11动物细胞培养所需的基本条件
新高考一轮复习人教版动物细胞工程及应用教案
考点2 动物细胞工程及应用1．动物细胞培养(1)地位：动物细胞工程常用的技术手段有动物细胞培养、动物细胞核移植、动物细胞融合等。
其中动物细胞培养是其他动物细胞工程技术的基础。
(2)培养过程(3)培养条件 ①无菌、无毒环境⎩⎪⎨⎪⎧培养液和培养用具进行无菌处理培养过程加抗生素定期更换培养液，清除代谢产物②营养：除糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素之外通常还需加入血清、血浆等一些天然成分。
③适宜的温度：36.5 ℃±0.5 ℃；适宜的pH ：7.2～7.4。
④气体环境⎩⎪⎨⎪⎧ 95%的空气：其中O 2为细胞代谢必需5%的CO 2：维持培养液的pH2．动物体细胞克隆技术(核移植技术)(1)原理：动物细胞核具有全能性。
(2)核移植分类：胚胎细胞核移植和体细胞核移植。
(3)核移植过程(以克隆高产奶牛为例)(4)应用①加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育。
②保护濒危物种。
③生产医用蛋白。
④作为异种移植的供体。
⑤用于组织器官的移植。
3．动物细胞融合和单克隆抗体的制备(1)动物细胞融合①原理：细胞膜的流动性。
②融合方法：聚乙二醇(PEG)、灭活的病毒、电激等。
③意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能，也为制造单克隆抗体开辟了新途径。
(2)单克隆抗体①制备过程②优点：特异性强、灵敏度高，并可以大量制备。
③用途：作为诊断试剂；用于治疗疾病和运载药物。
提醒单克隆抗体制备过程B淋巴细胞要经过免疫过程，即接触抗原，增殖分化为有特异性免疫功能的B淋巴细胞，才能产生相应的抗体，所以，与骨髓瘤细胞融合的B淋巴细胞实际上是浆细胞。
(析图建模)下图为单克隆抗体制备流程(顺序已被打乱)，请据图分析：(1)图中B注射的物质是什么？其目的是什么？(2)在获取C细胞的过程中，筛选淘汰了哪些细胞？(3)C细胞有什么特点？(4)请用箭头把代表各图解的字母按单克隆抗体制备过程的顺序连接起来。
答案(1)注射特定抗原；目的是刺激机体发生免疫应答，从而产生浆细胞(效应B细胞)。
动物细胞大规模培养系统要求和类型
１ ． 使用低ｍ清或无血清培养液。 ．２ ３ 大规模培养细胞的培养
液中 ， 血清用 量大 ， 质量不 易控制 ， 生产成本也高 ， 且使产 品
的后加工增加 了一定 的难度 。为此 ， 可尝试低血清或无血清 培养液。 １ ． 大规模培养对培养的物质要求极 高 ， ．３ ３ 在培养液制备时 必须采用高纯度的水。
模 的进 一 步扩 大 、 化 细 胞 培 养 环 境 、 高 产 品 的产 出 率 与 优 提
１ 培养液要求 ． ３
１ ． 根据 所采用的不 同细胞 株（ ， 用相应 的宜 于细胞 ．１ ３ 系）选
生 长 的 培养 液 。
保证其质量 ， 动物细胞大规模培养技术 已成为各生产企业发 展至关重要的环节 。具有代表性的有机械搅拌式培养系统 、
泌 功能 。
且产物往往需要破碎 细胞释出来 ， 再经浓缩 、 纯化等复 杂工
艺， 而使产品的得 率受到损失。 常规培养动物 细胞的方法是用人工 合成培养液加上一 定 量 的小 牛血 清 ， 细 胞 放 在 不 同 的容 器 中进 行 培 养 ， 微 将 如 孑板 、 Ｌ 培养皿以及 各种培养瓶等。 一船培养容器的体积很小 ，
统， 不能简单的认为是一种机械加工与仪表的结合 。 随着计算 机软硬件技术进展 、 以及传感技术 、 化学工程 的流型研究技术
及 其 他元 器件 等 技术 进 步 Байду номын сангаас 规模 培 养 系统 一 生 物 反应 器 技 大
１ ． 温度控制 ．１ ４
动物细胞培养对温度波动的敏感性很大 。
