RACE试验流程
5'race具体方法和实验流程
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5’ Race protocol (standard rxn)
5’ Race protocol 5’ Race流程：5’ Race步骤：一、RNA提取：1.收集细胞：1500rpm常温离心10min收集杂交瘤细胞，细胞状态好，细胞数量为5-10×106。
2.裂解细胞：生理盐水洗涤一次，1500rpm离心10min将废液丢弃，按照5-10×106/ml的细胞加1ml Trizol混匀后，室温静止5min至细胞完全溶解。
3.萃取RNA：将上述液体移至经DEPC处理的Eppendorf管中，按照200µl/ml Trizol加入氯仿，充分振荡15s，室温放置2min。
4.分离水相：12000rpm低温4℃离心15min，吸取水相(上层无色液体)移入另一个DEPC 处理过的Eppendorf管中。
5沉淀RNA：加入等体积的异丙醇(约500µl/mlTrizol)沉淀10min，或-20℃过夜。
6.洗涤残留的异丙醇：将废液吸取丢弃，加入预冷的75%乙醇，洗涤5min。
7.计测浓度：7500rpm低温4℃离心5min，吸出水相，留沉淀晾干(5-10min)，用20-30µl DEPC水重悬，55℃-60℃孵育10min(取出1µl用电泳法粗检是,应有三条目的带)，测紫外分光光度计A260/280(比值在1.8-2.0为正常范围)每管3µg分装-20保存。
二、RNA的去磷酸化：1、去磷酸化酶37℃处理1h：（1）取总量10µg 的总RNA或者250ng的poly(A) RNA，按照下表中配比进行轻混匀。
（3）37℃孵育1小时。
2、终止去磷酸化反应，酚氯仿抽提，氯仿抽提：phenol:chloroform的结果要好。
（2）剧烈振荡30s，最高转速（≥10,000g）室温离心5min。
将水相（上层）转移到一个新管中。
（3）加入150µl的氯仿，剧烈振荡30s，最高转速（≥10,000g）室温离心5min。
5'race 的实验方法
2.2.3.3 5′ RACE 获得5′ 端序列根据已知的中间序列设计特异引物Cu3和Cu4，进行5′RACE PCR。
过程如下：1、cDNA纯化（1）取60μl反转录产物于1.5离心管中，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀。
（2）将（1）所得溶液加入吸附柱中，室温放置2 min，12000 rpm离心1 min，弃滤液。
（3）向将吸附柱中700 μl的漂洗液PW，12000 rpm离心1 min，弃滤液。
（4）向将吸附柱中500 μl的漂洗液PW，12000 rpm离心1 min，弃滤液。
（5）12000 rpm离心2 min，尽量除去漂洗液，将吸附柱开盖置于室温放置数分钟，彻底晾干。
（6）将吸附柱安置于新的1.5 ml的离心管中，向吸附柱膜的中央悬空加入30-50μl 的预热到60 ℃的洗脱缓冲液EB，室温放置2 min。
2000 rpm离心2min收集cDNA溶液。
2、cDNA的末端加尾（1）在1.5 mLEppendorf中配制下列反应液，全量为50 μl：纯化的cDNA 25 μl5×TdT Buffer 10 μl0.1%BSA 5 μl10mM dCTP(终浓度0.5mMd) 2.5 μlTdT 15 UddH2O Up to 50 μl（2）37℃反应10分钟。
（4）加入50 μl（等量）的氯仿/异戊醇（24：1），充分混匀。
（5）离心，取上层移至另一离心管中。
（6）重复步骤（4）。
（7）10000 rpm离心5min，取上层（水层）移至另一离心管中。
（8）加入125 μl（2.5倍量）的冷无水乙醇，-20 ℃放置1 h；10000 rpm，离心20min。
（9）沉淀用70 % 冷乙醇清洗沉淀，10000 rpm离心2min，真空干燥。
（10）加入20 μl ddH2O溶解DNA3、PCR扩增以纯化加尾的cDNA为模板，Cu3和AAP为引物，做第一轮PCR。
反应程序如下：10×LA PCR Buffer 2.5μlMgCl2(25 mM) 2.5μldNTP(各2.5 mM) 4μlAAP(10μM)1μlCu3 (10μM)1μlRT product 2μlLA Taq(5U/μl) 0.25μl灭菌ddH2O 11.75μlTotal Volume 25μl反应程序如下：94°C预变性5 min，然后进行以下循环，94°C变性60 s，56°C 退火60 s，72°C延伸45秒，共进行35个循环。
