动物细胞培养基本操作
【高中生物】动物细胞培养课件 2022-2023学年高二下学期生物人教版选择性必修3
➢制成细胞悬液
1.将组织分散成单个细胞 ①方法: 机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理。 ②原因: 从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了 生长和增殖；能使细胞与培养液充分接触，更易进行物质交换。
进行动物细胞培养地常用胰蛋白酶分散细胞，这说明细胞间的物质主要是 什么成分？用胃蛋白酶行吗？
这一阶段的细胞称为细胞株
增殖缓慢，甚至完全停止。
这一阶段的细胞称为细胞系
继续培养 （50代以后）
大部分细胞 衰老死亡
少数细胞会克服细胞寿命的自然极限，获得不死性， 这些细胞已经发生了突变，正朝癌细胞发展。
遗传物质一定改变了
二、动物细胞培养的过程
➢流程图解
取动物组织
制成细胞悬液
用机械的方法，或用胰 蛋白酶、胶原蛋白酶等 处理的方法，将组织分 散成单个细胞
放入CO2培养箱中培养 转入培养液进行原代培养
传代培养
放入CO2 培养箱中培养
有关动物细胞培养的问题
➢酶解法较温和，一定不会对动物细胞造成损伤，对吗？ 不对；使用胰蛋白酶时，要控制好作用时间，因为胰蛋白酶不仅能
分解细胞间的蛋白质，长时间作用还会分解细胞膜蛋白等，对细胞造成 损伤。
1.幼龄动物的细胞与老龄动物的细胞相比，分化程度低的与分化程度高的 细胞相比，哪些细胞更易于培养？为什么？
包括胚胎干细胞和成体干细胞等。
➢胚胎干细胞（简称ES细胞）
分布: 存在于早期胚胎中 举例: ES细胞在体外分化成心肌细胞、神经元细胞
和造血干细胞等 特点: 具有分化为成年动物体内的任何一种类型的
细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官 甚至个体的潜能。
动物细胞培养方法
动物细胞培养方法
动物细胞培养是一种常用的实验手段，广泛应用于细胞生物学、药物研发、生物医学研究等领域。
以下是一般性的动物细胞培养方法：
1.细胞系的选择：选择合适的动物细胞系是动物细胞培养的第一步。
细胞系的选择要考虑细胞类型、来源、生长特性和用途等因素。
2.细胞培养基的准备：准备适用于所选细胞系的培养基。
培养基包括基本培养基和补充物，如生长因子、抗生素等。
不同的细胞系需要不同的培养基。
3.细胞的解冻：从冷冻保存的细胞库中取出细胞，进行解冻。
解冻过程要尽可能快速，以减少细胞对冷冻损伤的敏感性。
4.细胞传代：当细胞达到一定的密度时，需要将其传代，以维持细胞的生长状态。
传代过程包括细胞的分离、计数和重新接种。
5.细胞培养条件的控制：控制培养条件，包括温度、湿度、CO2浓度等。
通常细胞培养箱会提供稳定的培养环境。
6.细胞的观察和检测：定期观察细胞的形态、生长状态，并进行必要的细胞检测，如细胞计数、细胞周期分析等。
7.防止细胞污染：严格遵循无菌操作规程，防止培养物受到细菌、真菌、支原体等的污染。
使用无菌操作室和经过无菌处理的实验器材。
8.制备细胞冻存物：定期制备细胞冻存物，以备将来使用。
冻存物的制备需要使用适当的冻存液和合适的冷冻保存温度。
9.特殊操作：针对具体实验需求，可能需要进行细胞转染、感染、药物处理等特殊操作。
在进行动物细胞培养时，实验者需具备丰富的培养经验和相关技能，同时需按照实验室的标准操作规程进行操作，以确保实验的准确
性和可重复性。
动物细胞工程动物细胞培养和核移植技术
核移植操作
显微操作
在显微镜下，将供体细胞核移植到受体细胞中。
融合与激活
通过电刺激或化学方法诱导受体细胞与供体细胞 融合，并激活新形成的细胞。
筛选与鉴定
对新形成的细胞进行筛选和鉴定，确保核移植成 功。
重组胚胎的培养与移植
胚胎培养 在适宜的培养条件下，对重组胚胎进行培养，促进其发育。
胚胎移植 将培养成熟的胚胎移植到代孕动物体内，以产生后代。
融合后的细胞开始分裂和发育，最终 形成与供体具有相同遗传物质的克隆 个体。
核移植技术流程
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供体细胞的选择与准备
选择适当的供体细胞
01
根据实验需求选择具有所需特性的供体细胞，如特定组织或器
官来源的细胞。
细胞培养准备
02
确保供体细胞处于适宜的培养环境中，包括适当的培养基、温