温度低于 ３ ％ ， ７ 细胞生长缓慢 ， 反之则 细胞 失去存 活力。因 此， 动物细胞培养 比多数微 生物培养对温度控制具有更为严 格的要求 。
动物细胞的培养条件和培养基
• 2、合成培养基：优点是成分明确，组分稳定，可 大量生产供应。动物细胞培养中常用的有BME、 MEM、DMEM、HAM F12、RPMI 1640以及 ISOCOV、199和McCoy等。
• 缺点：无法替代一些未知成分。 • 解决途径合成培养基中添加小牛血清，彼此互补
的胎牛血清。
• 血清的作用机制可能为：（1）提供有利于细胞生 长增殖所需要的各种生长因子和激素；（2）提供 有利于细胞贴壁所需要的贴附因子和伸展因子； （3）提供可识别金属、激素、维生素和脂类的结 合蛋白；（4）提供细胞生长所必须的脂肪酸和微 量元素。
• 3、无血清培养基
• 无血清培养基的优点如下：①提高了细胞培养的可 重复性，避免，避免了由于血清批之间差异的影响； ②减少了由血清带来的病毒、真菌和支原体等微生 物污染的危险；③供应充足、稳定；
动物细胞的培养条件和培养基
• 为了使细胞培养在体外培养成功，需要一些 基本条件：
（1）绝对无菌操作； （2）足够的营养供应，排除有害物质包括极其
微量的离子掺入； （3）适量氧气供应；
（4）随时清除细胞代谢中产生的有害产物； （5）有良好的适于生存外界环境，包括pH、渗透
压和离子浓度等； （6）及时分种，保持合适的细胞密度。
6、空气
二、动物细胞培养基的 种类和组成
• 细胞种系不同对培养基的要求亦有差异，主要 有三类：天然培养基、合成培养基和无血清培 养基。 1、天然培养基：在细胞培养的早期阶段使用的 培养基，主要为来自天然的材料如血浆凝块、 血清、淋巴液、胚胎浸液以及羊水、腹水等。
• 优点：营养价值高 • 缺点：成分复杂、来源有限、成本较高
动物细胞培养及胚胎培养培养基的要求
动物细胞培养时对培养基的要求：培养基按其来源可分为天然培养基和合成培养基。
天然培养基的营养成分与细胞在体内所需条件比较接近，但就细胞在体外生存的环境来说，合成培养液也有其独特之处，譬如成分便于控制和标准化。
体外培养的细胞直接生活于培养基中，无论何种培养基都应该能满足细胞生长所需的营养与生理的基本要求。
(1)营养成分：1）氨基酸合成培养液中的氨基酸以12种必需氨基酸为主，这些氨基酸不能由细胞自身合成，必需由培养液供给。
在氨基酸的成分中谷氨酰胺的作用特别重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，在配制各种培养液中应补加一定量的谷氨酰胺。
2）单糖葡萄糖是最常用和最好的单糖3）维生素维生素在细胞代谢过程中必不可少，主要可以提供辅酶和辅基。
生物素、叶酸、泛酸、核黄素、维生素B12等等4）其他成分：细胞生长过程中除需钠、钾、钙、镁、氮和磷等基本元素外，还需要一些微量元素，如铁、锌、硒、铜、锰、钼等。
此外，为优化细胞生存环境，合成培养基中有时还添加些其他成分，包括核酸降解物、抗氧化剂等。
（2）促生长因子及激素各种激素、生长因子对于促进细胞生长、维持细胞功能、保持细胞的状态具有十分重要的作用。
如胰岛素能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸，泌乳素可促进乳腺上皮细胞生长的作用。
各种生长调节因子的作用更加明显并具有特异性。
（3）pH大多数细胞的适宜pH为7.2-7.4，偏离此范围对细胞将产生有害影响。
造成培养基pH 波动的主要物质是细胞代谢产生的二氧化碳。
解决这一问题可采取两种方法：一是用具有一定缓冲能力的培养基，如使用NaHCO3-CO2缓冲系统，二是采用开放式培养的方法，使细胞代谢产生的二氧化碳及时逸出培养皿。
（4）渗透压细胞必须生活在等渗的环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定的耐受性。
