不同倍性黄瓜遗传差异的AFLP分析

西北植物学报,2006,26(11):2265-2269Acta Bot.Boreal.2Occident.Sin. 文章编号:100024025(2006)1122265205不同倍性黄瓜遗传差异的AFL P分析张晓青,陈劲枫3,雷　春,陈龙正,钱春桃,刁卫平(作物遗传与种质创新国家重点实验室,南京农业大学园艺学院,南京210095)摘　要:采用AFL P(Amplified f ragment length polymorphism)技术对黄瓜(Cucumis sativ us L.)品种‘津绿4号’的单倍体、二倍体和四倍体进行基因组DNA多态性比较。

结果表明:(1)从35对引物扩增获得2188条60～500bp 的条带,多态性位点仅有20个,占0.92%,其中22对引物组合扩增的不同倍性材料的A FL P指纹没有明显差异;(2)在多态性位点表现中,以二倍体的条带存在,单倍体和(或)四倍体的条带丢失为主,在四倍体中扩增出1条特异带;(3)与相应的二倍体相比,单倍体和四倍体有特异片段的消失和增加。

关键词:黄瓜;不同倍性;A FL P分析;遗传差异中图分类号:Q346+.5;S642.2文献标识码:AAFLP Analysis of G enetic Differences among CucumberMaterials with Different PloidiesZHAN G Xiao2qing,C H EN Jin2feng3,L EI Chun,CH EN Long2zheng,Q IAN Chun2tao,DIAO Wei2ping (State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,College of Horticulture,Nanjing Agricult ural University,Nanjing210095,China)Abstract:Haploid,diploid and tet raploid polymorp hisms of cucumber variety‘J unlü4’were compared by A FL P.It was shown t hat(1)2188bands ranging wit h60～500bp were amplified wit h35pairs of p rim2 ers.Only20polymorp hic loci were found which acco unted for0.92%and A FL P fingerp rint s amplified f rom t he materials wit h different ploidies wit h22of t he primer pairs did not remarkably differ;(2)The ex2 pression of t he polymorp hic loci showed t hat t he bands remained p resent in t he diploid material and t he bands become abscent in t he haploid and tet raploid materials in mo st cases and one specific band were am2 plified f rom t he teraploid material;(3)In cont rast wit h t he diploid material,t he haploid and tet raploid ma2 terials got t heir specific bands lo st or added.K ey w ords:cucumber;different ploidy;A FL P analysis;genetic difference 诱导二倍体染色体减半(或加倍)形成的单倍体(或四倍体)材料在作物改良研究中具有非常重要的价值。

形成的单倍体可用来探明其原始亲本的染色体组构成、物种的亲缘关系和物种进化研究[1]。

多倍体(如四倍体)在提高作物产量、改善品质和增加次生代谢物质含量等方面具有突出的优势。

随着染色体组成的倍增,从单倍体到多倍体等不同倍性材料的核质比例关系会发生变化,基因的剂量效应、互作效应等都会破坏原有生理生化功能的平衡,而使植株在器官大小、同工酶酶谱及光合指标等方面发生一系列的改变。

因此,探明各种倍性材料的遗传差异对倍性育种具有重要指导意义。

收稿日期:2006204220;修改稿收到日期:2006210210基金项目:国家自然科学基金项目(30470120,30671419)作者简介:张晓青(1979-),女(汉族),硕士研究生,主要从事蔬菜遗传育种与生物技术研究。

3通讯联系人。

Correspondence to:CH EN Jin2feng.E2mail:jfchen@不同倍性的研究在十字花科[2,3](Cruciferae)、禾本科[4](Gramineae)、葫芦科[5～7](Cucurbitaceae)及桑科[8](Moraceae)等植物中已报道,内容主要集中在形态、解剖结构、光合与生理指标的测定及细胞学特征观察和同工酶研究等方面。

不同倍性材料在DNA水平上的研究也有报道,但所得结论不一致。

焦锋等[8]利用RA PD技术分析了桑树二倍体和同源四倍体的DNA指纹,没有发现差异条带;而张有做[9]却发现四倍体DNA分子结构与二倍体相比有一定程度的改变,这与A FL P[10]和ISSR[11]的分析结果一致。