RACE技术原理
RACE的基本概念 不同厂家RACE试剂盒的介绍 RACE技术的关键环节
存在的问题及解决办法
RACE的基本概念
cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术是基于PCR技术由已知的部分
cDNA序列来获得完整cDNA序列的一种方法，
在PCR反应中有足够的全长产物能被探测。
TdT加尾反应及其替代反应
第三，若目的cDNA中含有与多聚尾互补的几个核苷酸同 聚区，则在合成第二条cDNA链时引物的延伸会从内部序 列而不是末端序列开始，产生非全长的第二条cDNA链。
我们所使用Invitron公司的RACE试剂盒，采用PCR介导的
连接反应，在一定程度上避免了以上的问题。
RACE试剂盒中末端转移的是多聚C尾，这样在反转录合 成第一链时5’端多聚G的二级结构影响反转录的彻底进行，
会产生提前终止反应。我们改进了加尾的程序，用TdT酶 加上多聚T尾，结果降低了反转录的难度，两个基因最终 均获得了完整的5’末端。
RACE引物的设计
在实验过程中总结如下经验：
1.
2.
引物不能设计在保守区简并引物区。
2.
反转录提前终止
模板中有特殊的二级结构，反转录提前终止。通过提高 反转录的温度，加大反转录的反应体系以及反转录过程 中一直保持已变性的RNA模板处于50℃以上，避免以解
开二级结构的RNA再恢复原来的结构，以达到5’末端。
提供一种改进的反转录方法
1. 2.
3. 4.
5. 6.
7.
在RNase-free的0.2 mL Eppendorf 管中加入以下成分： Oligo(dT)(0.5μg) 1μL Total RNA(4~5μg) 3μL DEPC-H2O To 25 μL 混匀，70℃保温10min；50℃保温5min；稍微离心一下。 在混合物中，依次加入以下成份： 10X SSⅡ（ SSⅢ ）Buffer 5.0μL 10mM dNTP mix 1.0μL 0.1M DTT 2.0μL RNase Inhibitor(40U/μL) 1.0μL DEPC-H2O To 24 μL 轻轻混合，在50℃保温5min后，在50℃下将3号管中的混合成分移入 2号管中。 每个反应加入1μL SuperScriptTM Ⅱ（SSⅢ ），轻轻混匀，50℃反应 50min。 70℃放置15min以终止反应。 -20℃保存。
RACE原理及实验步骤
3'-RACE 基本原理
3’ RACE流程图
先利用mRNA的3'末端的poly（A）尾巴作为一个引物结 合位点，以Oligo（dT）30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV 作用下，反转录合成标准第一链cDNA.利用该反转录酶具有 的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5'末端时自动加 上3-5个（dC）残基，退火后（dC）残基与含有SMART寡核苷 酸序列Oliogo（dG）通用接头引物配对后，转换为以SMART 序列为模板继续延伸而连上通用接头。然后用一个含有部分 接头序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作为上 游引物，用一个基因特异引物2（GSP 2 genespecific primer，GSP）作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板， 进行PCR循环，把目的基因5'末端的cDNA片段扩增出来。最 终，从2个有相互重叠序列的3'/ 5'-RACE产物中获得全长 cDNA，或者通过分析RACE产物的3'和5'端序列，合成相应引 物扩增出全长cDNA。
Southern blotting：
Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位 的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切 酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链 DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者 紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交， 用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含 量。
