动物细胞培养的应用
第二节细胞培养方法及应用实例
配比
分包
疫苗产品
①原始种子——基因重组病毒株 当两种有亲缘关系的不同病毒感染同一宿主细
胞时，它们的遗传物质发生交换，结果产生不同于
亲代的可遗传的子代，称为基因重组。
基因重组病毒有“活病毒基因重组”、“灭活
病毒基因重组”及“死活病毒基因重组”。重组病
毒株原始种子属于死活病毒间的重组。
世卫组织提供的6支甲 型H1N1流感原始毒株
⑷包埋法 包埋就是将细胞包裹在有限空间内，制成固定化细胞。包埋后的细胞
不会扩散到周围介质中去，而底物和产物却能自由扩散。 包埋法仅只是将细胞包埋起来，不与载体发生反应，故包埋法细胞的
活性损失较小。包埋法根据其包埋的形式不同，又可将其分为格子型和微 胶囊型两种。
二、植物细胞培养方法
常见的植物组织细胞培养有愈伤组织培养、原生质体培养、花粉培养
一、动物细胞培养方法
根据动物细胞的生长特点，常见的细胞培养方法有贴壁培养、悬浮培 养及固定化培养等三种方法。
1.贴壁培养
所谓贴壁培养是指细胞贴附在 一定的固相表面（如：培养皿、培 养瓶等）进行的培养。 ⑴生长特性
贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴 壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后 就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。
HGPRT 骨髓瘤细胞
使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞 二者合二为一，得到杂种的骨髓 瘤细胞。这种杂种细胞继承两种
融合
(HAT)培养基
亲代细胞的特性，既具有 B淋巴 细胞合成专一抗体的特性，又有
由于挡板的存在，可有效地减小反应器内液面上的 旋涡。
2.贴壁培养反应器——中空纤维反应器
常见的贴壁培养反应器如：中空纤维反 应器、玻璃珠床反应器、陶质矩形通道蜂窝 状反应器等类型。
组织培养技术在动物细胞培养中的应用
组织培养技术在动物细胞培养中的应用动物细胞培养作为生物技术和医疗领域中的一种重要手段，已经被广泛应用。
但是，动物细胞培养过程中，细胞需要营养物质、生长因子和适当的生长环境，同时还需要对细胞进行传代和扩增。
因此，在动物细胞培养中，组织培养技术的应用至关重要。
组织培养技术是指从动物或植物组织中分离单一细胞或细胞某种类型，通过体外培养，使其不断增殖，重建起细胞或组织。
组织培养技术最初是为了研究组织和发育而发展起来的。
随着时间的推移，组织培养技术已经广泛应用于生命科学中的各个方面。
在动物细胞培养中，组织培养技术的应用是多方面的。
首先，组织培养技术可用于单一细胞分离和纯化。
在动物细胞的培养中，不同类型的细胞相互混合，难以选择特定类型的细胞。
通过组织培养技术，可以从细胞混合物中分离出单一类型的细胞，用于后续的研究。
其次，组织培养技术可用于传代和扩增细胞。
通过组织培养技术，可以使一组细胞不断增殖，从而保证所需细胞数量的充足性。
而且，组织培养技术也可以用于细胞冻存，以备以后使用。
在组织培养技术的应用中，细胞培养基也是至关重要的。
细胞培养基是一种含有营养物质和生长因子的液体或半固体培养介质。
细胞培养基的配制是根据不同类型的细胞所需的营养物质和生长因子来确定的。
细胞培养基的分类主要包括有血清培养基和无血清培养基两种。
血清培养基中含有胎牛血清，可以提供细胞所需的营养物质和生长因子，但同时也有可能引入病毒和细菌等微生物，会对培养的细胞造成影响。
无血清培养基中不含血清，使用风险更小，但是其营养成分比较简单，价格昂贵。
除了细胞培养基的选择外，组织培养技术的应用还需要注意环境因素。
细胞培养需要一定的温度、湿度、气体浓度和无菌条件等。
例如，在体外培养过程中，细胞需要在38℃左右的温度下生长，并要求培养箱中湿度要保持在95%以上。
