九、染色体工程

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2. 缺点
准确的处理时间； 诱导率、成活率及孵化率的提高； 准确可靠的倍性鉴定方法的确定。
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第二节
雌、雄核发育
一．人工诱导雌核发育的方法 二．雌核发育的鉴别 三．雌核发育的意义 四．人工诱导雄核发育
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雌核发育（gynogenesis）是单性生殖的一种，指卵子依靠 雌核发育 自己的细胞核发育成个体的生殖行为。同种或异种精子进 入卵内只起刺激卵子发育的作用，不形成雄性原核和提供 遗传物质，其子代的遗传物质完全来自雌核，只具有母本 的性状。 自然界中一些无脊椎动物和鱼类等存在。 自然界中 人工诱导雌核发育是指用经过紫外线、X射线或γ射线等处 人工诱导 理后的失活精子来“受精”，再在适当时间施以冷、热、 高压等物理处理，以抑制第二极体的排出，使卵子发育为 正常的二倍体动物。
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染色体计数： 染色体计数：是鉴定多倍性倍性的一种最为准确、 直接方法，但缺点是费时； DNA含量测定：流式细胞仪。是较为先进常用的方 含量测定： 含量测定 法，其测定快速准确，并能测出嵌合体，但需要特 殊的仪器设备。 采用何种方法均有利有弊 有利有弊，进行鉴定主要依赖于所 有利有弊 测样本的发育时期、实验要求和所具备的仪器设备 条件。
用化学药剂和（如秋水仙素 秋水仙素）阻断供体细胞的有 秋水仙素 丝分裂，使染色体停滞在有丝分裂中期，从而在染色 体周围逐渐形成核膜而成为众多的微核。然后在细胞 细胞 松弛素B的作用下使微核逐渐突出细胞膜外。最后经 松弛素 过离心 离心获得含有一个微核、四周有一薄层细胞质和质 离心 膜界限的微细胞。
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一、微细胞介导的基因转移法
微细胞（ 微核体）： ）：是指含有一条或几条染色体， 微细胞（或微核体）： 外有一薄层细胞质和一个完整质膜的核质体。 供体： 供体：微细胞 优点： 优点：简化供体基因的表达、对受体细胞影响小、 微核染色体稳定
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1. 微细胞制备 2. 微细胞融合
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1. 微细胞的制备
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3. 化学方法
有些化学物质也可以用来阻止第二极体的排出或受精卵的 有丝分裂而产生三倍体或四倍体。 细胞松驰素B：能抑制肌动蛋白聚合成微丝，从而抑制细胞 质分裂。 秋水仙碱：可以抑制细胞分裂中纺缍丝的形成，因而抑制 有丝分裂。 其它药物：N2O 、CHCIF2和聚乙二醇等。 缺点：化学药品一般比较昂贵、且具有毒性，影响处理后 的胚胎发育，同时加上化学药物诱导产生的多倍体往往是在 育种上没有价值的镶嵌体，所以化学方法在实际中的应用不 及物理方法。
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二、雌核发育的鉴别
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鉴别雌核发育的个体，通常以颜色 形态 颜色、形态 生化等方面的 颜色 形态以及生化 生化 指标为依据。也可以通过细胞学的研究 细胞学的研究，如若是雌核发育， 细胞学的研究 其囊胚细胞中只出现一套来自雌核的染色体，否则雌核和雄 核染色体各占一半，得到的是杂交种。 用遗传标志 遗传标志的方法来鉴别雄核发育的二倍体化，即由第一次 遗传标志 有丝分裂的阻碍，还是由保留极体而来。假如二倍体源自第 一次有丝分裂的抑制，杂合雌性个体的子代应该都是纯合型； 而如果是通过阻止第二极体的外排产生的雌核发育个体，则 子代的情况取决于着丝点与基因间的距离。在着丝点与基因 距离远离时，将明显增加杂合型子代的比例。
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二、倍性鉴定方法
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1. 间接法：核体积测量、蛋白质电泳、系列 化学分析、形态学检查等； 2. 直接法：染色体计数、DNA含量测定等。
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核体积测量： 核体积测量：二倍体/三倍体核体积之比为1:1.5， 二倍体与四倍体的核体积之比为1:1.74。核体积测 量法省时、简单，在生产现场就能进行而广为人们 采用，但缺乏准确性，亦测不出嵌合体，往往需要 校正； 生化分析： 生化分析：如在关东系银鲫中，三倍体红血球的丙 酮酸激酶的含量含著高于二倍体。
28三、雌核发育的意义 Nhomakorabea29
为生产单性种群 生产单性种群提供了可能。 生产单性种群 能迅速地产生同源型二倍体 同源型二倍体。 同源型二倍体 提供某些致死突变 致死突变种的生物品质。 致死突变 在农牧渔业生产中，可人工控制性别繁殖 人工控制性别繁殖。 人工控制性别繁殖 广泛地用于进行基因 着丝点的定位研究 基因-着丝点的定位研究 基因 着丝点的定位研究。 可利用产生新的纯系来筛选除去有害的等位基因 筛选除去有害的等位基因。 筛选除去有害的等位基因
⑵ 水静压法：采用较高的水静压（65kg/cm2）抑
制第二极体的放出或第一次卵裂来产生多倍体。 优点：诱导率高（一般在90％～100％）、处理 时间短（3～5min），对受精卵损伤小、成活率高。 缺点：需要专门的设备——水压机，成本较高， 其样品室容量有限，处理卵的量有限，所以不适 于大规模生产的。
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一、技术方法
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多倍体是由于细胞内染色体加倍而形成的， 即通过抑制受精卵第二极体的放出产生三倍体， 或抑制第一次卵裂产生四倍体，可以利用生物、 物理和化学的方法得到多倍体。