• 明显增加BD SMART RACE扩增的特异性 • 降落PCR的退火温度符合首次PCR循环的Tm 高于通用 引物的Tm 。 • 退火温度在随后降低到与通用引物相配合的程度，引起 特异性基因模版的指数和高效率的扩增。 • 当引物的T m>70°C时建议使用降落循环程序。
RACE-PCR
RACE-PCR实验步骤一、总RNA提取二、RACE-Ready cDNA合成1.准备Buffer混合物，每10微升体系所需如下，在Ep管内混合，离心，室温放置。
2.0微升5×First-Strand Buffer1.0微升DTT（20mM）1.0微升dNTP Mix（10mM）总体积4.0微升2.在独立的Ep管内加入试剂如下，3'RACE和5'RACE分开5'RACE1.0-2.75微升RNA1.0微升5'-CDS Prime A1.75-0 微升DEPC水总体积3.75微升3'RACE1.0-3.75微升RNA1.0微升3'-CDS Prime A2.75-0微升DEPC水总体积4.75微升混匀，简单离心。
3.72℃孵育3分钟，42℃2分钟，14000g离心10秒。
4.在5'RACE cDNA合成反应体系中，加入1微升SMARTer IIA oligo，混匀并简单离心。
5.准备如下的Master Mix，在室温下以如下顺序加入：4.0微升Buffer Mix（第一步配制）0.25微升RNase Inhibitor（40U/微升）1.0微升SMARTScribe TM Reverse Trascriptase（100U）总体积5.25微升6.在步骤3和4中得到的RNA混合液中加入5.25微升Master Mix，得到总体积10微升，小心混匀并离心。
7.42℃孵育90分钟，70℃10分钟终止反应。
8.加入100微升Tricine-EDTA buffer稀释，保存于-20℃。
三、RACE1.准备PCR Master Mix，如下是50微升体系所需的Master Mix34.5微升PCR-Grade Water5.0微升10×Advantage 2 PCR Buffer1.0微升dNTP Mix（10mM）1.0微升50×Advantage 2 Ploymerase Mix总体积41.5微升混匀，离心。
【良心出品】3,5RACE流程
【良心出品】3,5RACE流程这个文件我看了，其实和普通的cDNA第一链的合成、PCR扩增技术步骤相似！只是引物不同罢了3’端的克隆（3’ RACE）1.2.3.1 特异性引物设计和合成根据测序的Na+/H+逆向转运蛋白基因核心片段设计3’端基因特异引物P3（外侧引物）、P4（巢式引物），分别与GeneRacer TM Kit提供的3’ Primer（3’P）、3’ Nested Primer（3’NP）配对，分别用于外侧PCR扩增和巢式PCR扩增。
P3、P4由上海生工合成。
P3：5’-CTGTATTCTTCTGTGGGATTGTGATG-3’P4：5’-TGGGATGGATGCTTTAGACATTGAG-3’3’P：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’3’NP：5’-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3’1.2.3.2 cDNA第一链的合成（1）200μl PCR管置于冰上，依次加入下列组分：Total RNA 8μl Oligo dT Primer（0.82μg·μl-1）1μl dNTP Mix （25mmol·L-1）1μl RNase-free ddH2O 3μl （2）轻轻混匀，瞬时离心收集液体。
（3）65℃温育5min，置于冰上冷却1min，瞬时离心收集液体。
（4）于冰上依次加入下列组分：5 First Strand Buffer 4μlDTT（1mol·L-1）1μlRNaseOut?（40U·μl-1）1μl SuperScript? III RT（200U·μl-1）1μl （5）轻轻混匀，瞬时离心收集液体。
（6）50℃温育1h。
