CCK8实验心得
CCK8检测细胞增殖毒性的原理及注意事项
CCK8检测细胞增殖/毒性的原理、方法及注意事项一、CCK8检测细胞增殖/毒性的原理Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。
其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。
生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。
因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
用途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验CCK8的优点：•使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；•CCK-8法能快速检测；•CCK-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度；•CCK-8法的重复性优于MTT 法；•CCK-8法对细胞毒性小；•CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。
CCK8的缺点：•与MTT法相比，CCK8和XTT的价格比较贵。
•CCK8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。
与以往的增殖/毒性测定试剂相比较：二、CCK8检测细胞增殖/毒性的方法实验一：细胞增殖分析1、制备细胞悬液：细胞计数2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做3个重复。
3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。
4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。
或者直接配置含10%CCK8的培养基，以换液的形式加入。
5、培养1-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。
CellCountingKit-8
Cell Counting Kit-8简称CCK-8试剂盒，是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。
WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。
细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。
对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。
WST-8是MTT的一种升级替代产品，和MTT或其它MTT类似产品如XTT、MTS等相比有明显的优点。
首先，MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶解液来溶解；而WST-8和XTT、MTS产生的formazan都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤。
其次，WST-8产生的formazan比XTT和MTS产生的formazan 更易溶解。
再次，WST-8比XTT和MTS更稳定，使实验结果更加稳定。
另外，WST-8和MTT、XTT等相比，线性范围更宽，灵敏度更高。
该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。
总之，CCK-8的原理跟MTT其实是相同的，不同之处在于CCK-8法生成的formazan是水溶性的，不需要再吸出培养液加入有机溶剂溶解这个步骤，因此可以减少一定的误差。
其他优点就是重复性优于MTT；对细胞毒性小；为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。
