培养基及培养条件对Pycnoporussp_SYBC_L1分泌漆酶的影响
培养基的影响及其控制
二、自然选育
1．自然选育的概念：
不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称 为自然选育。
2. 正变菌株： 由于微生物可以发生自发突变，所以菌种在群体培养过程
中会产生变异个体。变异个体生长良好，生产水平提高，对生 产有利，这类菌株称为正变菌株； 负变菌株：
变异个体生产能力下降，形态出现异型，生产水平下降，导 致菌种退化，这类菌株称为负变菌株。
第七章 发酵工程制药
第七章 发酵工程制药
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节 第八节 第九节 第十节
概述 优良菌种的选育 发酵的基本过程 发酵方式 发酵工艺控制 发酵产物的提取 发酵设备 基因工程菌生长代谢的特点 基因工程在发酵工程中的应用 发酵工程的发展展望
第一节 概 述
一、发酵工程 二、发酵工程发展的4个阶段 三、发酵工程的研究内容
四、产物提取
发酵完成后得到的发酵液是一种混合物，其中除了含有表达的目的产 物外，还有残余的培养基、微生物代谢产生的各种杂质和微生物的菌体等。
提取过程包括以下三个方面： ①发酵液的预处理和过滤。 ②提取。 ③精制。
第四节 发酵的方式
在制备大量微生物菌体或其代谢产物时，可采用不同的发酵方式。 微生物的发酵方式可分为分批发酵、补料分批发酵和连续发酵。
二、发酵工程发展的4个阶段
第一阶段：
20世纪以前时期，人类利用传统的微生物发酵过程来生产葡萄 酒、酒、醋、酱、奶酪等食品。
巴斯德关于发酵作用的研究，从 1857年到1876年前后持续了近 20 年 。 巴 斯 德 以 自 己 研 究 实 践 的 科 学 结 论 说 服程都是微生物作用的结果。 发 酵是没有空气的生命过程。微生物是引起化学变化的作用者”。
漆酶高产菌株的筛选实验方案
漆酶高产菌株的筛选实验方案漆酶是一种能够分解木质素的酶，被广泛应用于漆酶工业生产中。
为了获得高产漆酶的菌株，可以采用以下筛选实验方案。
首先，准备木材素作为酶的底物。
木材素是漆酶的天然底物，因此使用木材素可以更好地模拟真实环境，提高筛选的准确性。
接下来，采集不同环境中的泥土样品。
漆酶产生菌株存在于自然环境中的泥土中，因此从不同环境中采集泥土样品能够获得更多潜在的高产漆酶菌株。
然后，制备泥土微生物的培养基。
泥土样品中的微生物需要合适的培养基进行生长，通常可以使用Czapek-Dox培养基作为基础培养基，并根据实际情况进行优化。
随后，进行菌株的分离与纯化。
将采集的泥土样品进行稀释，并分别洒在含有木材素的琼脂板上。
通过观察是否存在环带或透明圈，从木材素周围分离出对木材素具有降解能力的菌株。
然后将菌株进行连续传代，并进行单菌落的分离，最终得到纯化的菌株。
接着，筛选高产漆酶的菌株。
采用固体培养，将纯化的菌株接种到含有木材素的琼脂板上，培养一定时间后，观察琼脂板上是否出现降解区域。
根据降解区域的大小和颜色的深浅，可以初步评估出菌株的木质素降解能力。
然后，选取降解能力较强的菌株进行液体培养。
将选取的菌株接种到含有木材素的液体培养基中，进行摇瓶培养。
培养一定时间后，通过测定液体培养基中木质素的降解率来评估菌株的降解能力。
最后，通过PCR扩增和酶活测定等分子技术手段对菌株进行鉴定与验证。
通过PCR扩增菌株的漆酶基因序列，并与已知的漆酶基因序列进行比对，验证菌株是否真正具有漆酶产生能力。
同时，使用酶活测定方法对菌株中的漆酶酶活进行测定，验证菌株的漆酶活性。
以上是一种对漆酶高产菌株进行筛选的实验方案。
通过以上步骤，可以筛选到具有高降解能力和高酶活的漆酶菌株，为漆酶产业的发展提供有力支持。
漆酶在栽培灵芝全生育期的变化规律及诱导研究