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1. 生物学方法
生物学上主要通过杂交尤其是种间杂交获得异源多倍体。 Rasch等（1965）年首次证明了三倍体脊椎动物可以通过 杂交产生，他们将雌核发育的二倍体帆鱂（Poecilia formosa）与P.Vittate杂交，得到三倍体后裔。 例如用雌性草鱼（2n＝48）与雄性三角鲂（2n＝48）杂交 可以获得子一代染色体数目为72的草鲂杂种三倍体。 异育银鲫与兴国红鲤杂交获得的复合四倍体，通过细胞方 法证明其产生的原因是受精卵发生了两性融合。 这种不同科、属、种之间的远源杂交，会导致第二极体不 排出，而产生多倍体。
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2. 物理学方法
包括温度激变（温度休克法）、机械创伤、电离辐射、离 心、水静压法和高盐高碱法等。 ⑴ 温度休克法：冷休克法（0～5℃）和热休克法（30℃）。 定义：用略高于或略低于致死温度的冷或热休克来诱导三 倍体或四倍体的方法。 关键：能否成功地阻止第二次成熟分裂或第二极体的排出。 要达到这一点，必须考虑温度处理的开始时间（TA）、处理 持续时间（D）和处理温度（T）这三个因素。 目前对鱼类使用温度休克法诱导三倍体的工作报道较多。 一般来说，冷水性鱼类如鲑科种类应用热休克法好，而温水 性鱼类用冷休克效果较好。 优点：廉价、易操作，是诱导动物细胞多倍体化的常用手 段，也有利于大规模生产使用。 10
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四、人工诱导雄核发育
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雄核发育（ 雄核发育 androgenesis）是指因经过紫外线、X射线或γ射
线处理的卵子与正常的精子受精，再在适当时间施以冷、热 或高压等物理处理，使进入卵子内的精子染色体加倍，而发 育为完全为父本性状的二倍体。 雄核发育的个体的生存率非常低 生存率非常低，这是由于精子基因型的纯 生存率非常低 合性、卵子由于照射的损伤和阻止第一次卵裂处理的损伤等 原因造成的。 但是仍旧在遗传学基础理论和育种中都有一定的价值 有一定的价值，利用 有一定的价值 雄核生殖的精子可用于冷冻基因库，保存种质资源，对基因 世代克隆系的建立，不同种间核质的杂种的产生和YY雄性 引起的性别控制等也有特殊的意义。
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2. 雌核染色体数目减少的阻止
阻止第一次有丝分裂或第二极体的外排； 利用温度、压力或化学方法，如冷休克、热 休克、流体静水压、细胞松驰素B、聚乙二醇 处理等。
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首先将两个不同品系的近交系进 行杂交。 交配后，在精核与卵核尚未融合 之前，从母鼠子宫内冲取受精卵， 并用极细的吸管将精核去掉。 在细胞松驰素B的处理下使雌核 加倍，形成二倍体细胞。 二倍体细胞在体外培养到囊胚期 后，移植到养母的子宫内，使胚胎 继续发育，直至出生。
2. 微细胞的融合
制备的微细胞只能存活几个小时，但经融合可使 其成为能够存活的整体细胞。 常采用PEG作为细胞融合剂。 最好选用带有营养缺陷标志 营养缺陷标志的受体细胞。 营养缺陷标志 由于微细胞的染色体含有互补的原养型基因，微 细胞与受体细胞形成的杂合细胞即可在特定的选择性 选择性 培养基中生长而被筛选出来。 培养基
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第四节
染色体转移技术
一．微细胞介导的基因转移法 二．染色体介导转移法
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将同特定基因表达有关的染色体或染色体 片段转入受体细胞，使该基因得以表达， 并能在细胞分裂中一代又一代地传递下去。 该技术称为染色体转移（或染色体转导）。
微细胞介导的基因转移法（Microcell mediated gene transfer，MMGT） 染色体介导的基因转移法（Chromosome mediated gene transfer，CMGT）
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一、人工诱导雌核发育的方法
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1.精子遗传物质的失活 1.精子遗传物质的失活
物理方法： 物理方法：采用射线包括γ射线、X射线（效果较 好）和紫外线（效果较差）等处理精子使精子的遗 传物质失活。 化学方法： 化学方法：采用化学物质如甲苯胺蓝、乙烯尿素 和二甲基硫酸等消除精子染色体遗传活性的方法。 显微手术法： 显微手术法：采用显微操作的方法直接去除受精 卵中雄性原核的方法。
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三、优点与缺点
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1. 优点
多倍体育种技术方法简单、见效快，具有潜在的理论和应用 价值。 许多诱导的多倍体动物如两栖类、鱼类、贝类等都具有良好 的生存力和生长率。 种间杂种生长快，可以同时具有两个不同的种的优良特性。 利用三倍体不育的特性，将生殖腺发育消耗的能量用于动物 生长，可以避免因繁殖季节及肉质下降而延误上市时间或影 响商品价值，缩短了养殖周期，减少了养殖成本，这在鲍鱼、 昆虫等方面已有应用。 某些多倍体动物肉质量、含氧量、抗病性等经济性状较二倍 体好。
第九章 染色体工程
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什么是染色体工程？ 什么是染色体工程？
染色体工程（chromosome engineering）： 是人们按照一定的设计，有计划地消减、添加 或代换同种或异种染色体，从而达到定向改变遗 传特性和选育新品种的一种技术。广义上讲它还 应包括染色体内部的部分遗传操作技术，因此也 称为染色体操作。