但是CCK-8比MTT的价格要贵不少，所以一般来说，还是MTT法用的多。
我们课体组是在2004年使用的CCK-8试剂盒，检测原代分离的小鼠T淋巴细胞增殖。
之前也使用过[3H]-TdR和MTT法，但由于原代T细胞的特点：1.细胞为悬浮;2.细胞体积小;3.原代细胞存活和增殖较细胞系困难。
并且实验中涉及功能阻断，所以我用MTT的精确性不够高，多次用[3H]-TdR考虑到安全性不够好。
就改用了CCK-8检测增殖。
CCK8的原理优势及步骤
CCK8的原理优势及步骤CCK8（Cell Counting Kit-8）是一种广泛应用于细胞增殖和细胞毒性测定的分析方法。
它是一种基于细胞线粒体酶活性的颜色反应来评估细胞活力的快速、敏感的比色法。
CCK8的原理、优势及步骤如下所述。
原理：CCK8试剂是一种含有三脱氢琥珀酸（tetrazolium salt）的化学物质。
当CCK8溶液加入到细胞培养基中时，细胞线粒体内的酶（又称细胞色素C氧化酶）会还原CCK8试剂中的四氮唑盐成为橙黄色的水溶性产物。
这个产物的颜色与细胞活力成正比，也就是说，只要细胞活力高，产物就会形成越多，颜色就会越浓。
优势：1.灵敏度高：CCK8可以检测到低至10个活细胞的数量。
由于颜色反应与细胞活力相关，可以测量到各种细胞类型和样品数量。
2.快速：CCK8试剂仅需在培养基中静置4小时，就能完成细胞活力的测定。
3.简单易行：CCK8试剂只需要加入到细胞培养基中，无需任何特殊仪器和技巧，因此非常容易操作。
4.可靠性高：CCK8试剂的反应准确稳定、重复性好，可以得到可靠的结果。
步骤：1.细胞培养：首先需要培养所需的细胞种类，确保细胞以正常的饮食条件和环境条件生长。
2.处理样品：处理样品分为以下步骤：1）将细胞分装到孔板或其他培养器中，保证每个孔的细胞数量和处理条件相同；2）将不同浓度的处理物添加到细胞中，以观察其对细胞活力的影响；3）在一个孔中加入CCK8试剂，使其与细胞反应。
3.测定：CCK8试剂加入细胞培养物后，需要经过一定时间的孵育。
按照试剂说明书的要求，一般为4小时，试剂将与细胞反应后形成可溶性产物。
通过吸光度计以450纳米的波长测量吸光值，用于评估细胞活力。
综上所述，CCK8作为一种基于细胞线粒体酶活性的快速、敏感的比色法，能够准确、快速地测定细胞活力。
其优势在于高灵敏度、快速简单易行、可靠性好。
在临床研究和药物筛选等领域，CCK8已经成为一种重要的工具和方法。
cck8实验原理
cck8实验原理
CCK8实验原理。
CCK8实验原理是一种常用的细胞活力检测方法，通过CCK8试剂可以快速、准确地评估细胞的代谢活力和增殖能力。
CCK8试剂是一种含有黄噬菌素的水溶性试剂，它可以通过细胞还原作用将黄噬菌素还原为橙色的水溶性产物，从而间接反映出细胞的代谢活力。
下面将介绍CCK8实验原理的具体步骤和操作方法。
首先，准备细胞培养基和需要进行实验的细胞，将细胞接种在96孔板中，使得每个孔中都有一定数量的细胞。
然后，根据实验需要添加不同的处理剂，比如药物、激素等。
处理剂的种类和浓度根据具体实验目的而定。
接下来，将CCK8试剂按照说明书中的指引进行稀释，然后向每个孔中加入适量的CCK8试剂。
将96孔板放置在细胞培养箱中培养一定的时间，让细胞与处理剂和CCK8试剂充分作用。
随后，使用酶标仪或者多功能酶标仪等设备，测量吸光度值。
CCK8试剂在细胞还原作用后会产生橙色产物，其吸光度与细胞的代谢活力成正比。
通过测量吸光度值，可以间接反映出细胞的代谢活力和增殖能力。
最后，根据实验数据进行分析和统计，得出相应的结论。
根据不同处理剂的作用，可以比较不同条件下细胞的代谢活力和增殖能力，从而评估处理剂对细胞的影响。
总的来说，CCK8实验原理是一种简便、快速、准确的细胞活力检测方法，适用于各种细胞系和细胞类型。
通过该方法，可以评估细胞的代谢活力和增殖能力，为细胞生物学和药物筛选等领域的研究提供重要的实验数据支持。
cck8法检测细胞活力原理
cck8法检测细胞活力原理宝子们，今天咱们来唠唠这个CCK - 8法检测细胞活力的原理呀。