注：天然培养基主要指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。
合成培养基是人工配制的培养基，给细胞提供一个近似体内生存的环境，又便于控制和标准化的体外生存环境，但合成培养基尚未成为十分完全的培养基。
高三生物细胞工程试题答案及解析
高三生物细胞工程试题答案及解析1.单克隆抗体技术在疾病诊断和治疗以及生命科学研究中具有广泛的应用，请回答下列问题：（1）技术是单克隆抗体技术的基础。
（2）单克隆抗体与常规的血清抗体相比，最大的优越性是。
（3）动物细胞融合除了采用植物细胞原生质体融合常用的诱导剂外，还可以采用（生物方法）或（物理方法）（4）选出的杂交瘤细胞既具备骨髓瘤细胞的特点，又具备淋巴细胞的特点。
（5）杂交瘤细胞从培养基中吸收葡萄糖、氨基酸的主要方式是。
【答案】（1）动物细胞培养（2）特异性强灵敏度高（3）聚乙二醇灭活的病毒振动（4）无限增殖分泌特异性抗体（5）主动运输【解析】⑴单克隆抗体技术的基础是动物细胞培养。
⑵单克隆抗体的优点是特异性强、灵敏度高。
⑶诱导植物细胞原生质体融合的诱导剂是聚乙二醇，还可以采用灭活的病毒或者振动、电击等。
⑷杂交瘤细胞的特点是既能无限增殖又能产生特异性抗体。
⑸葡萄糖、氨基酸进入杂交瘤细胞的方式为主动运输。
【考点】本题主要考查单克隆抗体的知识，意在考查考生能理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系，形成知识的网络结构的能力。
2.培育克隆蛙的基本过程如图所示。
下列叙述错误的是A．①过程可以用紫外线破坏细胞核B．若把皮肤细胞换成胚胎细胞则可以提高成功率C．⑤过程需要进行胚胎移植D．上述过程证明了细胞质具有调控细胞核发育的作用【答案】C【解析】紫外线可以破坏细胞的结构，包括破坏细胞核，故A正确；胚胎细胞的全能性高，因此胚胎细胞会比皮肤细胞移植的成功率高，故B正确；蛙是体外发育不需要胚胎移植，故C错误；在此过程中需要有卵细胞提供的细胞质，细胞核才能发育成蛙，说明了细胞质具有调控细胞核发育的作用，故D正确。
【考点】本题考查细胞核移植的有关知识，意在考查考生识记能力和理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系的能力。
3.下列关于细胞工程的叙述，错误的是A．电刺激可诱导植物原生质体融合或动物细胞融合B．去除植物细胞的细胞壁和将动物组织分散成单个细胞均需酶处理C．小鼠骨髓瘤细胞和经抗原免疫小鼠的 B 淋巴细胞融合可制备单克隆抗体D．某种植物甲乙两品种的体细胞杂种与甲乙两品种杂交后代的染色体数目相同【答案】D【解析】电刺激这一物理性刺激可诱导细胞之间的融合，所以A正确；去除植物细胞的细胞壁可以利用纤维素酶和果胶酶处理，而动物组织分散成单个细胞需要通过胰蛋白酶处理，所以B正确；小鼠骨髓瘤细胞和经抗原免疫小鼠的 B 淋巴细胞经过融合处理，再进行筛选，可制备得到单克隆抗体，所以C正确；某种植物甲乙两品种的体细胞杂种，是杂种细胞中染色体数目加倍而甲乙两品种杂交是精子和卵细胞经受精作用形成受精卵再发育成后代的染色体数目与每一品种的体细胞中染色体数目相同，所以D错误。
高三生物一轮总复习人教版选择性必修3长句问答
高中生物选择性必修3第一章发酵工程第1节传统发酵技术的应用1.腐乳、泡菜、果酒、果醋的制作，主要用到了哪些微生物，这些微生物的代谢类型分别是。
酵母菌和醋酸菌在细胞结构方面的主要区别是什么？。
2.腐乳制作原理（反应式）：。
制作腐乳时，让豆腐块长毛的目的是：。
加盐腌制豆腐块的目的是：。
3.泡菜的制作原理（反应式）：。
制作泡菜配制的盐水质量分数为：，浓度太低，则制作泡菜时，盐水为什么煮沸后冷却？蔬菜装坛时，装八层满，原因是：。
在泡菜制作的发酵过程中，为什么要经常向泡菜坛的水槽中补充水？。
