行免疫反应之前，需要阻断非特异性结合位点，减少假阳性结果。
可使用一些蛋白质，如牛血清蛋白、牛血清、小鼠血清等，进行预处理，将其涂覆在样本上，阻断不特异性结合位点。
4. 一抗孵育：将特异性抗体（一抗）与样本接触，孵育一定的时间，使抗体与靶分子发生特异性结合。
一抗可以是单克隆抗体或多克隆抗体，具体选择要根据实验需求和抗体的特异性来确定。
5. 二抗孵育：一抗与抗原结合后，需要加入与一抗来源物种不同的二抗。
二抗是与一抗来源物种的免疫球蛋白发生反应的抗体。
二抗可以标记有荧光物质、酶物质等，以便于后续的信号放大和显色。
二抗的选择要根据一抗的来源物种和实验需要来确定。
6. 信号放大：为了增强免疫反应的信号，可以使用一些信号放大的技术。
常用的信号放大方法有生物素-链霉亲和素系统(Biotin-Streptavidin System)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。
这些方法可以使目标物质的信号增强，提高实验的灵敏度和准确性。
7. 显色与染色：信号放大后，需要进行显色与染色步骤。
这一步骤可以根据实验需要选择适当的染色剂，如荧光染料、酶标记物等。
免疫组化操作方法
免疫组化操作方法免疫组化是一种常用的实验方法，用于检测和定位细胞或组织中特定蛋白质的表达。
它结合了免疫学和生化学的原则和技术，可以提供对细胞或组织中不同蛋白质的分子特征、活动状态和相互作用的信息。
本文将详细介绍免疫组化的操作方法，包括材料和试剂的准备、标本的制备和固定、抗原检测和可视化等步骤。
材料和试剂的准备1.活体或固定的细胞或组织标本。
2.组织培养基和适当的培养器具。
3.PBS(磷酸缓冲盐溶液)或其他细胞/组织冲洗缓冲溶液。
4.组织切片刀、显微刀片、显微镊子、镊子等操作工具。
5.细胞/组织固定剂，如乙醛、甲醛、乙酸乙酯等。
6.可溶性和固相抗原检测试剂，如抗体、蛋白质等。
7.染色试剂，如荧光染料、酶底物等。
8.实验室耗材和设备。
标本的制备和固定1.如果使用活体标本，如细胞培养物，应先将其转移到无菌培养器皿中，并在适当的培养条件下培养至合适的生长期。
2.对于组织标本，可以通过切片或切块的方式进行制备。
切片时要求切片薄而均匀，一般为5-10μm。
切块时要求尽量保持组织完整性。
3.制备好的细胞或组织标本需要尽快进行固定，以保持其形态和蛋白质的天然状态。
常用的细胞/组织固定剂有乙醛、甲醛和乙酸乙酯。
不同的固定剂选用方法有一定差异，具体应根据实验要求和文献建议进行选择。
抗原检测和可视化1.固定后的标本需要进行脱水和透明化处理，以便于抗原检测的进行。
可以使用乙醇或队列进行脱水处理，然后用透明化溶剂进行透明化处理。
2.抗原检测需要使用抗体识别目标蛋白质。
对于免疫组织化学，常用的抗体类型包括一抗和二抗。
一抗为直接与目标抗原反应的抗体，二抗为与一抗结合并由可视化标记物进行信号产生的抗体。
一抗和二抗的选择应根据目标抗原和实验要求进行合理选择。
3.免疫染色前，可进行一些前处理步骤以增强染色效果，如抗体预处理、抗原修复、背景消除等。
4.免疫染色操作中，需要逐层进行抗体处理、洗涤和可视化标记物处理。
一般步骤包括：一抗与标本结合、一次洗涤、二抗与一抗结合、二次洗涤、可视化标记物与二抗结合、最终洗涤。
免疫组化实验步骤
免疫组化实验步骤免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质的存在和定位。
其步骤包括样本制备、抗原去原、阻断试验、一次抗体处理、二次抗体处理、显色和镜检。
下面将详细介绍每个步骤：1.样本制备：收集需要检测的样本，可以是细胞、组织或体液。
样本收集后，需要进行固定和切片处理，以保持细胞和组织结构的完整性。
2.抗原去原：蛋白质在组织中可能会被结构和其他因素影响，使其在免疫组化实验中难以被检测到。
因此，需要进行抗原去原处理。
常用的方法有热处理、酸碱处理、酶解处理等。
3.阻断试验：细胞和组织常常会存在非特异性结合位点，会使得后续的免疫反应变得模糊不清。
为了减少这种非特异性结合，需要进行阻断试验。
常用的阻断试验方法有牛血清白蛋白（BSA）、动物血清等。
4.一次抗体处理：在一次抗体处理步骤中，需要准备与目标蛋白质特异性结合的一次抗体。