漆酶在栽培灵芝全生育期的变化规律及诱导研究灵芝(Ganoderma lucidum)作为一种重要的药用真菌,具有较强的木质素降解能力。
漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,作为灵芝分泌的胞外酶之一,在灵芝生长发育过程中通过降解环境木质素,为灵芝提供营养成分,促进灵芝的发育及形态的产生。
研究灵芝漆酶的变化规律对灵芝的产量和质量具有重要意义。
目前对灵芝漆酶降解木质素机制的研究很少,漆酶与其编码基因发挥作用的机理不明确,因此本文对已经公布的灵芝漆酶同源基因及推断的氨基酸序列进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR(RT-PCR)对灵芝漆酶基因在灵芝生长的不同时期、不同浓度Cu2+诱导下的表达情况进行研究,以了解漆酶基因在灵芝生长过程中的变化规律,为探索漆酶在灵芝中的表达机制研究提供理论依据。
本文研究内容为以下几个方面:(1)生物信息学分析显示不同漆酶氨基酸序列的组成有所差异,使用Signal4.1Server对12个漆酶同源基因进行信号肽预测发现,所有氨基酸序列N端中都具有信号肽,信号肽氨基酸残基在18-24个aa之间;通过NCBI比对后,所有的漆酶基因都分别具有漆酶特征序列L1-L4,以及3个保守的铜氧化酶结构域,说明推断的氨基酸序列属于MCO的一类,同时LCC1与LCC2、LCC3以及LCC5分别有77%、80%和77%的相似性,而且聚类分析也显示这四个漆酶基因同属于一组。
内含子位置1和2在所有漆酶基因中都存在,可能是最保守的内含子。
在聚类分析中,预测漆酶氨基酸序列的一致性存在差异,分布在47-100%之间。
LCC13与LCC4、LCC7更接近,虽然在内含子位置分组中属于第3组,但也可以认为其属于第A组。
同时LCC8与B组更接近。
对于LCC10和LCC11是内含子数量相对较少的基因,这需要进一步的实验说明其内含子的情况。
(2)利用PDA固体培养基方式培养,采用ABTS法和硫酸—苯酚法分别对7种灵芝属不同菌种的漆酶活性和多糖含量进行测定。
不同金属离子和pH对白腐菌Ganoderma lucidum产漆酶的影响
10 6 V总 △OD 漆酶活力计算公式：漆酶活力 (U / L) ，其中 ε 为 ABTS 吸光系数，为 V酶 △t
36 000 L·(mol·cm) -1， V 总代表漆酶酶活测定反应体系的总体积， V 酶代表反应添加的酶液体积， △OD 表示反应时间内吸光值的变化量，△t 表示反应时间． 1.5 金属离子对产酶的影响 在发酵培养基中加入①0.06%的不同金属离子（Zn2+，Cu2+，Mn2+，Mg2+和 Fe2+） ，摇床培养 5 d 测其酶活． 1.6 金属离子浓度对产酶的影响 在发酵培养基中依次加入 0、0.01%、0.02%、0.04%、0.06%和 0.1%的金属离子（Zn2+、Cu2+、 Mn2+和 Fe2+） ，摇床培养 5 d 测其酶活．添加 Mg2+时浓度分别为为 0、0.025%、0.05%、0.075%、 0.1%和 0.125%． 1.7 pH 对产酶的影响 将灭菌后的发酵培养液 pH 依次调节到 4、4.5、5、5.5、6、6.5、7 和 7.5，摇床培养 5 d 测其 酶活．
第 36 卷第 2 期 Vol 36, No 2
温 州 大 学 学 报·自 然 科 学 版
Journal of Wenzhou University · Natural Sciences
2015 年 5 月 May, 2015
不同金属离子和 pH 对白腐菌 Ganoderma lucidum 产漆酶的影响
DOI：10.3875/j.issn.1674-3563.2015.02.009