腌制时乳酸的含量变化为；亚硝酸盐的含量变化为泡菜腌制过程中，杂菌逐渐减少的原因有。
4.果酒的制作原理（反应式）：。
酵母菌的最适生长温度是，发酵温度是清洗葡萄时，应该先除去枝梗还是先冲洗葡萄？，为什么？将葡萄榨汁装入发酵瓶，为什么要留1/3的空间？发酵过程中，每12小时松开瓶盖1次，原因是：。
松盖排气后及时拧紧瓶盖，目的是：。
酒精发酵旺盛时，其他杂菌一般难以存活，原因是。
为什么在酒精发酵过程中往往“先通气后密封”？。
酒精如何鉴定？。
5.果醋的制作原理（反应式）：。
果酒制作完成后如何做进行果醋的制作？。
果醋制作的温度和气体条件与果酒制作有什么不同？。
第一章发酵工程第2节微生物的培养技术及应用1.研究和应用微生物的前提（发酵过程的重要基础）是什么？。
按物理性质分，培养基可以分为，分离鉴定微生物一般用培养基，工业生产一般用培养基。
按功能来分，培养基可以分为，在培养基中加刚果红可以鉴别菌。
按成分来分，培养基可以分为，工业生产一般用培养基。
2.培养基的营养成分一般含有，此外培养基还需要满足微生物对PH、特殊营养及O2的需求。
如培养乳酸杆菌时，需要在培养基中加，培养霉菌时，PH调至；培养细菌时，PH调至。
牛肉膏、蛋白胨都能为微生物提供，牛肉膏还能提供。
3.获得纯净微生物的关键是，无菌技术主要包括4.消毒是指，无菌操作时，一般对什么进行消毒？，常用的消毒方法有，牛奶用巴氏消毒法有什么优点？。
2024年高中生物新教材同步选择性必修第三册教材答案与提示
2024年高中生物新教材同步选择性必修第三册教材答案与提示第1章发酵工程第1节传统发酵技术的应用教材第6～7页探究·实践一、制作泡菜结果分析与评价1.隔绝空气；无氧条件。
2.装完原料后还需要加入冷却好的盐水，留有一定空间，便于冷却好的盐水淹没全部菜料。
3.根据实际情况作答即可。
二、制作果酒和果醋结果分析与评价1.在制作果醋的过程中，发酵液表面出现菌膜；在制作果酒的过程中，发酵液中出现气泡，发酵液温度上升，逐渐变为深红色，葡萄皮覆盖在发酵液表面。
其中最明显的变化为制作果酒时气泡的释放，在发酵10天后变化最明显。
原因：果醋发酵液表面的菌膜是醋酸菌进行有氧呼吸大量繁殖并聚集在发酵液表面形成的；果酒发酵液中产生气泡是由于酵母菌进行无氧呼吸释放CO2，发酵过程产热，使发酵液温度上升，发酵过程中果皮中的花青素进入发酵液中使发酵液呈深红色。
2.在制作果酒的过程中，可能会有除酵母菌之外的微生物生长，它们会对果酒发酵产生影响。
为避免这种影响，应按照“方法步骤”所述来处理材料及器具，避免杂菌污染，并保持无氧条件，注意在排气时仅拧松瓶盖，切勿打开，防止其他微生物进入。
3.在制作果醋的过程中，发酵温度为30～35 ℃，且保持有氧条件，而酵母菌是兼性厌氧微生物，发酵温度为18～30 ℃，故其不会继续发酵。
醋酸菌来自空气，可通过人工接种醋酸菌加快果醋的制作。
4.可以通过检查容器密闭性、选用优质原料、人工接种菌种等措施改进。
教材第8页练习与应用一、概念检测1.(1)×[卤汁中的乳酸菌和芽孢杆菌会竞争营养物质和生存空间。
](2)×[乳酸菌发酵不产生CO2。
](3)√[经过微生物的发酵，豆腐中的蛋白质被分解成小分子的肽和氨基酸，使该臭豆腐具有特殊的味道。
]2.D[醋酸菌是好氧细菌，制作果醋利用了其在有氧条件下产生乙酸。
]二、拓展应用1.利用传统发酵技术制作的食品有酒、酸奶、食醋等；它们制作的原理分别是：酵母菌的无氧呼吸、乳酸菌的无氧呼吸、醋酸菌的有氧呼吸。
动物细胞培养
能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？
不能，因为动物细胞培养适宜的PH为7.2—7.4，此环境下胃蛋白酶（2.0） 没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。
动物组织块
动
用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理
