猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定与药敏试验
猪传染性胸膜肺炎的实验室诊断
猪传染性胸膜肺炎的实验室诊断摘要:采用生化试验､间接血凝试验对送检的疑似猪传染性胸膜肺炎病猪的病料及血清进行诊断和药敏试验｡结果表明,从病猪肺脏中分离到1株疑似胸膜肺炎放线杆菌,其革兰氏染色为阴性球杆菌,在普通营养琼脂和麦康凯培养基上不能生长,在TSA平板上形成不透明的淡灰色､湿润､光滑､表面隆起的菌落,血凝试验为阳性,确定所分离菌为胸膜肺炎放线杆菌｡同时对该猪群随机抽检12份血样,用猪胸膜肺炎间接血凝试剂盒检测胸膜肺炎抗体,其阳性率为8.3%｡药敏试验表明,磺胺间甲氧嘧啶钠和长效痢清为敏感药物｡关键词:猪胸膜肺炎放线杆菌;细菌分离鉴定;血凝试验;药敏试验The Laboratory Diagnosis of Porcine Contagious PleuropneumoniaAbstract: The biochemistry test and indirect hemagglutination test were used to check the samples and serum of pigs suspected as porcine contagious pleuropneumonia (PCP) The results indicated that a suspected Actinobacillus pleuropneumoniae was isolated from the pig lung. It was Gram staining negative coccobacillus, and could not grow in ordinary nutrient agar and McConkey＇s agar. It could grow and form a opaque ocean grey, moist, smooth conoly with upheaval at surface in TSA plate; and the hemagglutination test was positive. It was confirmed that the isolated bacterium was Actinobacillus pleuropneumoniae. 12 blood samples were randomly selected and examined by PCP indirect hemagglutination assay kit. The results indicated that the positive ratio of PCP antibody was 8.3%. The result of susceptibility test indicated that sulfamonomethoxine sodium and long-acted Liqing were sensitive drugs.Key words: Actinobacillus pleuropneumoniae; isolation and identification of bacteria; hemagglutination test; susceptibility test猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的一种高度传染性的呼吸系统疾病｡该病以急性出血和慢性纤维素性胸膜肺炎为特征,具有较高的发病率和致死率[1]｡随着集约化养猪业的迅猛发展,国家及地区间引种频繁,导致该病的发病率及死亡率大大提高,耐药性问题导致的治疗失败,给世界各地的养猪业带来了极大的经济损失[2,3]｡本试验对河南省新乡市某猪场的发病猪病料进行了细菌分离鉴定､血清学检测及药敏试验,旨在为该病的诊断与治疗提供科学依据｡