漆酶 （Laccase） 是一种结合 4 个铜离子的多酚氧化酶， 其中 Cu2+与酶以配位体的形式结合． 在 催化反应过程中， 氧分子被还原为水， 而漆酶从氧化底物分子中提取一个电子， 使之形成自由基， 该自由基不稳定， 可自身结合或者相互偶联， 形成聚合物或偶联物， 此过程中不产生其他物质[1]． 漆 酶可与多酚、木质素、甾体等多种底物发生反应[2]，故在木质素降解、生物制浆与漂白、染料的 脱色、生物监测等方面有着广泛的应用[3-4]．漆酶主要分布于真菌、高等植物，在众多生产漆酶的 生物体中，白腐菌 Ganoderma lucidum 是最主要的生产者[1]． 目前，由于生产效率不高等原因，漆酶还未实现工业化大规模生产，如何提高漆酶产量与活 力等问题尚在探索中．许多研究发现[5-7]金属离子和 pH 对微生物产酶有重要影响，本研究以白腐 菌 Ganoderma lucidum WZ-32 为生产菌，通过改变金属离子浓度和 pH 来探究其对产酶的影响， 以期优化 G. lucidum WZ-32 生产漆酶的培养条件，为漆酶的大规模工业化生产提供依据．
白腐菌分泌漆酶的培养条件研究
１ ３ ２ 粗酶 液 的制备 ．． 培养 液经 ６层纱 布 过 滤 ， ００ ０ｒ・ ｎ １ 冻离 １ ０ ｍｉ－ 冷 心， 上清 液 即为粗酶 液 。
１ ３ ３ 漆酶 活力 的测定 ．．
２ ℃ 下 ， ＡＢＴＳ（ 一 ４ ０ ｎ ， ５ 以 ２ ｍ ｅ一 ３ ０ ０ Ｌ ・ ６ ０
２ ２－ 氮一 （ － ，＇ 连 双 ３乙基 并 噻一一 酸 ） ＡＢ Ｓ 、 ，一 ６磺 （ Ｔ ） ２ ５
二 甲代苯 胺 （ ＹＬ） Ｓｇ Ｘ ， ｉｍａ公 司 ； 它 试 剂 均 为分 析 其
纯。
ｍｏ ・ ｍ ） ｌ ｃ 为底 物 。在 ２ ９ ｐ 值 为 ３的 ０ １ ． ６ｍＬ Ｈ ． ｍｏ ・ Ｋ Ｏ 一 柠檬 酸缓 冲溶 液 中加 入 ２ Ｌ ｌＬ ２ ＨＰ ０
Ｔ ｅｎ８ 诱 导剂 的加 入 能 显 著提 高漆 酶 的 分泌 。优 化 的 培 养条 件 为 ： 豆 汁 ２ ， 萄 糖 ２ Ｌ 。蛋 白胨 ４ｇ・ ＿ ， ｗ ｅ 一０和 土 Ｏ 葡 Ｏｇ・ ＿ ， Ｌ。
Ｃ Ｓ ￣ ． ｍｏ ・ ＿ ， Ｈ２ ｏ Ｌ 。Ｍｇ Ｏ ． Ｌ Ｚ ｌ ０ｎ ｕ Ｏ ０ ５ｍ ｌ Ｌ 。 Ｋ Ｐ ４ ｇ・ ＿ ， Ｓ ，１ ５ ３ ｇ・ ． ，ｒ ａ Ｌ Ｍｒ ０ ０ｎｇ・ － ， 舶 ５ ｇ・ － ， ｌ ４ ａ Ｌ 。 维生 素 Ｂ ２０ ｎ Ｓ ５ １ ． ａ ｇ・
Ｉ ２ Ｐ Ａ培 养基 ． Ｄ
泛 存在 于真 菌 、 物 、 植 细菌 中［ 。漆酶 能催 化底物 的 １ ｑ］ 四个单 电子 氧 化 ， 时 伴 随 两 个 氧 分 子 还 原 为 水 ］ 同 。 其 作用底 物非 常广泛 ， 包括 酚及 其衍 生物 、 胺及其 衍 芳 生 物 、 酸及其 衍生 物 、 羧 甾体 激 素 和生 物 色 素 、 属 有 金 机 化合物 等［ 。漆 酶广 泛 应用 于木 质 素 降 解［ 、 物 ５ ］ ６生 ］ 制浆 与 漂 白 ］ 染 料 脱 色［ 。、 酚 废 水 检 测 及 处 、 ９ 。含 理［ ］ 生物传 感［ ¨ 等方 面 。因此 ， 究 高 产 漆 酶 １ 、 卜Ｈ １ 研 的真 菌具 有重要 的现 实意义 。白腐 菌 由于其 分泌漆 酶
漆酶生产工艺的研究与改进
漆酶生产工艺的研究与改进一、引言漆酶是一种分子量较小的酶，具有广泛的应用前景。
其中最具代表性的用途就是在工业生产中作为生物催化剂，提高产物的纯度和收率，降低生产成本。
一直以来，漆酶的生产工艺一直是生物技术研究领域的热点之一，众多科学家和研究机构致力于发掘更高效的漆酶生产工艺。
二、漆酶的生产工艺目前，漆酶生产工艺主要采用微生物发酵法。
常见的产生漆酶的微生物包括铜绿假单胞菌和黄杆菌。