此外，由于细胞对例如二氧化碳、氧气等气体的要求不同，还需要根据不同细胞类型对培养箱中各种气体的浓度进行调节。
动物细胞培养
动物细胞培养简介动物细胞培养是一种在体外控制环境下培养和繁殖动物细胞的技术，广泛应用于生物医学研究、药物筛选、疾病治疗等领域。
动物细胞培养是通过提供适当的养分和生长条件，使细胞可以在无体内环境的情况下生长和繁殖。
培养基选择动物细胞培养的首要任务是提供合适的培养基，以满足细胞的生长和繁殖需求。
培养基通常由基础培养液和补充物组成。
基础培养液提供细胞生长所需的基本营养物质，如糖、氨基酸、维生素等。
补充物则包括生长因子、激素、抗生素等，以促进细胞生长和抑制细菌的污染。
常用的培养基有DMEM（Dulbecco最小培养基）、RPMI （Roswell Park红斯威尔纸培养基）、MEM（最小必需培养基）等。
选择适合特定细胞类型和研究目的的培养基对细胞的生长和研究结果至关重要。
细胞分离和传代在动物细胞培养过程中，细胞通常需要经过分离和传代的步骤，以保持细胞的健康状态并扩散细胞数量。
细胞分离细胞分离是将细胞从组织中分离出来的过程。
常用的细胞分离方法包括胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法、机械剪切法等。
分离得到的细胞可以直接用于培养，也可以进行进一步的传代。
细胞传代细胞传代是将已培养细胞进行分离并移植到新的培养皿中的过程，以维持细胞的持续生长。
传代可以通过机械分离、胶原酶等酶处理或稀释离心等方法进行。
传代过程中需要注意的是细胞的密度和周期，以避免细胞过度生长或死亡。
培养条件在动物细胞培养过程中，提供适当的培养条件对细胞的生长和繁殖至关重要。
温度和湿度动物细胞通常在37℃下生长，因此培养箱和孵育器需要保持恒定的温度。
同时，湿度的控制也是必要的，以避免细胞脱水。
CO2和pH值大多数动物细胞需要CO2的存在来维持酸碱平衡。
因此，在培养过程中，需要添加适量的CO2到培养箱中，以维持合适的pH值。
一般来说，细胞培养需要在5% CO2下进行，pH范围为7.2-7.4。
搅拌和通气为了促进细胞的生长和分裂，培养基需要定期搅拌以保持养分的均匀分布。
细胞工程第六章动物细胞培养生物制药
BHK 21细胞（Baby hamster kidney cell）：是1961 年英国从幼地鼠的肾脏分离的细胞。成纤维样，异 倍体。常用于增殖病毒制备疫苗和重组蛋白。
Vero细胞（Vero cell）:是1962年日本从非洲绿猴肾 中分离的细胞。成上皮型，异倍体，贴壁型，是最 常用的大规模培养的动物细胞。
和将产终物体形积成1/积3～累1到/2的适培当养的液时装间入，反一应次器性中收，获适细宜胞
（二）大规、条模产件培物下养、接技培种术养细基胞的。，操培作养方过式程中流加浓缩的营养物 12、 、分流批加式 式培培或细和养养将密在时培胞产细度细间养和物原胞之胞取液培 形有接前增出，养成体种，长部使基过积于以和分细一程，一一产培胞品起中维定定物养持达加，持体速形物续到入不反积度成，生较反断应的连过再长高应将器培续程用至水器部内养添中新较平后 分总基加，培高，培体，新每养密在养积细鲜间液度细基不胞培隔补、胞取变达养一足目增出最基段到标长，大，产
供新鲜培养液流入小室和旧培养液
◆旋转管培养的排方出法，从而使细胞生活在不断更新
的培养液中
◆灌注小室培养法
3． 、培养液的发展 天然培养基(胎汁、血浆和血清)
人工合成培养基（需添加血清）
无血清细胞培养基（用激素、生长因子替代血清）
第三节 动物细胞培养的应用
一、在生物学领域基础研究中的应用 1、在细胞生物学上的应用
始分裂。随着细胞数量增多，细胞间开始接触并 连接成片，出现接触性抑制。 3、停滞期：细胞长满载体表面，随着营养物消耗和 代谢物积累，密度抑制现象出现，细胞开始退化。 如不及时传代培养，细胞脱落死亡。
微载体培养的操作过程：