1材料与方法1.1材料1.1.1试剂麦康凯琼脂培养基､普通营养琼脂培养基､羊鲜血琼脂平板､巧克力琼脂平板､胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)､草酸铵结晶紫､革兰氏碘液､石碳酸复红染液由河南科技学院临床兽医学教研室提供;APP间接血凝抗原､标准阳性血清､标准阴性血清､稀释液由中国农业科学院兰州兽医研究所提供;金黄色葡萄球菌由河南科技学院预防兽医教研室提供;药敏试验所用药物均由河南科技学院兽医院提供｡1.1.2仪器HH.B11恒温培养箱(厦门建红医疗器械厂),75-2型微量振荡器(江苏金坛设备有限公司),OLYMPUS—CH显微镜(Japan),HG101-2A电热鼓风干燥箱(南京实验仪器厂)｡1.1.3病料河南新乡市某猪场送检的疑似病猪病料10份及病猪血清2份｡1.2方法1.2.1细菌的分离与培养对病死猪进行病理剖检,观察各个器官的病变｡无菌采取疑似PCP病变肺组织,在TSA培养基上接种培养,观察菌落生长情况,挑取可疑菌落涂片､革兰氏染色､镜检[4]｡1.2.2生化培养特性鉴定将分离到的可疑菌落,分别接种于加入0.01% NAD的羊鲜血琼脂平板､巧克力琼脂平板､麦康凯琼脂平板､普通营养琼脂平板,于37 ℃培养24 h,观察菌落在各个培养基的生长情况｡将可疑菌平行接种布满整个不含V 因子的普通营养琼脂培养基,再在其上垂直划线接种2条金黄色葡萄球菌,37 ℃培养24 h,观察卫星现象｡无菌状态下,用接种针取分离菌纯培养物,分别接种于加有0.01%NAD的生化反应管中,置于培养箱中37 ℃培养24 h,观察其生化特性｡1.2.3间接血凝试验12份抽检血清和被检血样的处理:将送检病猪的血样静置,析出血清,在使用前置于56 ℃水浴锅中灭能30 min,4 ℃保存待检｡APP间接血凝抗原的处理:用灭菌生理盐水10 mL稀释摇匀,1 500 r/min离心10 min,弃上清液,加等量的稀释液摇匀,置4 ℃冰箱24 h后使用｡将冻干标准阳性血清和标准阴性血清按试剂盒说明使用,混匀后作对照｡具体操作步骤参见文献[5]｡判定标准:“++++”表示100%血球凝集,红细胞全部凝集,形成一层均匀的膜,布满整个孔底;“+++”表示75%血球凝集,红细胞在孔底形成一层薄膜,但面积比前者小;“++”表示50%血球凝集,红细胞在孔底形成薄膜凝集,边缘松散或呈锯齿状;“+”表示25%血球凝集,红细胞在孔底呈稀薄散在少量凝集,孔底有小圆点;“-”表示不凝集,红细胞全部沉于孔底,边缘光滑｡以出现50%红细胞凝集的最高稀释倍数判定为该血清的凝集价(效价)[6]｡判定条件:在阳性对照血清滴度不低于1∶128,阴性对照孔血清除第一孔允许存在前滞现象(+)外,其余各孔及稀释液对照孔均为“-”的前提下,对待检血清进行判定,否则重试｡待检血清的判定标准:检测血清抗体效价≥1∶8判为阳性,效价≤1∶4为阴性｡1.2.4药敏试验将分离菌在巧克力琼脂平板上均匀划线接种,按常规纸片法将药敏纸片贴在平板上,置于恒温培养箱24 h,观察并测量抑菌圈的大小,判定不同药物的敏感程度｡判定标准:抑菌圈直径≥20 mm为高度敏感(+++),直径10~20 mm 为中度敏感(++),直径≤10 mm为低度敏感(+),无抑菌圈为不敏感(-)[7]｡2结果与分析2.1细菌的分离与培养在TSA平板上形成不透明､淡灰色､湿润､光滑､表面隆起的菌落,挑取单个可疑菌落镜检观察,有革兰氏染色呈阴性的小球杆菌｡病理剖检结果:剖检病猪可见其肺脏表面有纤维素性物质附着,并与胸壁和膈肌粘连,胸腔有黄色积液,心包外膜附着有纤维素性物质,心包积液,颌下淋巴结肿大,肝脏和肾脏未见异常｡2.2生化培养结果分离菌株在巧克力琼脂平板上37 ℃培养24 h后,形成湿润､浅灰色隆起､直径0.5~0.8 mm的圆形菌落;在麦康凯和普通营养琼脂平板上不生长;在羊鲜血琼脂平板上有溶血现象｡