物 分散成单个细胞
细 胞
制成细胞悬液
原代培养：细胞或组织离开机体后的首次培养
培
养
原代培养
的
过
程
体外培养的细胞表现为哪些特点？ 细胞贴壁：在培养瓶 悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上。
培养皿
培养瓶
培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易于贴附。 所有的动物细胞都会贴壁生长吗？
接触抑制 解除方法 分瓶培养 贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖。
p H ： 多数细胞生存的适宜pH在7.2-7.4
气体环境 O2: 细胞代谢所必需的 （95%空气和 CO2：维持培养液的pH 5% CO2 ）
CO2 培养箱
动物细胞培养的过程 选择什么样的细胞进行细胞培养？
幼龄动物的细胞和分化程度低的细胞更容易培养，原因是这些细胞分裂 能力强。
动物细胞以组织的形式存在，取材后对其进行怎样的处理？
水、无机盐、糖类、氨基酸、无机盐、维生素、生长因子等
合成培养基 根据细胞生存所需的物质种类和含量严格配置而成的培养基
天然培养基 主要来自动物体液或动物组织分离提取液，成分复杂，来源受限 实际培养时，在合成培养基中添加一定比例的动物血清
动物血清：含有多种未知的促细胞生长因子及其 他活性物质，可以补充合成培养基中缺乏的物质
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单层细胞培养法
悬浮细胞培养法
悬浮细胞培养是指细胞悬浮在培养液中生长
增殖的培养方式。 少数情况下，培养的细胞没有贴壁依赖性， 可通过专门设备使细胞始终处于悬状态而在 体外生长，这种形式称为悬浮培养。 适用于血液和淋巴组织的细胞、肿瘤细胞等 非贴壁依赖性的动物细胞。
传代培养
将细胞从一个培养瓶转移到另一个培养瓶即
⒈天然培养基 ⒉合成培养基 ⒊无血清培养基
（1）天然培养基
动物血清（胎牛血清、小牛血清）、组织提取 液、鸡胚胎汁等。 优点：营养价值高 缺点：成分复杂、来源有限、成本较高 血清（serum）：纤维蛋白已被除去(如通过 血凝或去纤维蛋白法)的血浆。
血清培养基的优点： 含有丰富的利于细胞生长的成分 血清培养基缺点： （1）动物血清来源有限，价格高，不宜大量使用 （2）动物血清成分复杂且成分不稳定，使生长过程 不易检测控制。 （3）虽然血清对细胞生长有效，但会对后期培养产 物的分离、提纯以及检测造成一定困难。
胰蛋白酶消化法
适用于消化间质较少的软组织
钙离子和镁离子对胰蛋白酶的活力有一定抑
制作用，因此一般不用含有这些离子的BSS 配制。 胰蛋白酶的消化效果影响因素。 胰蛋白酶消化法有热和冷两种不同的处理条 件。
胰蛋白酶消化法
机械法
离心分离法
机械解离法
针芯挤压过网法
针头抽吸法
原代培养常用方法
组织块培养法
使用组织块培养法，外植块能在一定限度内
保持其原有的组织结构，有利于适应外界培 养环境，操作简便，是动物细胞培养技术中 最常用的原代培养方法。
动物细胞的原代培养
－－组织块法
细胞培养的实验用品
细胞培养瓶
25平方厘米，正方斜颈 25平方厘米，三角斜颈 75平方厘米，正方斜颈 75平方厘米，三角斜颈 150平方厘米，正方斜颈
鸡胚组织
鼠胚组织 血细胞 人体肿瘤
解离释放细胞
机械法
消化法
一般体积稍大的组织在培养瓶中生长时，处
于周边的少量细胞生长较好，而大部分内部 细胞因营养物质穿透有限而代谢不良，同时 会受到纤维成分束缚。因此，为获得大量生 长良好的细胞，必须把组织分散，使细胞解 离。
消化法
消化法是用酶或螯合剂把已经剪成较小体积的组织 进一步分散，使其成为小细胞团或单个细胞状态的 方法。
组织块培养法 单层细胞培养法 悬浮细胞培养法