微载体培养动物细胞也经过以上四步。大致可 以分为五个阶段，即培养初期阶段、黏附贴壁阶段、 维持培养阶段、细胞收获阶段、微载体培养的放大 阶段。
动物细胞培养技术的发展
动物细胞培养技术的发展随着现代科技的不断发展，动物细胞培养技术正在逐步成为生命科学领域的重要研究手段。
动物细胞培养技术可以使科研人员对生命体内的细胞和分子进行深入的研究，从而更好地理解细胞和生命活动的本质。
本文将简要介绍动物细胞培养技术的基本原理、发展历程以及应用前景。
一、动物细胞培养技术的基本原理动物细胞培养技术是一种将分离的动物细胞放入培养基中，使其在适宜的环境下进行生长和繁殖的技术。
通常情况下，细胞培养基中会添加生长因子、营养物质、激素等物质，以保证细胞的正常生长和分裂。
在培养期间，科研人员可以通过各种手段对细胞进行操控、观察和分析，以获得有关生命体内各种细胞和分子的重要信息。
二、动物细胞培养技术的发展历程动物细胞培养技术的发展始于上世纪50年代，当时科学家们开始研究动物细胞的生长和繁殖机制，并尝试将其在培养基中进行体外培养。
然而，由于当时技术水平的限制，细胞培养的成活率和繁殖能力都较低，甚至无法维持长时间的培养。
随着科技水平的不断提高，人们逐渐解决了细胞培养过程中遇到的各种问题，开发出了更加成熟的动物细胞培养技术体系。
现在，动物细胞培养已经成为了现代生命科学领域的重要手段之一。
三、动物细胞培养技术的应用前景动物细胞培养技术具有广泛的研究和应用前景。
例如，在医学领域中，科学家们可以通过动物细胞培养技术研究癌症、病毒感染等疾病的治疗机制，并筛选出合适的治疗药物。
在生物技术领域中，动物细胞培养技术也被广泛应用于细胞克隆、蛋白质表达等方面。
此外，动物细胞培养技术还可以用于呼吸、毒性等方面的研究，并被广泛应用于化妆品、医疗器械、食品等商品的安全性评价。
总之，动物细胞培养技术作为生命科学中的一项重要技术，在未来的发展中将会发挥越来越重要的作用。
科学家们将继续在动物细胞培养技术的基础上，不断探索生命体内细胞和分子的奥秘，以期为人类的健康福祉做出更加卓越的贡献。
动物细胞培养
动物细胞培养
动物细胞培养是一种重要的生物技术手段，广泛应用于医药、生物学研究、食
品工业等领域。
通过细胞培养，可以获取大量同质的细胞群体，为疾病治疗、新药研发提供重要的支持。
动物细胞培养的原理
动物细胞培养是将动物组织或细胞在人工培养基中进行维持、增殖、传代等过程。
培养基通常包括营养物质、生长因子、激素等成分，提供细胞生长所需的营养和环境。
动物细胞培养的步骤
1.细胞来源：从动物体内收集组织样本，获得原代细胞。
2.细胞分离：通过消化酶等手段将组织分离成单个细胞。
3.传代培养：将分离的细胞在培养基中培养，定期传代以增殖细胞数
量。
4.检测与分析：对培养的细胞进行检测、分析，确保其健康状态。
动物细胞培养的应用
1.生物医学研究：细胞培养在癌症、遗传疾病等方面的研究中发挥重
要作用。
2.药物研发：通过细胞培养可以进行药物筛选、毒性测试等工作。
3.食品工业：利用细胞培养技术可以生产细胞培养肉等食品。
动物细胞培养的发展
随着生物技术的不断发展，动物细胞培养技术也在不断创新和提升。
新的培养
基配方、生长因子的发现以及工程技术的应用，使得动物细胞培养在医学和生物学领域有着广阔的应用前景。
动物细胞培养作为一种重要的生物技术手段，将继续在各个领域发挥重要作用，为人类健康和科学研究进步做出贡献。
《动物细胞培养技术及其应用》 知识清单
《动物细胞培养技术及其应用》知识清单一、动物细胞培养技术的基本概念动物细胞培养，简单来说，就是在体外模拟体内的环境，让动物细胞生长、繁殖和发挥功能的技术。
这可不是一件简单的事情，需要精心创造一系列适宜的条件。
细胞从生物体中取出后，要放在特制的培养基中。
培养基就像是细胞的“美食”，包含了细胞生长所需的各种营养物质，如氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖等。