在靠近金黄色葡萄球菌的地方,可疑菌生长较多,远离划线处则生长较少,表明其对V因子有依赖性｡该菌能发酵葡萄糖､甘露糖､蔗糖､果糖,不能发酵甘露醇,尿素酶试验呈阳性,产生硫化氢气体,靛基质试验呈阴性｡综合以上试验结果,可确定该分离菌为胸膜肺炎放线杆菌｡2.3血清学诊断结果血清学诊断结果表明,被检病猪的血清抗体效价均大于1∶8,可确定为阳性｡抽检的12份猪血样中,血凝效价在1∶8以上的有1份,在1∶8以下的有11份,其阳性率为8.3%｡2.4药敏试验结果药敏试验结果见表1｡由表1可以看出,该菌对磺胺间甲氧嘧啶钠高敏,对长效痢清中敏,对强效头孢､头孢噻呋､青霉素钾､氨苄青霉素､氟苯尼考､阿莫西林等不敏感｡3讨论引起猪呼吸系统疾病的病原较多,有些胸膜肺炎病原还能激发或伴发其他疾病如巴氏杆菌､副猪嗜血杆菌､猪放线杆菌的感染[5]｡该病的临床症状缺乏特征性,仅靠纤维素性胸膜炎､胸肺粘连等病变不能准确诊断,PCP病例并不一定都表现为纤维素性胸膜肺炎,有的表现为肺部充血､水肿[8]｡因此对猪传染性胸膜肺炎的确诊必须依靠恰当的实验室诊断技术｡APP在生长过程中对营养及环境要求较高｡TSA培养基营养丰富,对于嗜血菌的培养率非常高,现引入到APP的分离培养中,效果很好｡同时,因该菌与其他杂菌混合感染的时候,细菌的分离更加困难,建议选取未经用药的病猪或濒死猪进行分离,其分离率较高,分离时应严格无菌操作,防止杂菌的污染｡本试验采用血凝试剂盒进行检测,结果病死猪的PCP抗体效价均在1∶8以上,该猪群未进行过免疫,说明该猪群感染了APP｡加上各地流行病株的血清型各有差异,没有通用疫苗进行免疫,目前多数猪场仍以药物控制作为预防和治疗的主要手段,但APP易产生耐药性,且部分敏感猪在感染后短时间内发生不可逆转的肺组织病变,因此猪场兽医应对APP的感染情况有充分的认识,必要时可定期分离病原进行体外药敏试验,以便早期进行预防[9]｡参考文献:[1] 吴家强,崔锦鹏, 张秀美, 等. 猪接触传染性胸膜肺炎研究进展[J]. 畜牧与兽医,2002,34(10):36-39.[2] 张立昌.猪传染性胸膜肺炎研究进展[J]. 养猪,2001(1):40-42.[3] 陈海平,蔡金洲,张辉,等. 猪嗜血杆菌胸膜肺炎的流行和防制[J].养猪,1995(1):34.[4] 陈小玲,杨旭夫,朱士盛.猪传染性胸膜肺炎的流行现状和防制措施[J].中国兽医杂志,2001,37(7):33-35.[5] 姚火春.兽医微生物实验指导[M].北京:中国农业出版社,2001. 30-50.[6] 刘慧芳,刘江梅,余旭平.猪传染性胸膜肺炎鉴别诊断方法[J].上海畜牧兽医通讯,2006,25(5):52-53.[7] 蔡宝祥.家畜传染病学(第三版)[M].北京:中国农业出版社,1996.144-145.[8] 陆承平.兽医微生物学(第三版)[M].北京:中国农业出版社,2001.[9] 王天有,刘保国,赵恒章.猪传染病现代诊断与防治技术[M].北京:中国农业科学技术出版社,2005.40-179.。
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的血清型鉴定与药敏试验
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的血清型鉴定与药敏试验摘要:从江苏泰州地区疑似猪传染性胸膜肺炎发病猪采集病料,经细菌分离培养得到了3株分离株TZA1､TZA2和TZA3株｡经形态学检查､CAMP试验､生化试验和血清型鉴定,确定TZA1株和TZA2株为血清1型,TZA3株为血清3型｡药敏试验显示,3株分离菌株对恩诺沙星､阿齐霉素､头孢唑肟高度敏感｡关键词:猪胸膜肺炎放线杆菌;血清型鉴定;药敏试验胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是革兰氏阴性､有荚膜的多形球杆菌,有时呈线性,无鞭毛,不运动,不形成芽孢｡