将制备好的一次抗体加入样本中，使其与目标蛋白质发生反应，并形成抗原抗体复合物。
5.二次抗体处理：一次抗体只能与抗原结合，无法提供光学信号。
因此需要加入与一次抗体结合的二次抗体，该二次抗体与荧光物质或酶偶联，可以提供可视化信号。
常见的二次抗体有HRP（辣根过氧化物酶）、荧光染料等。
6.显色：通过加入合适的显色底物，可以使得与二次抗体结合的酶产生可见的颜色反应。
常用的显色底物有DAB（3,3'-二氨基联苯），其在酶的作用下会产生棕色的显色产物。
7.镜检：最后一步是使用光学显微镜对样本进行观察和分析。
通过镜检可以确定抗原存在的位置和分布情况，并对结果进行定量分析。
总结：免疫组化是一种确定蛋白质存在和分布的重要实验技术。
通过以上步骤的顺序操作，可以获得可靠的结果。
实验人员需要熟悉每个步骤的操作方法，并根据实验样本的要求进行调整和优化，以获得准确和可重复的结果。
免疫组化实验方法
免疫组化实验方法免疫组化（Immunohistochemistry，简称IHC）是一种利用特异性抗体与组织或细胞特定抗原结合的方法，以此可以检测细胞或组织中蛋白质的表达和分布情况。
IHC技术已广泛应用于病理学、癌症诊断、生物医学研究等领域。
以下是免疫组化实验的常用方法：1.样本处理：通常以石蜡包埋切片作为实验样本。
首先，从固定的组织或细胞中取得标本，然后进行脱水、透明化和浸蜡等处理。
接下来，使用切片机将组织或细胞切割成厚度为3-5μm的切片。
2.抗原恢复：由于样本的固定和包埋可能导致抗原的损伤，因此需要对切片进行抗原恢复处理。
常见的抗原恢复方法包括热处理、酶解法和酸性水解法。
热处理是将切片置于缓冲液中，在高温下进行退火。
酶解法是使用胰蛋白酶等酶对切片进行消化。
酸性水解法则使用盐酸或酶进行酸性处理。
3.抗体结合：选择特异性的一抗体与目标抗原结合。
一抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，可以经商业采购或自家制备。
将一抗体加入待检测切片上，让其与目标抗原结合。
4. 第二抗体结合：待检测切片上结合了一抗体的抗原后，需要添加第二抗体与一抗体结合。
第二抗体通常是反相应物免疫球蛋白（Secondary Antibody），如反人IgG，反兔IgG等。
第二抗体上常会标记有发光物质、酶标记物或荧光染料，用于可视化结果。
5.可视化和显色：根据选择的第二抗体，可以选择显色方法。
例如，辣根过氧化物酶（HRP）结合的第二抗体可以使用3,3'-二氨基联苯思（DAB）作为底物，呈棕色或棕黄色；荧光标记的第二抗体可以用荧光显微镜进行观察。
6.伪染色：为了辅助观察和识别目标组织或细胞，可以进行伪染色。
常见的伪染色方法有对比染色、核染色和细胞质染色等。
7.阴性对照和阳性对照：为了确保实验结果的准确性和可靠性，同时进行阴性对照和阳性对照实验。
阴性对照是在实验中将第一抗体替换为非特异性抗体或缺少抗体的处理组织或细胞组织；阳性对照是在实验中使用已知表达目标蛋白的组织或细胞进行处理。
免疫组化实验原理及其步骤
免疫组化实验原理及其步骤大家好，今天咱们聊聊免疫组化实验，这是一个听起来有点高大上的实验，但实际上，它可以用简单的话来解释清楚。
免疫组化实验，简单来说，就是通过抗原抗体反应来识别细胞或组织中的特定蛋白质。
听上去是不是有点神秘？别担心，我们一步步来解开这个谜团。
1. 什么是免疫组化实验免疫组化实验其实就是一种用来观察细胞或组织中特定蛋白质的技术。
想象一下，你在大海里找宝藏，免疫组化实验就像是你用来找宝藏的那把神奇的探测器。
它能帮助我们在复杂的组织中找到目标蛋白，就像在沙滩上找到了隐藏的珍珠一样。
这个过程可以分为几个关键步骤，每一步都至关重要。
2. 实验步骤2.1 准备工作首先，你得准备好样本。
无论是组织切片还是细胞涂片，都要处理得当。
就像是做菜前，你得把所有的食材都准备齐全一样。
样本处理得当，才能保证接下来的实验顺利进行。
2.2 固定和切片接下来是固定。
固定的目的是让样本中的蛋白质不变形，保持原有的状态。
这一步就像是给样本穿上保护衣，确保它们在实验过程中不会跑偏。
然后，将样本切成非常薄的片，这样才能方便后续的操作。
这就像是做蛋糕时，你要把蛋糕切成薄片，好让每一片都能均匀上色。