同时，还得调节好环境的温度、pH 值、氧气和二氧化碳的浓度，给细胞一个舒适的“家”。
二、动物细胞培养的基本流程1、取材首先得从动物体内获取要培养的细胞。
这可以是从胚胎、幼体组织，也可以是成体的某些器官。
但取材的过程得小心翼翼，不能损伤细胞，还要保证细胞的活性。
2、原代培养将取得的细胞放入培养瓶或培养皿中，这就是原代培养的开始。
在这个阶段，细胞会慢慢适应新的环境，开始生长和分裂。
3、传代培养当原代培养的细胞长满了培养容器的表面，就需要把它们分成小份，转移到新的容器中继续培养，这就是传代培养。
4、细胞的冻存与复苏为了长期保存细胞，会把细胞放在低温下冻存。
等到需要的时候，再通过特定的方法让它们复苏，恢复活性。
三、动物细胞培养所需的条件1、无菌环境这是至关重要的一点，任何细菌、真菌或病毒的污染都可能导致细胞培养的失败。
所以，实验操作要在无菌的超净工作台中进行，培养基和培养用具也要经过严格的灭菌处理。
2、合适的培养基培养基的成分要精心调配，既要满足细胞的营养需求，又要维持合适的渗透压和 pH 值。
3、温度和气体环境一般来说，细胞培养的温度在 37℃左右，同时要提供适量的氧气和二氧化碳。
氧气用于细胞呼吸，二氧化碳则有助于维持培养基的 pH 稳定。
4、贴壁和悬浮培养有些细胞需要附着在培养容器的表面才能生长，称为贴壁细胞；而有些细胞可以在培养基中自由悬浮生长。
四、动物细胞培养技术的应用1、生物制品的生产比如疫苗、抗体、生长因子等。
通过大规模培养动物细胞，可以高效地生产这些生物制品，满足医疗和预防疾病的需求。
动物细胞培养及应用发展史
动物细胞培养及应用发展史动物细胞培养是指将动物组织或细胞从体内取出，通过提供适宜的培养条件（如温度、营养物质和氧气浓度等）使其在体外继续生长和繁殖的过程。
动物细胞培养的发展历史可以追溯到20世纪初，随着生物技术的发展，动物细胞培养的应用范围也日益扩大。
20世纪初，动物细胞培养主要用于基础研究，如细胞分裂、细胞形态学和细胞功能等研究。
在这个时期，细胞培养的主要障碍在于细胞的污染和细胞生长的不可控制性，限制了研究的进展。
到了20世纪50年代，细胞培养技术取得了重大突破。
1951年，斯特里克（George G. Striker）首次成功地培养了卵白细胞，为细胞培养技术的发展奠定了基础。
此后，赫尼格（Theodore Puck）等人发展了一种名为“Puck的液体”（Puck's Fluid）的细胞培养基，成为细胞培养研究的标准培养基。
此外，1962年，史威弗（Hayflick）与穆尔（Moore）使用小鼠胚胎细胞建立了第一个动物细胞系，被称为WI-38，为后来的细胞株的建立奠定了基础。
20世纪60年代，细胞培养技术开始应用于生物制药领域。
1961年，人类胚胎肾细胞株HEK293被成功建立，成为重要的生物制药细胞株。
此后，越来越多的细胞株被建立，并用于生产各种重要药物和疫苗，如乙型肝炎疫苗、白喉疫苗和重组蛋白等。
到了20世纪70年代，进一步发展了细胞培养技术。
1970年，人类组织因子（HLA）细胞系的建立使得人类组织移植的研究得以推进。
此外，渐渐出现了将细胞培养技术应用于基因工程的趋势。
1973年，科恩（Cohen）和博伊尔（Boyer）成功构建了第一个重组蛋白的表达系统，奠定了现代基因工程的基础。
从此以后，细胞培养技术与基因工程相结合，推动了生物制药的快速发展。
总而言之，动物细胞培养的发展历史经历了从基础研究到生物制药再到基因工程和生物技术领域的转变。
不断改进的细胞培养技术为了疾病治疗、药物研发和基础生物学研究等方面提供了有力的工具和方法，为人类社会的发展做出了重要贡献。
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绒膜促性腺激素、促红细胞生成素、促滤泡激素、生长激素、 促间质细胞激素、促黄体激素等
.