度、气体条件等。
细胞传代与扩增
03
对供体细胞进行传代和扩增，以获得足够的细胞数量用于核移
植。
受体细胞的选择与准备
选择适当的受体细胞
根据实验需求选择具有良好接受性的受体细胞，如去核的卵母细 胞。
去核处理
使用显微操作技术去除受体细胞的细胞核，为核移植做好准备。
受体细胞激活
通过化学或电刺激方法激活受体细胞，使其恢复分裂活性。
细胞分离
通过离心、过滤等方法将细胞从酶液
3
中分离出来。
培养环境控制
提供适宜的温度、湿度、气体环境，
5
保持培养基的营养成分和pH值。
组织消化
2
使用适当的酶液将组织分解成单个细
胞。
细胞接种
4
将分离出的细胞接种到培养容器中。
传代细胞培养
动植物细胞培养的基本原理和操作技巧
动植物细胞培养的基本原理和操作技巧细胞培养是生物学中十分重要的实验技术，可用于各种细胞学、遗传学或生化学的研究。
其中，动植物细胞培养是两大主要领域之一。
本文将对这两种培养细胞类型的基本原理和操作技巧进行介绍。
一、动物细胞培养动物细胞培养是利用无菌条件下的细胞生长基质，通过检测和调整培养环境中的养分浓度、温度、pH值、气体成分等因素，使细胞在体外无限制增殖和分化的技术。
因此，准确掌握动物细胞的培养技术是进行多种细胞学研究的重要基础。
（一）培养基的配制动物细胞培养的基础是培养基的配制。
一般而言，动物细胞培养基可以分为无血清和含血清的培养基两类。
其中，含血清的培养基可以促进细胞生长，因此被广泛使用。
不过，含有血清组分的培养基不仅具有生物反应性，而且批次差异较大，因此需要进行良好的质量控制。
（二）细胞的分离和培养常常采用酶溶解技术将组织中的细胞分离出来，并将其移至培养基中。
其中，组织的分离能力受细胞的外表形态、黏附性等表现的影响。
一般情况下，将由細胞附着在培养基上的组织片漂浮在果葡糖溶液中，比起用酶方案更有效。
在进行培养的过程中，要注意培养基的更换和细胞生长的密度，避免过度生长导致的细胞死亡。
（三）细胞的冻存和解冻细胞的冻存和解冻是进行细胞培养的必须环节。
动物细胞在液氮中冰冻保存时，为保证细胞的完整性及生物活性，需进行冻存液的配置，加数种抗氧化物可提高细胞的存活率。
而在解冻后，应注意细胞的复苏需要时间，因此在解冻后加多种生长因子能够大大提高细胞复苏的效率。
二、植物细胞培养植物细胞培养是将植物细胞通过无性繁殖技术分离、培养在含有营养和生长因子的培养基上，使其在人工环境下继续生长和分化的技术。
其应用范围较广，不仅可用于植物的育种、遗传改良及叶绿素合成的研究，同时还被广泛用于研究植物药物、糖果等领域。
（一）培养基的配制植物细胞培养基在元素组成上与动物细胞培养基有所不同，其中可以添加植物生长素、糖、氨基酸和维生素等物质。
小鼠细胞实验培养步骤
小鼠细胞试验培养步骤小鼠细胞常用的分别方法有两种，一种是贴块法，一种是消化法，这两种方法都可以用于分别和培养原代细胞。
一、试验分别和培养步骤1. 小鼠颈椎脱臼处以死刑后，剃除腹胸部的被毛，放入装有75%酒精的烧杯中浸泡5min。
2. 取出小鼠，在无菌环境下打开胸腔，取出心脏组织，注入盛有无菌1×PBS的培养皿中，洗净组织表面的血液。
3. 将清洗干净的心脏组织转入装有75%酒精的培养皿中浸泡15s以杀死大多数的心脏被膜细胞，浸泡完成后赶忙转入装有无菌1×PBS的培养皿中震荡清洗。
4. 清洗完成后，用剪刀镊子搭配除掉自动脉弓和心房组织，仅保管心室部分，再次用1×PBS清洗去除心室内的血液。
5. 将清洗干净的心室组织用剪刀减成1mm3大小左右的碎块，之后用PBS清洗若干次后按下述两种方法之一进行后续操作。
A. 贴块法6. 将清洗好的碎块转入另一培养皿中，用0.25%胰蛋白酶消化液浸泡组织，室温消化3—5 min。
7. 消化完成后，添加数毫升FBS停止消化，之后吸弃液体，加PBS清洗组织块1伺次后，用200 ul吸头将组织块平均接种于T—25培养瓶的培养面上，之后将培养瓶放置于37℃二氧化碳培养箱中，静置2—4h。
8. 待组织处于略微脱水的状态时，小心添加2ml培养基，添加时注意尽量不要将组织块冲起，要使培养基接触全部的组织块。
9. 之后放入培养箱中连续培养，一般2—4天后成纤维细胞会从组织块四周爬出，待爬出的细胞有较多数量时，可将细胞消化下来，去除组织块，转入另一培养瓶中培养。
B. 消化法6. 将清洗好的碎块转入另一离心管中，加入混合消化液（0.08%胰酶+0.06%Ⅱ型胶原酶）37℃水浴消化8 min后，吸取上层混悬液弃去。