1、组织块培养法：将体内取出的组织块切割
成一定大小的植块后再接种进行培养的方法。
为什么组织块培养法能用于培养细胞？
对于大多数动物组织而言，在植块培养1～3
天 后，即有细胞从植块向外迁移，随着培养 时间 的推移，迁出的细胞会越来越多，而且 迁出的细胞不断分裂繁殖，逐渐涨满支持物 表面
影响动物细胞体外生长的因素包括生物因素、
化 学因素、物理因素。生长条件的控制主要包 括温 度、pH、渗透压、气体等。 ������
温度：人类和哺乳类动物细胞培养适宜温度为 36.5±5℃，。 ������ pH：哺乳动物细胞为7.1-7.3。 ������ 渗透压：细胞在高渗透压或低渗透压溶液中会 发 生皱缩或肿胀，甚至破裂。（BSS溶液） ������ 气体：细胞的生长代谢离不开气体，主要包括 O2 和CO2。二氧化碳培养箱。
目的制品后，然后再转移到生物安全柜里培 养。
无菌室
液氮罐
安全柜
液氮罐
着装
操作者进入无菌室前先用肥皂洗净双手，
然后用1‰ 新洁尔灭浸泡消毒5分钟
将小白鼠断颈处死，然后用75%酒精或1‰ 新洁尔 灭浸泡消毒，迅速进入无菌室。
将小白鼠置超净工作台上，打开腹腔
用眼科剪和镊，将肾外膜剪破，并将其剥
动物细胞培养所需的基本条件
一、动物细胞的培养 器材的清洗和消毒
⑴器材的清洗 浸泡、刷洗、泡酸、冲洗 ⑵器材的消毒灭菌 物理消毒 化学消毒
动物细胞培养基的组成和制备
水和平衡盐溶液 天然培养基
合成培养基
无血清培养基
水：三蒸水或超纯水
平衡盐溶液（BSS）
主要由无机盐和葡萄糖 组成，具有维持细胞渗透压、调控培养液酸、 碱度平衡的功能。 ������ 例如：Hanks液 注：酚红在培养基中被用来作为pH值的指示 剂： 中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。
血清的生物功能
1.提供基本营养物质：氨基酸、 维生素、无机物、脂类物质、 核酸衍生物等，是细胞生长 必须的物质。
2.提供激素和各种生长因子：胰岛素、肾上腺 皮质激素（氢化可的松、地塞米松）、类固醇 激素（雌二醇、睾酮、孕酮）等。生长因子如 成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板 生长因子等。
3.提供结合蛋白：结合蛋白作用是携带重要的 低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪、 以及激素等，转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细 胞代谢过程中起重要作用。
free medium,SFM)是 不含血清的动物细胞培养基，由基础培养基 和添加组分组成。试图全部替代血清成分。
基础培养基较常用的是DMEM、F12培养基。 ������
无血清培养基加入添加剂 ⑴生长因子和激素 ⑵结合蛋白：转铁蛋白和白蛋白 ⑶贴附因子和伸展因子 ⑷有利细胞生长的因子和元素
植物细胞和动物细胞培养的比较
遗传物质 未改变
动物胚胎或幼龄动 物的组织、器官 单个细胞
胰蛋白酶 （分解弹性纤维） 加培养液
细胞悬浮液 原代培养 10代细胞
细胞株
50代细胞
遗传物质 已改变
传代培养
细胞系 无限传代
细胞培养板
6孔， 12孔， 24孔， 48孔 96孔
细胞培养皿
35mm 60mm 100mm
冻存管
1.2ml 2ml， 5ml
超净工作台与生物安全柜
首先超净工作台是一种局部净化设备，即利
用空气洁净技术使一定操作区内的空间达到 相对的无尘、无菌状态。它的主要作用在于 给与实验一个几乎无菌的环境；
向肾门，去肾外膜及脂肪。
剪碎组织
接种组织块
移入培养箱中（注
意贴有组织块的一 面朝上），
静止2～3小时， 然后将细胞培养瓶 轻轻翻转，继续静 止培养。
观察
24～48小时后若培养液变成黄色且混浊，表