表2 微生物和动物细胞培养方法的比较
PH控制 搅拌速度 溶氧控制 培养基灭菌方法 培养时间 对水纯度的要求
抗体最早是由德国微生物学家贝林发现的，它们存在于人和脊椎动物的血清之 中，是这些生物体内免疫系统的重要组成成分。由于抗体分子具有极其精确的结合 特异性，可以识别各种不同的抗原，还可以激活细胞的其他防卫系统以消灭抗原， 因此抗体在基础研究和临床诊断中获得了广泛的重视和应用。随着杂交瘤技术、蛋 白质工程和转基因技术等技术的发展，抗体已逐步在疾病治疗等应用领域显示出越 来越广阔的应用前景。
.
抗体
由B细胞产生的免疫球蛋白，它能识别抗原的某一特定位点。抗体分 子由两个完全相同的重链分子以及两个完全相同的轻链分子组成。存在 于人或哺乳动物的血清之中。
抗原
有毒物质或病原物侵入，即抗原
指诱导产生抗体的物质。
侵入
抗体1 抗体2
如前所述，抗体分子是免疫系统反应的一个重要组分，因为抗体分子可以识 别各种不同的外来抗原，同时可激活宿主的防卫系统。
微生物细胞
添加酸、碱 速度快、范围广 改变搅拌速度、通气量、进气氧浓度
高温蒸煮 几小时—几天
较低
动物细胞
CO2-HCO3缓冲液 较慢
改变进入气体的氧浓度 过滤
几天—3、4周 很高
与微生物细胞培养类似，动物细胞的体外培养有两种类型：一类是非贴
壁依赖性细胞，这类细胞可以采用与微生物培养类似的方法进行悬浮培养；另一类 是贴壁依赖性细胞，它们需要附着于带适量电荷的固体或半固体表面上生长。
对于一个免疫刺激（有毒物质或病原物侵入，即抗原），每一个淋巴细胞都
会合成并分泌一种单个的抗体，这些抗体可以高度特异地识别免疫抗原的特定区域，
也就是抗原决定簇。由于一个抗原通常都有几个不同的抗原决定簇，因此每个免疫
淋巴细胞都可能产生一种针对某一个抗原决定簇的抗体，这些由同一抗原而产生的
不同的抗体统称为多克隆抗体。
.
11-15
图1
2
大 规3 模 动 物 细 胞4 培 养 工5 艺 流 程 图6
8 7
9
10 细胞培养反应器
诱生剂 细胞
细胞
浓缩纯化
提取 纯化
产品（肿瘤抗原）
提取 纯化
.
产品（干扰素）
产品（单克隆抗体）
内容（一）
单克隆抗体
哺乳动物细胞中有一套复杂的防御系统保护自己不受有毒物质和病原物的侵
害，其中一部分防御反应就是淋巴细胞经诱导产生特异的蛋白，这些蛋白可以在其 他免疫系统蛋白的帮助下与外来物质结合，并抵消其生物学功能。这些特异的蛋白， 就是抗体；相对于抗体，诱发产生抗体的外来物质即称为抗原。
.