7. 余下组织加入混合消化液10 ml，37℃水浴震荡消化10 min；吸取上层悬液至另一离心管中，加入适量FBS停止反应；剩余沉淀物再加消化液消化3—5次，直至组织块消化。
高中生物 新人教版 选择性必修3 动物细胞培养 教案
第1课时动物细胞培养新课标核心素养1.概述动物细胞培养需要的基本条件。
2.简述动物细胞培养的基本操作过程。
3.说出干细胞的分类及作用。
1.生命观念：构建动物细胞培养的流程图，认同动物细胞培养是动物细胞工程的基础。
2.社会责任：理性客观地分析干细胞在临床上的应用所产生的效益与风险。
知识点(一)动物细胞培养的条件1．概念：从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。
2．条件(1)营养条件①常用培养基的类型：液体培养基。
②成分：糖类、氨基酸、无机盐、维生素、血清等。
(2)无菌无毒的环境①需要对培养液和所有培养用具进行灭菌处理以及在无菌环境下进行操作。
②培养液还需要定期更换，以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。
(3)温度、pH和渗透压①哺乳动物细胞培养的温度多以36.5±0.5_℃为宜。
②多数动物细胞生存的适宜pH为7.2～7.4。
③渗透压也是动物细胞培养过程中需要考虑的一个重要环境参数。
(4)气体环境：动物细胞培养所需气体主要有O2和CO2①O2是细胞代谢所必需的。
②CO2的主要作用是维持培养液的pH。
(1)动物细胞培养是一个在适宜的条件下，细胞增殖和分化的过程(×)(2)将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基，称为合成培养基(√)(3)在进行细胞培养时，通常采用培养皿或打开培养瓶盖的方式以获取新陈代谢所必需的O2(×)(4)将动物细胞置于含有95%O2和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养(×)1．(生命观念)为什么探究动物细胞培养时，要在培养基中加入血清、血浆等天然成分？提示：血清和血浆中含有多种维持细胞正常代谢和生长的物质，如蛋白质、氨基酸、未知的促生长因子等，人们对细胞所需的营养物质还没有完全搞清楚。
2．(科学思维)动物细胞培养需要控制什么样的气体环境？各自起什么作用？提示：95%空气加5%CO2。
《动物细胞培养技术》课件
动物细胞培养技术可以用于组织工程和再 生医学领域，为损伤或病变的组织和器官 提供替代疗法。
02
动物细胞培养的基本原理
细胞周期与细胞分裂
细胞周期
描述细胞生长和分裂的阶段，包 括间期和分裂期。
细胞分裂
细胞繁殖的方式，包括有丝分裂和 减数分裂。
细胞分裂调控
介绍细胞分裂的调控机制，如周期 蛋白、激酶等。
调整细胞浓度
将分离出的单个细胞调整到合适的浓度。
接种
将调整好的细胞悬液接种到培养容器中，轻轻晃 动容器使细胞均匀分布。
培养
将接种好的容器放置在恒温、恒湿、恒光的培养 箱中培养，定期观察记录细胞的生长情况。
细胞观察与检测
01
02
03
04
形态观察
定期观察细胞的形态变化，如 细胞大小、形态、染色深浅等
。
• 干细胞治疗是一种新兴的治疗方法，利用干细胞的再生和分化能力来修复或替换受损的组织和器官。动物细胞培养技术在 干细胞治疗领域的应用，为干细胞分离、培养和扩增提供了重要的技术支持，有助于推动干细胞治疗的发展。
动物细胞培养技术的发展前景 干细胞治疗领域的应用
药物筛选与毒性测试
药物研发过程中，需要进行大量的药物筛选和毒性测试。动物细胞培养技术可以 模拟人体细胞对药物的反应，为药物筛选和毒性测试提供更为准确和可靠的数据 支持，有助于加速新药的研发进程。
动物细胞培养技术广泛应用于生物医 学、药物研发、食品安全等领域。
培养基是动物细胞培养的关键因素， 它为细胞提供营养、生长因子和适宜 的生存环境。
动物细胞培养技术的外培养动物细胞。
20世纪初，随着组织培养技术 的不断发展，动物细胞培养技术
逐渐成熟。
21世纪初，随着基因编辑技术 的发展，动物细胞培养技术在疾 病治疗、药物研发等领域的应用
动物细胞培养的原理
动物细胞培养的原理
动物细胞培养是利用体外培养技术，将动物个体或组织细胞在适宜的培养基中进行生长和繁殖的过程。
首先，我们需要准备培养基。