2.3 阻断非特异性结合在这一步，咱们需要阻断样本上那些可能干扰实验的东西。
这就好比你在派对上，得先处理好背景噪音，才能好好享受音乐。
这里用一些阻断液体，确保后续的抗体只会和目标蛋白结合，不会出现误会。
2.4 加入抗体这是整个实验的核心部分。
我们要用到的抗体，就像是侦探寻找线索。
首先加入一抗，这是一种能特异性识别目标蛋白的抗体。
然后加入二抗，这个二抗就像是给目标蛋白贴上了一个显眼的标签，能帮助我们看到它。
二抗一般会和一种显色剂结合，这样我们就能通过显微镜看到目标蛋白的存在了。
2.5 显色和观察最后，我们要显色。
显色的过程就像是把照片上的黑白图案变成彩色，让一切都变得清晰可见。
通过显微镜观察样本，看看那些我们感兴趣的蛋白质在哪里，就像在寻找隐藏的宝藏一样。
生物显微技术：有关于免疫细胞化学和免疫组织化学
• 切片必须保持切片刀锐利，切片要薄而平整、无皱摺、无刀 痕，如有上述问题的切片在进行免疫组化染色都将出现假阳 性现象，切片厚度一般为3~4μm，切好的切片在60℃温箱中 过夜，注意烤片的温度不宜过高，否则易使组织细胞结构破 坏，而产生抗原标记定位弥漫现象。
• （三）切片
• 组织得到很好处理后在进行切片之前还应对玻璃片 进行处理，由于我们检测抗原是多种多样的，因染 色操作程序复杂，时间较长，有些抗原要进行各种 抗原修复处理，如微波、高压、水溶酶等，玻片如 果得不到很好的处理，将易造成脱片，为保证免疫 组化实验的正常进行，要求在贴片前对载玻片作适 当处理，必须在清洗干净的玻片上进行粘合剂的处 理以防脱片。
第四章 免疫细胞化学和免疫组织化学
第一节 免疫组织化学概述
• 应用免疫学及组织化学原理，对细胞标本或 组织切片中的某些化学成分进行原位的定性、 定位或定量研究，这种技术称为免疫细胞化 学技术(immunocytochemistry)或免疫组织化 学技术(immunohistochemistry) 。
• 现实市场销售的一抗多为即用型，对抗体的滴度无 须摸索，但对于浓缩型一抗，则应摸索出最佳的工 作滴度。
• 灵敏度高而极易控制背景的检测系统试剂盒是最为 理想也是免疫组化染色优劣的关键，根据免疫组化 技术发展至今第三代SP试剂盒更优于其它试剂盒 (ABC、PAP等)。
• 但应注意检测系统应与一抗来源相匹配，否则检不 出目的物。
• 对于固定液的选择，原则上讲，应根据抗原的耐受 性来选择相应的固定液，但很难做到这一点，10%的 中性缓冲福尔马林或4%缓冲多聚甲醛4倍于组织体积 进行组织固定，但组织固定时间最好在l2h内，一般 固定时间不应超过24h。
免疫组化详细步骤
免疫组化步骤取组织、固定、制片(脱水、透明、浸蜡、包埋）、切片、烤片、抗原修复、滴加抗体一、取组织二、固定三、制片1、脱水透明的酒精梯度和时间70％酒精20min 80%酒精1h90%酒精1h 95％酒精Ⅰ2h95％酒精Ⅱ2h 无水乙醇Ⅰ15min无水乙醇Ⅱ15min 无水乙醇Ⅲ15min二甲苯酒精1：1 15min 二甲苯Ⅰ25min二甲苯Ⅱ25min 二甲苯Ⅲ15min2、浸蜡:石蜡融化后，在石蜡Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各浸蜡1h3、包埋四、切片烤片用切片机切片，取完整组织切片放于37℃温水中展片，取完整组织于载玻片上，并放入到60℃的烤箱中烤6个小时五、脱蜡至水六、抗原修复配置柠檬酸抗原修复液于微波中煮沸，在高压锅内放入自来水煮沸(不盖锅盖），将装有煮沸的抗原修复液的烧杯置于高压锅内，将水化后的玻片放入煮沸的抗原修复液中，盖上锅盖，待其压力达到最大时维持三分钟七、取出玻片，水浴逐渐降温直至完全冷却八、将玻片放置于塑料板上，滴加3％的过氧化氢室温孵育10min，以阻断内源性过氧化氢酶，10min过后PBS冲洗2次×3分钟九、除去PBS（甩干或者吸水纸吸干），每张切片滴加第一抗体（稀释相应倍数），4℃过夜十、PBS冲洗3次×2分钟，除去PBS液,每张切片滴加聚合物增强剂，室温孵育10min十一、PBS冲洗2分钟×3次，除去PBS，每张切片滴加酶标抗兔聚合物，室温孵育10min十二、PBS冲洗2分钟×3次，除去PBS，每张切片滴加新配制的DAB（二氨基联苯胺)，室温孵育2～10分钟，显微镜观察十三、苏木精复染:苏木精复染5min，水洗3min，0。