咱们得先知道细胞活力这事儿可重要啦。
就好比一个小团队里的人是不是都精力充沛，能好好干活一样。
细胞活力强呢，就说明细胞们都状态倍儿棒，在身体里或者在实验室的培养皿里都能很好地发挥自己的功能。
那这个CCK - 8是个啥呢？它呀，就像是一个超级小侦探，专门去探查细胞的活力情况。
CCK - 8试剂其实是一种水溶性的四唑盐。
这个名字听起来是不是有点拗口呀，不过没关系，咱只要知道它很厉害就成。
细胞里面呢，有一种东西叫线粒体。
线粒体可不得了，它就像是细胞的小发动机。
细胞要想正常运转，线粒体得好好工作，产生能量啥的。
当CCK - 8遇到活细胞的时候，它就会和细胞里面的线粒体中的脱氢酶发生反应。
这就像是两个小伙伴一见面就击了个掌，然后开始合作。
这个反应会把CCK - 8变成一种有颜色的产物，叫甲臜。
这个甲臜可神奇啦，它是橙黄色的，就像小太阳一样有颜色。
而且呢，这个颜色的深浅和细胞的活力是有关系的。
如果细胞活力强，那线粒体里的脱氢酶就多呀，和CCK - 8反应产生的甲臜就多，颜色就会更深。
相反，如果细胞活力弱，产生的甲臜就少，颜色就会比较浅。
咱再打个比方哈。
就好比是一群小蜜蜂在采蜜。
活细胞就是那些勤劳的小蜜蜂，CCK - 8是花里面的花蜜。
小蜜蜂越多，采到的花蜜就越多，最后得到的成果就越丰富。
这里呢，小蜜蜂的数量就相当于细胞的活力，采到的花蜜量就相当于产生的甲臜的量。
那我们怎么知道这个颜色的深浅到底代表多少细胞活力呢？这时候就需要用到一个仪器啦，像酶标仪这种。
酶标仪就像是一个超级眼睛，它能准确地看到这个橙黄色有多深。
然后呢，根据这个颜色的深浅，它能算出一个数值。
这个数值就能告诉我们细胞活力的情况啦。
你看，这个CCK - 8法是不是很有趣呢？它就这么巧妙地通过颜色的变化来反映细胞活力。
而且呀，这个方法还很方便呢。
不像有些检测方法，又复杂又麻烦。
CCK8的原理及优势
CCK8的原理及优势CCK8是什么CCK-8的英文全称是Cell Counting Kit-8，也就是进行细胞计数的一个盒子。
那它的用途也就大致可以猜到，和细胞增殖、细胞毒性相关的实验都可以。
CCK8的原理在CCK-8试剂盒中，最主要的化学药品是WST-8，化学名为2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐。
它的核心基团和MTT是一样的，是MTT的升级版本。
在电子耦合试剂（也就是细胞是活的，有呼吸，有能量代谢）存在的情况下，可被NAD+氧化还原成为水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan)。
活细胞越多，产生的Formazan就越多，颜色也会越深。
所以粗略的可以认为生成的甲瓒物的颜色的深浅与活细胞的数量成正比。
为什么是粗略的呢，因为这里没有考虑到细胞代谢水平的高低，有些细胞在药物处理后，可能活细胞数不变，但是代谢率低了以后，细胞呼吸减弱，NAD+产生减少，测出的Formazan也会减少。
CCK8的用途1.细胞增殖测定：细胞增殖实验在很多领域都会用到，比如肿瘤相关、损伤后修复等。
2.药物筛选：在测定一个药物的毒性和安全有效浓度时，经常会用到CCK-8。
3.细胞毒性测定：这个可以和各个处理因素对细胞活性和增殖的影响，比如在UV、低氧或者什么化学物品对细胞的影响上。
4.肿瘤药敏试验：这个是用的比较广的，我见过做肿瘤的团队，买CCK-8都是一整箱，一整箱的买。
5.微生物对细胞的毒性或增殖的实验。
优点：1.酚红和血清对CCK法的检测不会造成干扰；2.细胞毒性非常低，因此加入WST-8显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读数从而找到最佳测定时间。
CCK法的操作步骤（更多内容请见说明书）：实验一：细胞活性检测1、在96孔板中接种细胞悬液（100μL/孔）。
将培养板放在培养箱中预培养（37℃,5% CO2）。
2、向每孔加入10 μL CCK溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。