培养基通常是含有营养和生长因子的液体或凝胶，提供细胞所需的营养物质和环境条件。
接下来，我们需要从动物体内获取细胞来源。
可以通过组织块分离、器官分离或细胞悬浮液等方式来获得细胞。
然后，将获得的细胞放入培养基中，并提供适宜的温度、湿度和气体环境。
细胞在培养基中生长、分裂并形成细胞集群，逐渐扩增数量。
在培养过程中，还需要定期检查细胞的形态、增殖速率和细胞密度等指标，以确保细胞的健康状态。
同时，添加适当的血清或生长因子等物质可以促进细胞的增殖和生长。
这些物质可以提供必需的营养物质和信号，促使细胞进行分裂和增殖。
最后，根据需要，可以继续对细胞进行传代，即将已经生长和分裂的细胞转移至新的培养皿中。
这样可以使细胞保持活性和增殖能力。
总的来说，动物细胞培养的原理是利用合适的培养基，提供适
宜的环境条件和营养物质，使细胞在体外生长和繁殖。
这为研究细胞的生理、病理和分子机制提供了重要的工具和平台。
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实验一动物细胞培养细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织(或器官)取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养．使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。
细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构(如细胞骨架等)、细胞生长及发育等过程的观察。
因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的—种简便易行的实验技术，同时我们也不可忽略的另一个因素，那就是它脱离乐生物机体后的—些变化。
细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。
如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿痛学及病毒学等为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，对原代细胞与传代细胞有一个基本概念。
本实验分两次进行．即清洗与消毒和传代细胞的培养与观察。
Ⅰ清洗与灭菌一、实验目的能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。
二、实验原理清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。
体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。
细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。
清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。
如有毒的化学物质，哪怕残留0．1个，也可能影响细胞生长。
灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。
假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。
以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。
三、实验材料、用品材料：无臭氧型紫外灯，微孔滤膜(直径25)：孔径为0．22μm，微孔滤膜(直径90)：孔径为0．22 μm，过滤器(直径25)。
药品：70％或75％酒精，0．1％新洁尔灭，煤酚皂溶液(来苏儿水)，0．5％过氧乙酸，乳酸，37％甲醛，高锰酸钾，NaOH，盐酸，重铬酸钾，浓硫酸(工业)，DEPC水[体积分数0．1％的焦炭酸二乙酯(diethylpyroearbonate)]。
仪器：超净台，干燥箱，高压锅，过滤器，过滤泵。
四、实验步骤(一)清洗1．新玻璃器皿的清洗先用自来水刷洗，再浸泡5％稀盐酸以中和玻璃表面的碱性物质和其他有害物质。
2．使用过的玻璃器皿的清洗(1)使用过的培养用品应立即浸入清水，避免干涸难洗。
(2)用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥。