不同的菌株对生产条件的需求不同，需要通过不断优化来提高生产效率。
1. 菌株的选择漆酶的生产效率和菌株的选择有很大的关系。
铜绿假单胞菌和黄杆菌是目前最常被用于漆酶生产的微生物，在这些菌株中，铜绿假单胞菌的产量更高。
此外，国内外还有一些新的细菌被挖掘出来，值得进一步研究其漆酶生产的潜力。
2. 发酵条件的控制生产漆酶的过程中，发酵条件的控制至关重要。
pH值、温度、发酵时间等条件都需要严格控制。
此外，发酵过程中的氧气供应也需要控制在适宜范围内。
目前，通常采用气体补给技术和在线监测技术来保证氧气供应的平衡。
3. 收割和提取技术收割和提取技术也是影响漆酶生产效率的重要因素之一。
通常采用离心法或超滤法来收集菌体，然后使用水解酶或超声波等技术来提取漆酶。
这些方法不仅能提高漆酶的产量，还能改善漆酶的纯度和活性。
三、漆酶生产工艺的改进在不断改进的过程中，科学家们提出了很多新的漆酶生产工艺。
常见的改进方法包括：1. 基因工程改造利用基因工程技术，可以通过改造菌株的代谢途径和调节酶基因的表达来提高漆酶的产量。
研究表明，通过基因工程改造，可以将漆酶的产量提高一到两倍。
2. 大规模化生产技术目前，漆酶的生产工艺已经转移到了大规模化生产阶段。
通过使用发酵罐、气体补给器、离心机和超滤器等设备，可以在短时间内生产出大量的漆酶。
此外，使用自动化控制技术也能够提高漆酶生产效率。
3. 生化反应工程生化反应工程是现代生物技术的重要组成部分。
通过研究发酵条件、酶的稳定性和保护因子等因素，可以实现漆酶的高效生产。
黄多孔菌产漆酶最佳培养条件的优化
Ｍａｄ ｌ 营养 盐 浓 缩液 １ ０ｍＬ Ｍａ ｄｌ 微 量 元 素浓 ｎｅ ｓ ０ ， ｎ ｅ ｓ 缩液 １ｍ ， ｕ Ｏ ５ ２ ， ｏ Ｌ 檬 酸 缓 冲 Ｌ Ｃ Ｓ ・ Ｈ ０ ４ｍｇ １ｍ ｌ 柠 ／
液 ５ （ Ｈ ＝５ ０） ０ ｍＬ ｐ ． 。
０ １ｍ ，５℃ 保 温５ｍｉ， 用 ７ ２ ． Ｌ ２ ｎ利 ２ Ｅ型紫 外 可 见 分 光光 度计 测５ ５ａ ９ ｍ处 的 光 密 度 （ Ｄ值 ） 酶 活 力 以 Ｏ ，
第３ ３卷
第 ２期
纺 织 学 报
Ｊ ｕ ｎ １ｏ ｅ ｔ ｅ Ｒｅ ｅ ｒ ｈ ｏ ｒ ａ ｆＴ ｘｉ ｓ ａｃ ｌ
Ｖ０ ． ３．Ｎｏ ２ １３ ．
２ ２年 ２月 ０１
Ｆ ｂ．。２０１ ｅ ２
文章 编 号 ：２ ３ ９ ２ （０ ２ ０ —０ ３ ０ ０５ —７ １ ２ １ ）２ ０ ６ —５
养基 进行 了优 化 ， 优化 后酶 活提 高达 ２ ５倍 ， 漆 酶 ． 为
的工 业化 生 产提供 了基础 。
１ 实 验 部 分
１ １ 材 料 －
实验 菌 株 ： 多 孔 菌 （ ｏｙｏｕ ｌ ａ ｓ（ ｕ ． 黄 Ｐ ｌ ｒｓｅ ｇ ｎ Ｂ ｌ ） ｐ ｅ １ Ｆ ． ， 源 于 中 国林 业 科 学研 究 院森 林 生 态 环 境 与 ｒ）来
一 一
＿ ＿ ＿ ｉ
一
１
一
样 品与底 物反应５ ｍ ｎ ｉ后光 密 度 的改 变值 表示 ， 以每 分 钟 光 密 度 增 加 ０ ０ １ 为 １ 个 酶 活 力 单 ．０ 位 （ ｍＬ 。 Ｕ／ ）
一
｝
液体 发 酵 培 养 基 ： 铃 薯 ２ ０ ｇ Ｌ 葡 萄 糖 马 ０ ／ ，
漆酶工程菌株的构建及其培养条件的研究
漆酶工程菌株的构建及其培养条件的研究
刘卫晓;钞亚鹏;钱世钧
【期刊名称】《微生物学报》
【年(卷),期】2004(44)5
【摘要】提取产漆酶白腐菌(Fomelignosus)的总RNA,利用RT-PCR的方法克隆到漆酶的cDNA,并将其克隆到表达载体pPIC9k,重组质粒经线性化、电激转化Pichia pastoris GS115、通过底物显色反应筛选到漆酶生产工程菌株.其中2*工程菌株产酶活力较高.培养基、培养温度、诱导用甲醇浓度及培养基中铜离子浓度对该菌产酶活力均有一定的影响.在最适条件下(用含200μmol/L Cu2+的BMMY培养基,于20℃,250r/min;用0.5%甲醇诱导)培养至第6天时,该菌株产酶活力达到最高(1510U/L).