细胞系
Fuc
Gal
唾液酸
BHK
α1,6 α1,3
Fuc
++
0
α1,3 Gal +
SO4-
α2,
GalNAc
3
0
++
α2, 糖 基 等
分
6
化
GluNAc
0-
0
CHO
++
-
0
0
++ 0 +
0
鼠杂交瘤 ++
0
++
0
++ 0 +++ 0
C127
++
0
J558L
++
0
人淋巴细胞 ++
0
++
++
++
-
0
0
++ + +++ 0
.
5、动物细胞大规模培养工艺
大规模动物细胞培养的工艺流程如图11-15所示。工艺过程中，先将组织切成 碎片，然后用溶解蛋白质的酶处理而得到单个细胞，再用离心法收集细胞。将细 胞植入营养培养基，使细胞在培养基中增殖到覆盖瓶壁表面，用酶把细胞从瓶壁 上消化下来，再接种到若干培养瓶中进行扩大培养，将培养所得的细胞“种子” 冷藏于液氮中，从液氮中取出一部分细胞“种子”进行解冻、复活培养，进行扩 大培养以获得足够的细胞量，将细胞接种于大规模生物反应器中进行大规模培养， 按照产物的不同形式进行产物分离纯化。对于积累在细胞内的产物，可通过收集 细胞后进行破胞，再经过分离纯化获得产物；对于由细胞分泌到培养液中产物， 可以通过浓缩、纯化培养液来获得产品；而对于那些必须加入诱导剂进行培养或 病毒感染培养才能得到的产物的细胞，可加入上述诱导剂诱导或病毒感染后，收 集细胞，再经分离纯化得到产物。
有多种衍生突变株应用于药物的生产，培养时需要添加脯 氨酸。二氢叶酸还原酶缺陷株表达的药物有tPA、EPO、 HBsAg疫苗、G-CSF、凝血因子Ⅷ、DNA酶Ⅰ，已上市。
使用氨甲酰喋呤，增加外源基因的拷贝数，提高蛋白质表
动物细胞培养的应用
.
表1 动物细胞培养的产物
疫苗 人 动物
单克隆抗体 免疫调节剂 酶 激素
小儿麻痹症疫苗、狂犬疫苗、风疹疫苗、脑炎疫苗、疱疹疫 苗等
牛病毒性腹泻疫苗、牛痢疾疫苗、犬传染性肝炎疫苗、鸡痘 病疫苗、猪霍乱疫苗、牛疫狂犬疫苗、草鱼出血热疫苗
IgG、IgM、IgA等
β-细胞生长因子、干扰素、白细胞活化因子、血清胸腺因子、 白细胞介素、胸腺素、巨噬细胞毒力因子等
.
于是，人们认识到要把抗体应用于临床诊断或是治疗，必须要制备单一类型的 只对某一特定抗原决定簇的抗体分子，也就是单克隆抗体。
多克隆抗体
在一个血清样品中包含了对同一抗原分子上不同抗原决定簇的多种抗体。
单克隆抗体
由杂交瘤细胞系产生的针对某一特定抗原决定簇的单一类型的抗体。
.
补充
• 要根据糖基化的结构，选择适宜的细胞系 糖代谢特点，氨基酸代谢特点，选择适宜 的细胞系。
+ + +0
++
人垂体
++
0
0
+++ + + 0
++
Namalwa ++
0
0
0
人鼠杂交瘤 ++
0
0
.0
++ + -
-
+
+ ++ 0
内容（二）
动物细胞制药的表达系统与特征
昆虫系统、哺乳动物细胞系统，最成功、重要表达活 性外源蛋白的有效系统，应用于药物蛋白质的表达。 一、哺乳动物细胞表达系统与特征 1. 动物细胞的特征 细胞膜、 细胞质和细胞核，没有细胞壁。亚细胞器，功能独特。
.
2．哺乳动物细胞株系
CHO细胞：中国仓鼠卵巢中分离的上皮样细胞系，贴壁 型生长，是目前使用最为普遍和成熟的表达糖基化蛋白药 物的宿主细胞。核型为亚二倍体，分泌表达外源蛋白，而 内源蛋白分泌很少。贴壁型生长细胞，但可进行悬浮培养， 对剪切力和渗透压有较高的忍受能力。蛋白质翻译后的修 饰准确，表达产物的结构、性质和生物活性接近天然。