示已被污染； 若培养液变成紫色，一般细胞生长不好，则 培养液pH过高；
若培养液显为橙黄、橘红且清澈，一般显示
胰蛋白酶消化法
胶原酶消化法 其他消化酶消化法 螯合剂消化法
消化液
(1) 胰蛋白酶溶液 主要作用是使细胞间的蛋白质水解，从而使贴壁 细胞从瓶壁上脱落并使细胞游离分散开来
常用浓度为0.25%或5%胰蛋白酶。
(2) EDTA溶液 作用机制是破坏细胞间的连接。 对于一些贴壁特别牢固的细胞，可用EDTA和胰 酶的混合液 EDTA溶液的使用浓度为0.02%，配制时应加 碱助溶 (3)胶原酶溶液 胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用，胶 原酶作用的对象是胶原组织，因此不容易对细胞产 生损伤。
称为传代培养。 原代培养的细胞在生长、繁殖一定时间后， 由于空间不足或细胞密度过大导致营养枯竭， 会影响细胞的生长，因此需要进行扩大培养， 即传代或称为传代培养。
动物细胞生长特性：
细胞贴壁：
悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上， 称为细胞贴壁。 要求： 培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴 附。 细胞的接触抑制： 当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞 就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑 制。
4.对培养中的细胞起到某些保护作用：
提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损 伤。 有一些细胞，如内皮细胞、骨髓样细胞可以释 放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到 中和作用。可以使用血清来终止胰蛋白酶的 消化作用。因为胰蛋白酶已经被广泛用于贴 壁细胞的消化传代。
血清蛋白形成了血清的粘度，可以保护细胞免 受机械损伤，特别是在悬浮培养搅拌时，粘 度起到重要作用。 血清还含有一些微量元素和离子，他们在代谢 解毒中起重要作用
贴壁生长细胞传代 半悬浮生长细胞传代 悬浮生长细胞传代
贴壁生长细胞传代
贴壁生长细胞传代必须采用消化法。 根据细胞贴壁牢靠程度的不同，可以选用不
同的消化液。 必要时还可联合使用消化液。
半悬浮生长细胞传代
此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不
牢，可用直接吹打方法使细胞从瓶壁脱落下 来，进行传代。 直接吹打会造成一些细胞的损伤。
合成培养基
������
优点：成分已知，便于对实验条件进行 控制。 ������ 缺点：无法替代一些未知成分 ������ 解决途径——合成培养基中添加小牛血 清，彼此互补，成为“完全培养基” 目前常用的合成培养基包括：MEM、DMEM、 F12、M199等。
MEM培养基：厄尔利（Earle）于1951年开发成功 。含有少量氨基酸、维生素、谷氨酰胺以及必须的 无机盐，组成简单。 DMEM培养基：由杜尔贝科（Dulbecco）等在 MEM培养基基础上研制而成，增加了各已有成分的 含量，同时又根据葡萄糖高低分为高糖型 （4,500mg/L）和低糖型（1,000mg/L），高糖型适 合生长较快、贴附性差的细胞（例如肿瘤细胞）培 养。
悬浮生长细胞传代
悬浮细胞多采用离心法传代。
动物胚胎或幼龄动 胰蛋白酶 单个细胞 细胞 制成 悬浮 物的组织、器官 剪碎 液 去掉组织 细胞增殖 间蛋白 部分细胞 无限传代
传代培 养 原代培 养
加培养液
动物细胞培养不能
最终培养成生物体
动物细胞培养
动物组织细胞间隙中 含有一定量的弹性纤 维等蛋白质，将细胞 网络起来形成具有一 定弹性和韧性的组织 和器官。