1%HCl浸提两次,水洗3min，反蓝液数秒，水洗十四、脱水透明：70％酒精3min、80％酒精3min、90％酒精3min、无水乙醇3min、二甲苯Ⅰ3min、二甲苯Ⅱ3min十五、封片。
免疫组化
抗原修复
热处理后应注意自然冷却（至少半小时）； 热处理液不要让其煮干； 不要任何抗原的检测都使用该方法； 同一批抗原的检测其温度和时间一定保持一致。
实验步骤
二甲苯 梯度酒 精
石蜡切片
脱蜡、水化
ddH2O或PBS洗 抗原修复
冰冻切片
37度烤片
预 处 理
3%H2O2孵育原修复
抗原修复(Antigen Retrieval，AR)是以高温、高压对常规 固定的石蜡切片进行抗原修复或复原的一种非蛋白酶消 化，以提高抗原抗体阳性检测的一种方法和技术手段。
修复介质： ①0.01M pH6.0柠檬酸盐缓冲液(CB)；②
EDTA pH9.0。
修复方式：①微波96℃±10min×2；②直接加温100℃， 15min；③水浴锅100℃，10/20min；④高压锅/消毒锅 120℃，3min；⑤真空加热10min；⑥直接烤片法。
孵育一抗 即 用 型 二 步 法 孵二抗试剂1 37度20分钟 孵二抗试剂2 37度30分钟 梯度酒精 二甲苯 DAB显色 复染 脱水、透明 封片 血清封闭（试剂A）室温2 h 孵一抗 孵生物素偶联二抗 （试剂B）室温2 h 孵ABC液（试剂C） 37度40分钟 ABC
放 大 法
去除内源性过氧化物酶
色结果是不可信的。
抗原表达必须在特定部位。如人白细胞共同抗原
LCA和上皮膜抗原EMA应定位在细胞膜上；肌酸激
酶 CK应定位在细胞浆内；PCNA 及p53 蛋白应定位
在细胞核内，等等。不在抗原所在部位的阳性着色， 一概不能视为阳性。
尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞
的阳性表达，特别是酶免疫标记。因为这类阳性
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免疫组织化学
免疫细胞化学又称免疫组织化学、其主要原 理是用标记的抗体（或抗原）对细胞或组织 内的相应抗原（或抗体）进行定性、定位或 定量检测，经过组织化学的呈色反应之后， 用显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察。
免疫细化学的基本理论
抗原抗体反应 标记化学反应 显色化学反应
免疫酶细胞化学
预先将抗体与酶连结，再使其与组织内特异 抗原反应，经细胞化学染色后，于光镜或电 子显微镜下观察分析的形态学研究方法。
酶的种类
辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase , HRP）
碱性磷酸酶（Alkaline phasphotase, ALP） 葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase, GOD）
桥抗生物素—生物素技术（Bridged Avidin –Biotin technique, 简称BRAB技术）
一抗：生物素标记的特异性抗体 二抗：卵白素 三抗：生物素标记的酶
操作步骤
固定： 生物素标记的第一抗体，室温孵育15min。 PBS洗5min，更换3次。 第二抗体卵白素，孵育15min。 PBS洗5min，更换3次。 生物素标记的酶孵育作用15min 。 PBS洗 5min，更换3次。 显色。 复染封片、观察。
阴性对照
没有信号出现的检测结果。当待检标本呈阳性结果 时，阴性对照就更加重要，用以排除假阳性。 用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果； 用没有交叉反应的抗体代替特异性抗体进行实验。 用特异性抗体的抗血清与特异性抗体与切片共同孵 育；
免疫细胞化学结果的判断
判断特异性染色和非特异性染色。 要准确判断阳性和阴性，排除假阳性和假阴 性结果，必须严格对照实验。 重复
抗体制备
酶标抗体 酶标抗体技术是通过共价键将酶连结在抗体 上，制成酶标抗体。再借酶对底物的特异 化作用显色。 非标记抗体酶法
酶桥法
抗过氧化物酶法（ PAP ）
PAP法的评价