根据培养时是否需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD,又称V因子),可将APP分为生物Ⅰ型和生物Ⅱ型,生物Ⅰ型为NAD依赖株,包括血清型1~12 型和15 型,生物Ⅱ型的生长不依赖NAD,但需要其他特定嘌呤或嘌呤前产物以辅助生长,含有2个血清型,为血清型13和14[1]｡猪感染APP后的疾病是猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumia,PCP),急性暴发时有很高的发病率和死亡率｡一些病猪康复后常伴有慢性肺炎,导致生长停滞且长期带菌而成为其他猪的传染源,此病给养猪业造成较大的经济损失[2]｡本研究从江苏泰州地区部分规模猪场临床表现为胸膜肺炎的病料中进行病原分离和血清型鉴定,并对分离菌株进行药敏试验,以期为泰州地区猪传染性胸膜肺炎的防控､净化提供理论支撑｡1材料和方法1.1材料PPLO琼脂和NAD购于扬州市广陵区全球通实验用品销售中心;犊牛血清购于杭州四季青生物工程有限公司;常规培养基､生化试剂和药敏纸片(氟苯尼考和强力霉素为自制)购于杭州天和微生物试剂有限公司;APP 1､3､5､7､9型阳性血清购于中国农业科学院兰州兽医研究所;金黄色葡萄球菌为本实验室保存;待检病料采集于泰州市规模猪场的疑似猪传染性胸膜肺炎的病猪｡1.2试验方法1.2.1细菌的分离培养与形态观察取死亡猪的气管分泌物和肺脏作涂片,革兰氏染色,镜检;同时取病料接种于含2% NAD的PPLO琼脂平板,在5%~10% CO2条件下,37 ℃培养24 h｡然后挑取可疑菌落涂片,镜p1.2.4药敏试验检测分离菌株对氟苯尼考､强力霉素､复方新诺明､丁胺卡那霉素､恩诺沙星､氨苄西林､头孢唑肟和阿奇霉素8种抗生素的敏感性｡将保存好的菌液(浓度稀释到1.5×108个/mL) 均匀涂布在PPLO琼脂上, 然后将药敏纸片贴在平皿上,培养24 h后观察结果,并按抗菌药物药敏试验判定标准判定分离菌株对不同抗生素的敏感程度[4]｡1.2.5菌株血清型鉴定将纯化培养的分离菌株37 ℃培养24 h,用生理盐水洗下,制成生理盐水细菌悬液｡取1滴APP可疑菌株分别与APP 1､3､5､7､9单因子标准阳性血清均匀混合,按照常规方法进行平板凝集试验,观察结果｡2结果2.1细菌的形态特征病料涂片以及分离纯化菌革兰氏染色､镜检,都可见有革兰氏阴性､多形态的细菌,多为球杆菌､短杆菌､偶有成丝状的细菌,着色不均｡2.2分离菌的培养特性3株分离菌在加入2% NAD的PPLO固体培养基上培养24 h,可见1~2 mm､露珠状､半透明的菌落｡2.3CAMP试验3株分离菌在靠近金黄色葡萄球菌的地方出现明显的溶血区域,即CAMP试验阳性｡2.4生化试验3株分离菌均呈卫星现象,可水解尿素酶,发酵乳糖､果糖､葡糖糖,不发酵甘露醇､山梨醇､鼠李糖及阿拉伯糖｡靛基质､甲基红､V-P试验均为阴性｡硝酸盐还原试验阳性,生长需要NAD｡2.5血清型鉴定TZA1株､TZA2株与APP 1型阳性血清发生强烈的凝集发应,鉴定为血清1型;TZA3株与APP 3型阳性血清发生强烈的凝集发应,鉴定为血清3型｡3株菌株与生理盐水和其他血清型的阳性血清未见凝集现象,结果见表1｡2.6药敏试验TZA1和TZA2株对恩诺沙星和阿奇霉素极度敏感｡TZA3对头孢唑肟极度敏感｡3株分离菌对氟苯尼考､丁胺卡那霉素､强力霉素中度敏感,对复方新诺明和氨苄西林低敏,结果见表2｡3小结与讨论3.1APP分离胸膜肺炎放线杆菌营养要求高且受外界影响因素较多,初次比较困难｡在分离的过程中,对于病死猪最好在刚死亡或频临死亡时采集病料,否则,即使病料中有APP感染,也会因猪死亡时间长,致使病料中APP死亡[5]｡应在初次分离培养的培养基中加入NAD,否则APP在常规培养基中大多不生长或生长不良｡本次分离选择加入NAD的PPLO琼脂培养基,成功分离到了3株APP菌株｡