(3)浸酸性洗液过夜。
(4)从酸性洗液捞出后自来水冲洗10．15次去除残余酸液，蒸馏水涮洗3次，倒置烘干。
(5)包装(牛皮纸或一般纸)。
(6)高压(15磅20 min)或干热(170℃2 h)灭菌。
(7)贮存备用。
3．胶塞的处理(1)新胶塞应先用清水清洗之后再用0．2％NaOH煮沸lO-20 min。
(2)自来水清洗10次。
(3)再用1％稀盐酸浸泡30 min。
(4)自来水清洗10次，蒸馏水涮洗3次。
晾干，高压灭菌(见(二)消毒与灭菌)。
旧胶塞不必用酸碱处理可直接用洗涤剂煮沸和清洗数次，过蒸馏水，晾干，包装并高压灭菌后，便可使用。
（二）消毒1．物理消毒法(1)紫外线消毒用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿，如塑料培养皿、培养板等。
这是常使用的消毒方法之一。
(2)干热灭菌主要用于玻璃器皿的灭菌。
将用于细胞培养的器皿放人干燥箱内，加热至160℃，保温90－120 min。
用于RNA提取实验的用品则需180℃，保温5－8 h。
(3)湿热灭菌此方法也称为高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。
主要应用范围是布类、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如Hanks液、PBS、20×SSC等)。
手动高压灭菌锅操作如下：①首先查看高压锅内的水是否充足，放人物品盖好盖。
②加热高压锅。
将放气阀打开，放气5—10 min，以排除锅内的冷空气。
③待锅内水沸腾后，落下放气阀继续升温升压，玻璃器皿等用15磅(121℃)30 min，胶塞、塑料制品、溶液等可用10磅(115 ℃)20 min。
调节火力大小保持该压力。
④停止加热，待压力自然下降至0再打开放气阀排汽，开盖，取出高压灭菌的物品烘干。
电热自动灭菌锅使用说明(型号：SANYO Autoclave MLS-3020)：①放气筒加水至LOW水平线处，将与高压锅相连的导气管插入放气筒里，然后将放气筒归于原位。
②打开高压锅盖，加入蒸馏水至高压锅底的水位线，水位线位于V型凹槽的1／3－2／3处。
③打开电源。
④设定高压温度及时间，高压锅的温度范围为105－121℃，高压灭菌一般采用121℃20—30 min。
⑤把待高压的物品置于高压锅内，顺时针方向将exhaust钮旋至close位置。
⑥关闭高压锅盖，旋至显示屏上左上角的红亮点刚出现为止。
⑦按start钮，开始高压，在温度达80℃时显示器开始显示温度，当温度达到所需的设定温度时，在显示屏的左下角有一长形的指示灯闪亮，直到高压时间结束后指示灯灭，此时蜂鸣器报警一声。
当压力降至0 MPa时，蜂鸣器再报警一声。
温度降至80℃时，蜂鸣器报警10次。
显示屏温度指示消失，此时才可打开锅盖。
⑧关电源，开高压锅盖，取出已灭菌的物品，烘干。
(4)滤过除菌用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液的灭菌。
采用金属滤器和小型的塑料滤器，配上可以更换的微孔滤膜，极大地方便了操作。
滤器型号按直径大小划分。
如过滤量大的培养用液常用较大型号的金属滤器(直径90 mm、100 mm、142 mm……等)，配以过滤泵使用。
过滤量较小的液体常用注射器推动的塑料小滤器(直径20 mm、25 mm等)。
滤膜孔径有0．60 μm、0．45 μm、0．35 μm、0．22 μm、0．10μm等，以0．22 μm除菌最为保险，但对于较粘稠难滤过的液体，仍需选用孔径较大的滤膜。
①在过滤器上装上微孔滤膜，孔径为0．22μm。
②用布包好，湿热灭菌后使用。
2．化学消毒法常用的消毒液有如下几种：(1)70％(或75％)酒精：超净台里常备70％酒精棉球(卫生级酒精)，用于手和一些金属器械或工作台面的消毒。
(2)0．1％新洁尔灭：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超净台面的清洁。
超净台旁应常备盛有0．1％新洁尔灭溶液的容器及纱布。
(3)来苏儿水(煤酚皂溶液)：主要用于无菌室桌椅、墙壁、地面的消毒和清洗，以及空气喷撒消毒，特别是污染细胞的消毒处理。
使用浓度请按瓶上说明。