在金鱼草[12]、西瓜[13]等的研究中也发现二倍体和相应同源四倍体DNA指纹间存在差异。

目前的研究主要基于二倍体诱导形成的同源多倍体,而同时采用单倍体、二倍体、四倍体为试材进行比较研究的较少。

本实验在研究获得黄瓜单倍体、二倍体、四倍体的基础上,利用多态性检出较强的A FL P分子标记技术,对‘津绿4号’3种不同倍性材料的基因组DNA进行研究,以期探讨不同倍性材料之间基因组DNA的序列变化,为进一步开展黄瓜的诱变育种、基因表达调控等研究奠定基础。

1　材料和方法1.1　材　料供试材料为普通黄瓜‘津绿4号’(Cucumis sa2 ti v us cv.‘Jinlüno.4’,2n=2X=14),利用辐射花粉授粉结合幼胚拯救获得的单倍体(2n=X=7)[14],用秋水仙素水溶液处理二倍体‘津绿4号’萌动种子加倍而获得的同源四倍体(2n=4X=28)[15]。

不同倍性的黄瓜材料于2005年春季种植在南京农业大学园艺学院的试验农场。

1.2　AF LP分析1.2.1　黄瓜叶片D NA提取　于植株长至第5片真叶时,取刚展开的新叶用于基因组DNA的提取,方法采用CTAB法[16]。

1.2.2　黄瓜总基因组AF LP分析　AFL P分析主要参考Vos等[17]方法。

取0.5μg基因组DNA,采用EcoR I和Mse I进行双酶切。

酶切后与EcoR I和Mse I接头连接。

EcoR I接头:5′2CTCGT A GACTGCG2 T ACC23′和3′2CATCTG ACGCATGGTT AA25′,Mse I 接头:5′2G ACG ATG A GTCCTG A23′和3′2T ACT2 CA GG ACTCAT25′。

取5μL酶切连接产物为模板进行预扩增,预扩增引物为E00:5′2GACTGCGT AC2 CAATTC23′;M00:5′2G ATG A GTCCTG A GT AA23′。

预扩增产物1∶30稀释,作为选择性扩增的模板。

选择性引物组合共对,由8个带2个选择性碱基的EcoR I2NN引物和8个带3个选择性碱基的Mse I2 NNN引物组成(表1)。

取5μL选择性扩增产物在6%的变性聚丙烯酰胺凝胶(6%丙烯酰胺,0.32%甲叉丙烯酰胺,7mol・L-1尿素,1×TBE)中电泳分离。

采用银染法进行显影。

表1　AF LP选择性扩增引物序列Table1　Sequences of the selective amplification primers used in A FL P选择性引物Selective amplification primersE2AA5′2GACT GCGTACCAA T TCAA23′M2CA G5′2GA T GA GTCCT GA GTAACA G23′E2AC5′2GACT GCGTACCAA T TCAC23′M2CA T5′2GA T GA GTCCT GA GTAACA T23′E2A G5′2GACT GCGTACCAA T TCA G23′M2CTC5′2GA T GA GTCCT GA GTAACTC23′E2T G5′2GACT GCGTACCAA T TCT G23′M2CT G5′2GA T GA GTCCT GA GTAACT G23′E2A T5′2GACT GCGTACCAA T TCA T23′M2CT T5′2GA T GA GTCCT GA GTAACT T23′E2TC5′2GACT GCGTACCAA T TCTC23′M2CAA5′2GA T GA GTCCT GA GTAACAA23′E2T T5′2GACT GCGTACCAA T TCT T23′M2CAC5′2GA T GA GTCCT GA GTAACAC23′E2TA5′2GACT GCGTACCAA T TCTA23′M2CTA5′2GA T GA GTCCT GA GTAACTA23′1.3　数据统计与处理以“+”和“-”统计各位点条带的有无。

总条带数为单个位点扩增条带总数;多态性条带为3个倍性材料在同一位点上带型表现有差异的带;特异条带为不同倍性材料特有的条带。

单倍体(四倍体)缺失条带率(%)=单倍体(四倍体)缺失条带数/总条带数×100%。

2　结果与分析在‘津绿4号’黄瓜不同倍性材料中共筛选出35对引物组合,获得2188条位于60～500bp的片段,平均每对引物组合可扩增出62.5条带。

引物组合的不同,扩增出的条带数变化较大,最多的条带数达101条(E2TC/M2CAA),而最少的仅为28条(E26622西　北　植　物　学　报 26卷T G/M 2C T T )。

在扩增出的条带中,以单倍体、二倍体和四倍体的带同时存在为主(图1,A ),比例达99.08%(表2),表明单倍体、二倍体、四倍体3种不同倍性之间的A FL P 条带没有明显差异。