CCK8实验原理与步骤
CCK8实验原理与步骤CCK-8是一种常见的细胞活力检测方法，常用于评估细胞增殖和细胞毒性等生物学活性。
实验原理：CCK-8试剂是一种黄色噻唑-二苯基甲烷盐的溶液，它能够在有活细胞存在时被细胞内的酶还原成橙色水溶性的产物。
这种产物可以通过光度计测量，从而得到细胞的活力信息。
细胞活力高时，细胞内有较多的酶可以将CCK-8还原成产物，产生较高的吸光度；细胞活力低时，细胞内酶的活性降低，无法完全还原CCK-8，产生较低的吸光度。
实验步骤：1.细胞培养：将待测细胞株接种到含有适宜培养基的培养皿或孔板中，并在恒温、湿润、含有5%CO2的培养箱中孵育。
2.实验前处理：根据实验设计的需要，可进行细胞预处理，如给药、感染等。
预处理时间根据需要确定。
K-8试剂准备：将CCK-8试剂按照用户手册的要求溶解成适合实验设计的浓度。
注：部分实验可能需要调整试剂的浓度，应根据实验要求进行调整。
K-8试剂加样：对不同组的培养皿或孔板分别加入适量的CCK-8试剂，使其与培养基均匀混合。
一般情况下，加入的CCK-8试剂量为培养基总量的10%。
5.孵育CCK-8与细胞的反应：将含有CCK-8试剂的培养皿或孔板放回恒温、湿润、含有5%CO2的培养箱中继续孵育。
孵育时间根据实验需要确定，一般为1-4小时。
6. 吸光度测定：使用酶标仪或光度计测定吸光度（OD）值，一般在450nm波长下测定。
同时，记录对照组（如细胞温育组）的OD值作为参照。
7.数据处理与分析：根据实验设计，采用合适的统计学方法，比较各组的细胞活力差异，并将数据结果进行图表展示。
注意事项：K-8试剂对皮肤、眼睛、呼吸道等有刺激性，请注意安全操作；2.实验前需进行细胞的适宜密度的培养，以保证其在实验过程中的稳定生长状态；3.在实验中注意培养条件的一致性，如温度、湿度、CO2浓度等；4.参照组的选择要慎重，需要与实验对象具有相同的培养条件；5.准备稀释CCK-8试剂时，避免过长时间暴露于光线和空气中，以免降低其效力。
cck8实验原理
cck8实验原理CCK8实验原理。
CCK8实验原理是一种常用的细胞活力检测方法，通过检测细胞的代谢活性来评估细胞的生存状态和增殖能力。
CCK8试剂是一种含有水溶性四唑盐类化合物的检测试剂，其原理是利用细胞还原剂还原CCK8试剂，生成一种具有吸光度的水溶性黄色产物。
这种产物的量与细胞的代谢活性呈正相关，可以通过光密度测定仪器来测定其吸光度，从而间接反映细胞的代谢活性。
CCK8实验原理的操作步骤相对简单，主要包括细胞接种、处理试剂、孵育和测定吸光度等几个步骤。
首先，将细胞悬液均匀接种在96孔板中，然后加入不同浓度的药物处理，孵育一定时间后，加入CCK8试剂，再孵育一段时间后，用酶标仪或微孔板读板器测定吸光度值。
根据吸光度值的变化，可以评估细胞的代谢活性和药物的毒性。
CCK8实验原理的优点之一是操作简便，无需特殊的仪器设备，只需要常规的96孔板和酶标仪即可完成实验。
另外，CCK8试剂对细胞的影响较小，不会对细胞产生毒性，因此可以连续监测细胞的代谢活性。
此外，CCK8试剂的线性范围广，可以适用于各种细胞类型和不同的实验条件，具有较好的通用性。
然而，CCK8实验原理也存在一些局限性，比如在细胞密度较高或者处理时间较长的情况下，可能会出现背景吸光度较高的问题，影响实验结果的准确性。
因此，在进行CCK8实验时，需要根据具体的实验条件和细胞类型进行优化，以获得准确可靠的实验结果。
总的来说，CCK8实验原理是一种简便、快速、可靠的细胞活力检测方法，适用于各种细胞类型和实验条件。
通过对细胞代谢活性的间接测定，可以评估药物的毒性和细胞的增殖能力，为细胞生物学和药理学研究提供了重要的实验手段。
在今后的实验研究中，CCK8实验原理将继续发挥重要作用，为科研工作者提供更多的实验选择和技术支持。
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CCK8的说明书大家一定要认真阅读，里面很多细节的问题都有提到。
而且说明书里提供的一些关于各种细胞的种板数都很有参考价值，因为那是反复验证过的最佳数值。