【总页数】4页(P596-599)
【作者】刘卫晓;钞亚鹏;钱世钧
【作者单位】中国科学院微生物研究所,北京,100080;中国科学院微生物研究所,北京,100080;中国科学院微生物研究所,北京,100080
【正文语种】中文
【中图分类】Q3939.9
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第28卷第6期2009年11月食品与生物技术学报Journal of Food Science and BiotechnologyV ol.28 N o.6N ov. 2009文章编号:16731689(2009)06 0832 08 收稿日期:2008 12 31基金项目:长江学者和创新团队发展计划项目(IRT 0532)。
作者简介:王志新(1980 ),女,河北辛集人,发酵工程博士研究生,主要从事白腐真菌漆酶方面的研究。
*通讯作者:廖祥儒(1964 ),男,江西南康人,农学博士,教授,博士生导师,主要从事生物化学和分子生物学方面的研究。
Email:liao xiang ru@培养基及培养条件对Py cnop orus sp SYBC L1分泌漆酶的影响王志新1, 蔡宇杰1, 李颜颜1, 廖祥儒*1, 张峰1, 张大兵2(1.江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122; 2.江苏汉邦科技有限公司,江苏淮安223001)摘 要:从作者所在实验室保存的3株白腐真菌中筛选到一株液态发酵产漆酶的密孔菌P y cnop orus sp.SYBC L1,以漆酶活力为指标,采用正交试验法,优化了P y cnop or us sp.SYBC L1分泌漆酶的培养基:麸皮水煮液60g /L,葡萄糖60g/L,豆粕粉15g/L,CuSO 4 5H 2O 1 0m mol/L;培养条件:初始pH 3 0,装液量50mL/250mL,30 、200r/min 培养13d,漆酶活力达24 95U/mL,为优化前的36 16倍。
关键词:密孔菌SYBC L1;漆酶;发酵;优化中图分类号:TQ 920.6文献标识码:AEffect of Fermentation Mediu m and Conditions on Laccase Productionby Py cnop orus sp.SYBC L1WANG Zhi x in 1, CAI Yu jie 1, LI Yan yan 1,LIAO Xiang ru*1, ZH ANG Feng 1, ZH ANG Da bing2(1.T he K ey L abor ator y of Industrial Biotechno lo gy ,M inistr y of Educatio n,Schoo l o f Biot echnolog y,Jiangnan U niversit y,W uxi 214122,China;2.Jiang su H anbo n Science &T echno lo gy Co.L td,H uai !an 223001,China)Abstract:In this study,the nutritional and environmental conditions o f a laccase pr oduce strain,Py cnop or us sp.SYBC L1,w ere inv estig ated and optimized thoug h sing le facto r exper im ents