3.2APP血清型鉴定胸膜肺炎放线杆菌在不同国家和地区流行菌株的血清型有所不同[6]｡研究表明,我国流行的猪传染性胸膜放线杆菌血清型以1型､3型､7型为主[7]｡因此,本试验选用胸膜肺炎放线杆菌标准单因子阳性血清1､3､5､7､9型为鉴定标准,结果从泰州地区规模猪场分离到的3株APP菌株,血清分型试验鉴定TZA1和TZA2为血清1型,TZA3为血清3型｡本次试验基本摸清了泰州地区APP流行菌株的优势血清型,为本地区猪场猪传染性胸膜肺炎的免疫预防奠定了基础｡3.3APP药敏试验药敏试验结果表明,3株分离菌对同种药物的敏感性有较大差异,其中TZA1和TZA2两个分离株对恩诺沙星和阿奇霉素极度敏感,而TZA3株对头孢唑肟极度敏感｡本药敏试验筛选出的恩诺沙星､阿奇霉素､头孢唑肟和氟苯尼考可作为治疗本地区PCP的首选药物｡研究表明,多种抗菌药物对该菌的治疗效果不理想[4]｡兽医临床上常选用的氟苯尼考和强力霉素等药物敏感性不高,究其原因可能是这些抗生素的大剂量､不规范使用导致临床上耐药性的产生｡建议规模化猪场在防治PCP时最好通过药敏试验选用敏感度较高的抗生素,以最少的投入获得较大的经济效益｡参考文献:[1] 唐文山,李昕.猪传染性胸膜肺炎研究进展[J]. 动物医学进展,2008,29(2):98-102.[2] 徐公义,王海丽, 葛长城, 等. 猪传染性胸膜肺炎的诊断与治疗[J].中国畜牧兽医,2008,35(5):106-107.[3] 马晓平,彭广能,曹三杰,等.猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的初步分离鉴定与诊治体会[J].中国兽医杂志,2008,44(2):75-76.[4] 何启盖,王贵平,刘军发,等.猪胸膜肺炎放线杆菌分离鉴定及药敏试验[J].中国预防兽医学报,2003,25(5):360-363.[5] 雷连成,华芳,王丽哲,等.猪胸膜肺炎放线杆菌分离鉴定与毒力测定[J].中国兽医学报,2008,28(4):359-362.[6] 冼琼珍,黄耿森,叶润全,等.血清6型猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离与鉴定[J].黑龙江畜牧兽医,2007(5):70-72.[7] 逯忠新,柳纪省,赵萍,等. 猪传染性胸膜肺炎血清抗体检测[J].中国兽医科技,2001,31(3):16-17.[8] 余光勇,郭万柱,徐志文,等.一株四川株猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定[J].黑龙江畜牧兽医,2008(6):62-64.。
猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定
猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定作者：华芳来源：《农家科技下旬刊》2018年第02期摘要：从本地疑似感染猪传染性胸膜肺炎病猪处进行材料收集，然后在巧克力琼脂平板上进行分离培养，最后得到三株细菌，将其分别命名为X-1、X-2、X-3。
对相应的细菌依次进行生化特征检测、卫星生长现象分析、尿素酶实验鉴定、CAMP试验，其均表现出猪胸膜肺炎放线杆菌的典型症状。
药敏试验结果为分离菌株对硫酸慶大霉素、四环素、氨苄西林、诺氟沙星具有高度敏感性。
关键词：猪传染性胸膜肺炎；猪胸膜肺炎放线杆菌；分离鉴定猪传染性胸膜肺炎具有一定的散发性，常发生于仔猪断奶期间，会降低仔猪免疫力，进而导致仔猪败血症等病症，极大地增加了仔猪死亡率。
对于成年种猪而言，其在感染猪胸膜肺炎放线杆菌之后会表现出关节炎、肺炎、体温上升、食欲下降等情况，甚至引发心内膜炎、肾炎等其他病症，甚至死亡。