(4)0．5％过氧乙酸：是强效消毒剂，10 min即可将芽孢菌杀死。
用于各种物品的表面消毒，用喷撒和擦拭方式进行。
(5)乳酸蒸气：将乳酸放入坩锅内用酒精灯或电炉加热至沸腾为止。
将门窗紧闭1—3 d。
可将空气中漂浮的微生物杀死。
(6)37％甲醛加高锰酸钾：使用前先紧闭门窗。
将37％甲醛用酒精灯或电炉加热至沸腾后断电或灭火。
用一张纸盛好适量的高锰酸钾，迅速放人已加热好的甲醛中形成蒸气。
1—3 d 后方可达到消毒空气的目的。
3．煮沸消毒急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸15 min后使用。
五、注意事项1．清洗玻璃制品时，浸酸之后一定要用自来水冲洗10—15次。
因为残存的洗液对细胞粘附有很大影响。
清洗塑料制品时要用棉花或柔软纱布擦洗。
千万不要用硬毛刷，否则损害塑料表面后细胞不易贴壁。
Tip和Tube一定要用超声清洗处理后逐个清洗。
如没有洗净会影响下一次使用的效果。
2．干热灭菌时，应在白天使用烤箱，并不断观察，以免发生意外。
当温度超过100℃时，不能再打开烤箱门。
器皿烤完后，待温度降至100℃之下才能开烤箱门。
金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热灭菌方法。
．3．高压灭菌后器皿务必晾干或烘干，以防包装纸潮湿发霉。
4．牛血清、大部分培养基、胰酶和一些生物制剂是有机溶液，均不能高压(如TdR，秋水仙素，谷氨酰胺，异硫氰酸胍，MOPS等)。
5．滤过除菌时，滤器在使用前先装好滤膜(有时可在上面加一层定性滤纸)，包好，经高压灭菌后才能使用。
滤过酶类制剂时应待滤器温度降至室温下再进行。
过滤时压力不宜过大，压力数字以2为宜。
压力太大时微孔滤膜可能破裂，或使某些微生物变形而通过滤膜。
装滤膜时位置要准确。
另外滤器包装时，螺钉不要拧得太紧，以防高压蒸汽不能进入，待高压灭菌之后，再拧紧使用。
6．使用化学消毒法时，配制75％酒精应用卫生级，不要用化学纯、分析纯和优质纯酒精。
来苏儿水不能用于皮肤消毒，它对皮肤有刺激性。
空气消毒时，所有的物品要事先准备齐全并使消毒者有较方便的退出途径。
因为甲醛或乳酸加热后放出的蒸气对人的角膜和呼吸道上皮有严重的刺激和伤害作用。
六、思考题1．哪些物品适合于高压灭菌，并说明理由。
2．紫外线消毒的适用范围和目的是什么?II、传代细胞培养与观察一、实验目的了解传代细胞的传代方法及操作过程，学习观察体外培养细胞的形态及生长状况二、实验原理传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或1：2以上的比例转移，接种到另一培养瓶的培养。
这种培养，第一步也是制备细胞悬液，当细胞长成致密单层时，它很容易被蛋白水解酶和EDTA)所破坏。
所以—般采用胰蛋白酶和EDTA(乙二胺四乙酸盐)的混合物，做为消化液。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。
要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。
二是严格控制无菌条件。
三、实验用品1、器材解剖剪、解剖镊、眼科剪(尖头、弯头)、眼科镊(尖头、弯头)、培养皿、量筒、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶(小方瓶或中方瓶)等。
上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好，9．9xl04Pa(15磅)灭菌30min备用。
此外，还有显微镜、血细胞计数器、血细胞计数板、酒精灯、酒精棉球、碘酒棉球、试管架、标记笔、解剖板等。
2、试剂L磷酸盐缓冲液(PBs)无钙、镁溶液细胞消化液：o．5％胰蛋白酶和o．4%EDTAEMEM液3%谷氨酰胺o．5％台盘蓝染液等3、材料喉癌细胞四、实验方法在做传代细胞培养之前，首先将培养瓶置于显微镜下，观察培养瓶中细胞是否已长成致密单层，如已长成单层，即可进行细胞的传代培养。
1.营养液配制:EMEM液90%犊牛血清 10%双抗(1万单位／m1) 加至约100单位／m13％谷氛酞胺1m17．4％NaHCO3调pH至6．8—7．02．换液:在酒精灯旁打开瓶塞，倒去瓶中的细胞营养液。
3.消化与分装在上述瓶中加入1mlEDTA溶液，轻轻摇动，将溶液倒出。