（7）70℃温育5min以终止反应，置于冰上冷却2min，瞬时离心收集液体。
（8）加入1μl RNase H (2U·μl-1)。
（9）37℃温育20min，瞬时离心收集液体，即可用于3’外侧PCR扩增或-20℃保存备用。
RACE步骤
1）RNA 提取采用试剂Trizol Reagent (购自invitrogen 公司)2）氯仿；异丙醇；70 % 乙醇；0.1 % DEPC；DEPC 处理的超纯水(2) 聚合酶链式反应（PCR）、核酸电泳试剂1) Tris-硼酸储存（5×TBE）缓冲液：54g Tris 碱，27.5 g 硼酸，20 ml 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)溶于1000 ml 水。
2) 溴化乙啶（10 mg/ml）:100 ml 水中加入1 g 溴化乙啶，磁力搅拌数小时至溶解，避光保存3）点样缓冲液Loading buffer(10×): 0.25 %溴酚蓝，40 %甘油。
4）Ex Taq DNA Polymerase（TaKaRa），琼脂糖DNA 胶回收试剂盒(北京天根生物公司)5）DNA Makers：DL2000，DNA Maker Ⅲ6) 特异引物（上海生工合成）7) 5'RACE 试剂盒购置大连宝生物工程有限公司(3) 目的基因鉴定、培养基及培养液1）液体培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0g，调pH 至7.0，定容至1L，高压灭菌。
2）固体培养基：加琼脂15g/L，高压灭菌。
3）氨苄50μg/mL；IPTG 25 mg/mL；X-Gal 25 mg/mL 溶于DMF 中4）5×KCM 溶液3.73 g KCl，2.21 g CaCl2，5.08 g MgCl2，定容至100 ml。
总RNA 的提取实验用品的处理：离心管、枪头等塑料制品用0.1 % DEPC于37 ℃浸泡2h，和0.1 %的DEPC 水高压灭菌30min，研体、剪刀、镊子、容量瓶等180℃烘烤6h。
1）称取100 mg小麦叶片，液氮研磨至粉末状，迅速转入含1mL Trizol的1.5 ml离心管中，混匀，室温下静置5 min。
2）加0.2 ml氯仿，剧烈振摇15 sec，20 ℃静置3 min。
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RACE
一．第一链合成，总RNA 10ng—1ug 反转录
1．准备如下5’和3’—RACE-Ready cDNA反应管，量多加1管，以下10ul体系。
2．
5×First-strand Buffer 2.0ul
DTT 1.0ul
DNTP Mix 1.0ul
Total V olume 4.0ul
2.另外管准备如下5’和3’反应液
5’RACE Ready cDNA 3’RACE Ready cDNA
1.0-
2.75ul RNA1.0-
3.75ul RNA
1.0ul 5’-CDS PrimerA1.0ul 3’-CDS PrimerA
3.在第二步中加灭菌水（ddH2O）使5’RACE Ready cDNA 终体积为
3.75ul，3’RACE Ready cDNA终体积为
4.75ul
4.混匀及短暂离心
5.在PCR仪上72℃温育3min，42℃2min，冷却后14000离心20s，收集下部液体（这部可预备step7：Marster Mix）
6.5’RACE Ready cDNA加1ulSMATⅡoligo
7.准备足够Master Mix为5’ 3’RACE合成，室温顺序混匀以下反应液：
Buffer Mix （from step1）4.0ul
RNA inhibitor（400V/ul）0.25ul SMARTseribe TM Reverse Transcriptase（100V） 1.0ul
Total V olume 5.25ul
8.将step7的Master Mix加到step5的3’—RACE—Ready cDNA和step6的5’终体积10ul
9.移液枪吸打混匀，短暂离心收集与管底
10．42℃温育90min（热盖PCR仪）
11.70℃，10min
12.用Tricine-EDTA Buffer稀释第一链反应产物
总RNA≤200ng，加20ul Tricine—EDTA buffer
RNA≥200ng，加100ul
PolyA RNA，加250ul
13.-20℃≤3 months。