and orthog onal experiments.The o ptimum co nditions descr ibed as follow s:w heat bran coo king liquor 60g/L,glucose 60g/L,soybean pow der 15g /L and CuSO 4 5H 2O 1 0mm ol/L,pH 3 0,temper ature 30 ,and culture volumn 50m L/250m L,respectively.With tho se optimum co nditions,the laccase activity r eached at 24.95U /m L after 13day s cultur e.Key words:P y cnop or us sp.SYBC L1,laccase,fermentation,optimizatio n漆酶(Laccase, diphenolox idase,EC1 10 3 2)是一种含铜的多酚氧化酶,能够催化多酚、多氨基苯等物质的氧化,使之生成相应的苯醌和水,是一组有广阔应用领域的酶类。
漆酶最早发现于日本漆树中,此后研究发现,漆酶广泛分布于多种植物、真菌以及少数昆虫和细菌中,但在自然界中,主要生产者还是白腐真菌[1]。
漆酶具有特殊的催化性能和广泛的作用底物,因此,在木质素降解、纸浆漂白、染料废水脱色以及环境污染物的降解等领域有着广阔的应用前景,成为环境保护用酶研究的热点[2-4]。
此外,漆酶在食品方面的应用,也越来越多的引起研究者的兴趣。
有研究报道,利用漆酶特异降解木质素的性质,用漆酶的生产菌株处理工农业废弃物,获得了一种功能性食品添加剂∀∀∀膳食纤维[5-6]。
漆酶可广泛应用于啤酒、饮料加工以及焙烤食品中,如可用于提高啤酒和果汁等饮料的稳定性,延长货架期;在面包加工方面,漆酶的使用可以增加面包体积,改善面包结构和柔软性,同时提高面团的机械强度和稳定性;此外,还可以处理食品工业中的废水等。
漆酶的使用可以提高食品生产的质量和产量,但并不明显增加生产成本,也不会产生有毒物质。
可见,漆酶在食品工业中同样存在巨大的应用潜力。
因此,筛选漆酶高产菌株是一项具有现实意义的工作。
白腐菌由于其分泌漆酶的能力强而引起了广泛关注,因此国内外对漆酶的研究主要集中于白腐真菌,如糙皮侧耳(P leur otus ostr eatus)、灵芝(Ganoder ma lucid um)、杂色云芝(Cor iolus ver sico lor)、变色栓菌(T rametes ver sicolor)等都有关于漆酶的报道[7-8]。
作者从实验室现有的特色菌株中筛选出一株具有较好漆酶分泌能力的菌株∀∀∀密孔菌Py cnop orus sp SYBC L1,以Py cnop orus sp SYBE L1为研究对象,着重研究了液态培养对漆酶分泌的影响,以期为今后的研究和工业应用提供一定的理论依据。
1 材料与方法1 1 菌种密孔菌Py cnop or us sp SYBC L1,层孔菌Phellinus sp SYBC L2,丝核菌R hiz octonia sp SYBC M3:作者所在实验室筛选并保藏。
1 2 主要试剂DM P(2,6 Dim ethox yphenol)、藜芦醇(veratryl alcohol)购自Sig ma公司,麸皮和豆粕为市售,其他试剂均为国产分析纯。
1 3 培养基筛选培养基:PDA培养基添加愈创木酚,终浓度为0 5m mo l/L。
种子培养基:PDA培养基,不加琼脂,pH值自然。
产酶基础培养基(g/dL):葡萄糖2,酒石酸铵1, KH2PO40 2,MgSO4 7H2O0 05,CaCl20 0075,微量元素7mL/L,按文献[9]培养基配制。