一、材料与方法1.材料制作本文所使用的巧克力琼脂平板、麦康凯琼脂平板、鲜血琼脂平板、普通琼脂平板均为实验室自行制作；而药敏纸片、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸均来自杭州某公司。
肺脏病变组织及扁桃体样本采自某规模养猪场，此规模养猪场内病猪具有典型呼吸道疾病病症。
实验动物为18g左右的小白鼠，均采购于当地实验动物机构。
2.方法实施本次实验主要包括细菌分离培养、细菌鉴定两个环节。
其中细菌分离培养需要将肺门淋巴结、肺组织、气管等组织器官无菌取样，并依次接种在所制作的巧克力琼脂平板上，在接种完毕之后利用鸡表皮葡萄球菌进行十字化线，最后在8%二氧化碳培养箱内培养， 36.5℃，培养36小时。
细菌鉴定工作首先选择巧克力琼脂平板上的单一可疑菌落，在依次进行涂片、革兰氏染色后进行镜检观察细菌状态；其次依次将所得到的细菌接种在鲜血琼脂平板、普通琼脂平板、麦康凯琼脂平板上，在36.5℃的二氧化碳培养箱内培养36小时；再次将1%血红素作为X因子、1%NAD作为Y因子，进行无菌涂片工作并将其涂布在普通培养基培养；最后依照相关规定对其进行尿素酶、卫星现象、糖发酵等生化特性检验。
广东省猪传染性胸膜肺炎放线杆菌分离鉴定及耐药表型和耐药基因检测与分析
生化试验、PCR 扩增等方法进行病原菌分离鉴定和测序分析,随后对分离株进行药敏试验 并 通 过 PCR 检 测 其 耐 药
基因,确定其耐药表型和耐药基因的携带率,分析比较两者的一致性。【结果】分离菌需在含有血 清 和 NAD 的 培 养
板中生长;革兰氏染色结果显示分离菌为红色,可判定为 革 兰 氏 阴 性 细 菌,通 过 生 化 试 验、PCR 结 果 及 测 序 分 析 确
resistancegenesornewdrugresistancemechanisms. Keywords:porcinecontagiouspleuropneumia;Actinobacilluspleuropneumoniae (APP);isolation andidentification;drugresistancephenotype;drugresistancegenes
amplificationandother methods.Thenthedrugsensitivitytestwascarriedoutontheisolated strains,andtheirdrugresistancegenesweredetectedbyPCRtodeterminetheirdrugresistance phenotypeandthecarryingrateofdrugresistancegenes,andtheconsistencybetweenthem was analyzedandcompared.【Result】Theisolatesneededtobegrownincultureplatescontaining serumandNAD.Gramstainingresultsshowedthattheisolatedbacteriawerered,whichcouldbe determinedas Gram-negative bacteria.Through biochemicaltest,PCR resultsandsequencing analysis,20strainsofAPP wereisolated,anddidnotshow obviousregionalcharacteristics.All strainsshowed multipledrugresistance,andabout50% ofthestrainsshowed8or moredrug resistance.The drug resistance rates to tetracyclines,sulfonamides,chloramphenicols and