但无论如何，做这个试验一定要摸条件。
你就算再懒，这个懒不得，否则你都只是在做无用功。
以下言论全部以细胞毒性试验为前提，如果你做的是促进细胞生长的药物的药效实验那就另当别论了。
摸条件包括1、种板数；2、种板后细胞的贴壁生长时间；3、加药后的孵育时间；4、cck8试剂加入量；5、cck8试剂加入后细胞孵育时间。
看起来很多，其实这就是一个实验。
而且都是种的空白板，也就是不加药物，只加细胞和CCK8。
1、种板数：这个要查文献，看你所用细胞别人有无做过，把范围大致找出。
记住还要参考说明书，这个很重要。
然后稀释一系列浓度种板。
首先你要观察多长时间细胞可贴壁完全，一般贴壁生长24小时。
然后还有在你的实验时间内，不同细胞数下孔内生长情况。
比如我拟定考察4天的时间，那么在4天内，细胞是刚好铺满还是堆积生长？因为每块板都会设置对照孔，也就是含有细胞的培养基+CCK8，这个数值是板上的最大数值，CCK8试验最佳OD值在1.0附近，所以这个最大数值最好能控制在1.0左右。
我的实验经验是不要让细胞长满，一旦长满了很难去判断是否堆积生长了，对药物能否顺利进入细胞有影响此为其一，其二生长不均匀易导致孔间OD值数据偏差大，而且OD值也很大。
2、贴壁生长的时间我一般就直接让它贴壁长24h了，这个时间细胞已经贴壁完全，而且这样设置时间对自己安排实验时间也方便。
没人愿意大半夜爬起来做实验吧。
3、加药后的孵育时间，我的实验摸了3个时间，24h，48h，72h。
然后根据数据的稳定性（RSD）、OD值的范围（1.0左右）这些来选择最好的时间。
太长了就没有必要了，细胞呆在孔里几天不换液结果可想而知了。
4、CCK8试剂加入量，说明书中明确写出建议加入量为培养基体积的10%。
这里有一个问题：假设我要孔内是200微升的体系，即细胞悬液+药液+CCK8=200微升呢，还是细胞悬液+药液=200微升，cck8不算在体系内呢。
关于这一点文献报道不一致。
本人最终采用的是后者。
5、cck8试剂加入后孵育时间，随着时间的增加，OD值就会增大。
总之原则就是把OD值控制在1.0左右。
这里我考察了0.5h、1.0h、2.0h。
再说一下关于种板设置问题。
众所周知周围一圈孔因为边缘效应都是不用来做实验的。
一般每组样品我会设置6个复孔，得到的OD值去掉最大值与最小值，其余取平均值。
我用的是排枪，会省很多力气，但是也会增大组内误差。
这个只有通过校正移液枪和选用最适枪头了。
做这个实验我想大家遇到的最大问题应该是数据不稳定，组内数据偏差大。
讲了很多怎样摸条件，其实就一个原则，把OD值控制在1.0左右。
数据不稳定也只能通过增大样品数，借助数据处理来弥补。
还有实验操作一定要仔细小心，尽量平行操作。
能力有限，表达不清的大家凑合着看看吧。
有疑问的欢迎大家留言讨论，我们的目标是共同进步，哈哈。
补充：谢谢大家的热烈讨论。
突然想起用酶标仪检测的时候还有一些细节问题，园子里也有前辈提过。
比如孔里不能有气泡，如果有气泡，就用吸耳球吹掉，气泡会很影响检测结果。
样品板要擦拭干净，当然了，盖子一定要记得拿掉啊Big Smile补充说明：这几天有同学提出了一个问题，这个问题非常好也非常关键：将OD值控制在1.0这个说法是否有依据？
这里我还是想提醒大家一定要认真阅读试剂盒的说明书，试想一个试剂盒的上市并且作为技术手段得到认可需要经过多少试验反复验证。
我购买的是同仁化学研究所的CCK8试剂盒，说明书的P7Q23：OD值在什么范围比较合适？答：一般情况下OD值在0.1-2.0都可以，在1.0附近比较好。
再说到自己的实验设计，酶标仪的原理其实和紫外分光光度计是一样的，所以UV上很多减小误差的注意事项在酶标仪上同样受用。
这就能够理解为什么不能有气泡，为什么要擦拭干净样品板了。
再者熟悉UV原理的同学会了解利用紫外检测有一个最佳检测范围，超过了这个范围，数值就会呈现出不稳定，无规律。
（大家可以把自己的数据统计分析看看是不是数值控制在1.0附近更稳定。
）而更有甚者就是超出了仪器的检测范围，仪器读数为—。
我在摸条件的时候，cck8加入2.0h后检测就出现过酶标仪读不出数据的情况。