1 4 漆酶菌株的筛选1 4 1 漆酶产生菌的初筛 取保存的3株菌,分别挑取部分菌丝接种于PDA筛选平板,30培养,观察菌落周围颜色的变化状况,根据菌落周围变色圈大小及颜色深浅进行初筛。
1 42 漆酶产生菌的复筛 种子培养24h,按体积分数2%的接种量接入50mL/250mL产酶基础培养基,分别静置于培养箱或摇床(200r/min)中培养。
1 5 漆酶分泌条件的优化1 5 1 碳氮源对漆酶分泌的影响 分别以不同的碳源和氮源代替产酶基础培养基中的葡萄糖和酒石酸铵,其它条件不变,30培养13d后,测定漆酶活力。
1 52 铜离子浓度对漆酶分泌的影响 在产酶培养基中分别添加不同浓度的CuSO4 5H2O(0~3 5mm ol/L),30培养13d后,测定漆酶活力。
1 5 3 正交试验设计 采用L16(45),以碳源、氮源、铜离子几个主要影响因素做正交试验,优化Py cnop or us sp SYBC L1漆酶分泌的培养基。
1 5 4 发酵条件对漆酶分泌的影响 在优化培养基基础上,分别考察温度(25~35)、培养基初始pH(2 0~6 0)和装液量(25~125mL/250mL)对漆酶分泌的影响。
1 6 酶活测定方法1 6 1 漆酶酶活的测定(Lac) 按文献[10]方法进行,以每分钟氧化1 mo l的DMP生成3,5,3#, 5# 四甲氧基二苯醌(=49 6L/(mm ol cm))所需要的酶量定义为1个酶活力单位(U)。
1 62 锰过氧化物酶活的测定(M nP) 按文献[11]方法稍加改进,一个酶活单位(U)定义为在30条件下每分钟转化1 mo l底物所需的酶量(= 11 59L/(mm ol cm))。
1 6 3 木质素过氧化物酶酶活的测定(LiP) 按文献[12]方法稍加改进,以每分钟氧化1 mol藜芦醇生成藜芦醛所需的酶量定义为1个酶活力单位(U)。
1 7 还原糖质量分数测定采用3,5 二硝基水杨酸比色法[13]。
1 8 生物量测定以菌丝体细胞干重表示[14],发酵液经过离心、833第6期王志新等:培养基及培养条件对P y cnop or us sp SYBC L1分泌漆酶的影响洗涤后收集菌体,置110 烘箱,烘至恒重。
2 结果与讨论2 1 漆酶产生菌的筛选2 1 1 漆酶产生菌的初筛 所选3株白腐菌经愈创木酚平板显色,结果见图1。
P y cnop or us sp SYBC L1和P hellinus sp SYBC L2菌落四周及底部均有红色变色圈产生,而Rhiz octonia spSYBC M 3没有变色,可以初步判断前两株菌在生长过程中分泌了胞外漆酶,使得培养基内漆酶的特征底物被氧化分解,从而产生显色的氧化产物。
2 1 2 漆酶产生菌的复筛 为进一步验证P y cno p or us sp SYBC L1和P hellinus sp SYBC L2两株菌产漆酶的能力,对其进行了复筛培养,采用静置和摇床两种发酵方式培养,产酶情况见表1。
图1 愈创木酚筛选平板图Fig.1 Primary screening picture of guaiacol as indicator表1 培养方式对漆酶分泌的影响Tab.1 Effect of culture mode on laccase production菌株漆酶活力/(U /L )静置培养摇床培养Py cnop or us sp SY BC L 126 81∃2 61617 42∃29 19P hellinus sp SY BC L 2497 54∃19 87∀注:平均数∃S D,n =3由表1可知,这两株菌分泌漆酶的方式是不同的,P y cnop or us sp SYBC L1为好氧菌,摇床培养时漆酶的分泌明显高于静置状态,静置培养时,Py cnop or us sp SYBC L1在培养基表面形成一层菌膜,妨碍了氧气的传递,致使漆酶的产量很低。