抗体活性高 灵敏度高：灵敏度是指ICC方法所能发现最 少数量抗原而言。 背景染色低：
亲和免疫细胞化学技术
基本原理 生物素 （Riotin）：是一种小分子的维生素 卵白素（Avidin）：又名亲合素，鸡蛋白中一种碱 性蛋白。 生物素与卵白素之间有很强的亲合力，较之抗体对 抗原的亲合力要高出100万倍，能够彼此牢固结合而 不影响彼此的生物学活性。 生物素与卵白素都具有与其它示踪物质如荧光素、 铁蛋白和过氧化酶等相结合的能力。
免疫组织化学特点
1.高度特异性 2.敏感性高 3．方法步骤统一 4．形态、机能和代谢密切结合
基本技术方法
抗体的制备 组织材料的处理 免疫染色 对照试验 显微镜观察
免疫组织化学分类
根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为: 免疫荧光细胞化学技术 免疫酶细胞化学技术 亲和免疫细胞化学技术 免疫电子显微镜技术
设计对照实验
设计对照实验目的： 证明和肯定阳性结果的特异性，排除非特异 性疑问。主要是针对第一抗体对照。 ①阳性对照； ②阴性对照；
阳性对照
用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行 免疫细胞化学染色，对照切片应呈阳性结果， 称为阳性对照。证明全过程均符合要求，尤 其当待检标本呈阴性结果时，阳性对照尤为 重要。
标记生物素—抗生物素技术（Labelled Avidin—Biotin technique, LAB技术）
一抗：生物素标记的特异性抗体 二抗：酶标记抗生物素
切片在含有25～50μ g/ml生物素标记抗体 （PBS液稀释）中孵育1h，室温。 PBS洗2次，每次5min。 用20～50μ g/ml过氧化物酶标记的抗生物素 液孵育90min，水洗。 酶呈色反应。
酶的要求
1. 2. 3. 4. 5. 6.
酶催化的底物必须是特异、容易观察； 定位效果好； 易获得，最好有商品出售； 酶的催化活性（Turnover）高并且稳定； 酶标过程中，酶与抗体连结，不能影响二者的活性； 背景低：被检测组织中，不应存在与标记酶相同的 内源性酶或类似物质。
基本步骤
组织及切片制备 抗体的制备 切片封闭：血清等 与抗体孵育 加入显色底物显色 复染 观察
抗原抗体反应
抗体是免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig）。 人类免疫球蛋白有五类，即IgG 、IgA、 IgM、 IgD 及IgE。 人体内的五类 Ig之间的区别就在于其各自重 链的氨基酸组成和抗原性不同。用小写希腊 字γ（Gamma）、α(Alpha)、μ(Mu)、 δ(Delta)、ε(Epsilon),分别表示IgG 、IgA、 IgM、IgD 与IgE的两条重链。
抗生物素—生物素染色法
1．抗生物素—生物素—过氧化酶复合物技术 （Avidin Biotin –Peroxidase Complex technique, 简称ABC技术） 2．桥抗生物素—生物素技术（Bridged Avidin –Biotin technique, 简称BRAB技术） 3．标记生物素—抗生物素技术（Labelled Avidin—Biotin technique, LAB技术）
免疫组化检测action蛋白在大鼠卵巢组织中的表达。 请选择抗体组合，设计实验。
人抗大鼠action（同种型IgG ） 大鼠抗人action （同种型IgG ） 兔抗大鼠action （同种型IgG ） 生物素标记的兔抗人IgG 生物素标记的兔抗人IgM 生物素标记的人抗兔IgG 生物素标记的人抗兔IgM 碱性磷酸酶标记的卵白素 碱性磷酸酶标记山羊抗人IgG 辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG
物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础 。
抗原与抗体
植物凝集素和糖类
生物素与抗生物素 葡萄球菌A蛋白与IgG 阳离子与阴离子 激素和受体等
亲和免疫细胞化学技术特点
亲合细胞化学引入免疫细胞化学后使其敏感 性得到进一步提高，因此更有利于微量抗原 （或抗体 ）在细胞或亚细胞水平的定位。
抗生物素—生物素免疫细胞化学染色法