macrolideswere77.5%,65.0%,55.0% and48.8%,respectively.Furtheranalysisshowedthat the isolated bacteria were mainly resistant to tetracycline,sulfaisoxazole,florfenicol and lincomycin,butsensitivetocefazolin (PioneerV)andazithromycin.blaCMY,aph(2″)-Ⅰb,sul1, sul2,sul3,tetA,tetB,tetM,tetO,tetRandfloR weredetectedin23maindrugresistancegenes,and thecarryingrates were85%,85%,50%,60%,75%,30%,100%,85%,100%,70% and80%, respectively.Noquinolones,macrolidesandlincomycinrelatedresistancegenes weredetected. 【Conclusion】APPisolatedfrom pigsin Guangdongprovinceshowedextensivedrugresistance
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离培养及药敏试验
中图分 类号 ：８８２ 文 献 标 识 码 ： ￥５． ８ Ｂ
文章 编 号 ：０ ８ ０ １（０ ８ ３ ０ ５— ２ １０ — ４４２ ０ ） — ０ ６ ０ ０
摘 要 对 从 湖 南 永 州 市 ３ 多 个猪 场 送 检 的 疑 似 猪 传 染 性 胸 膜 肺 炎 ０
的 病 猪 中， Ｐ Ｏ培 养 基进 行 了胸 膜 肺 炎 放 线 杆 茵 的分 离 。 测 定 了该 茵 用Ｐ Ｌ 并 的 培 养特 性 、 病 性 和 对 药物 的敏 感 性 。结 果 成 功 分 离到 了１ 株 胸 膜 肺 炎 致 ５ 放 线 杆 茵 ， 茵 对 先锋 霉 素和 氯 霉素 较 敏 感 。 该
关键 词 胸膜肺 炎放线杆菌 分 离鉴定 药敏试验
体水平基本一致且 整齐 。并 均处于保
护 水 平 以下 。 ２２ 猪 瘟 免 疫 抗 体 效 价 ．
猪 接 触 传 染 性 胸 膜 肺 炎 （ ｏｃ ｅ 敏 试 验 ． 告 如 下 ： Ｐｒｉ ｎ 报 试验 各组猪 瘟免疫 抗体效 价见 表１ Ｃ ｎａｉ ｓｐ ｕｏｎｕ ｎａ） 前 称 为 猪 。 ｏｔｇ ｕ ｌ ｒｐｅ ｍｏｉ 以 ｏ ｅ ｅ
猪高热病高发时期 ，检测数据不齐或 和 胸 肺 炎 为 特 征 的传 染 病 ， 要 特 征 在 急 １２１ 病 原 菌 分 离 纯 化 和 液 体 培 养 ： ．． 无 主 未再继续检测 ） 。
２４ 分 组 免疫 比较 ．
．
咽 接 性 期 表 现 为 体 温 升 高 、严 重 的 呼 吸 困 难 、 菌 取 濒 死 猪 肺 、 喉 扁 桃 体 等 组 织 。
试 验 前 每 组 采 集 血 样 ３ ， 别 检 份 分
测猪 瘟 和 口蹄 疫 抗 体 效 价 。 果 ８ ２ 结 组 ４ 份 血 样 中 ．猪 瘟 效 价 为 １８ １ 份 ． ：的 ６ 效 价 为 １ 的８ ，平 均 效 价 为 ２６１ｇ ： ： ４ 份 ． ｏ２ ７ 口蹄 疫 母 源 抗 体 效 价 １１ 的２ 份 ． ： ６ ３ 平 均 为 ３ ６ｏ２ 可 见 各 组 两 病 的母 源 抗 ． １ｇ ． ９
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离和鉴定
嘌呤 二核苷 酸 ） 为两个 生物 型 。生物 Ｉ （ ｉｔｐ 分 型 ｂｏｙ ｅ Ｉ） ＮＡＤ依 赖 型 ， 为 １ 个 血清 型 ， 胸 膜肺 炎 为 分 ２ 与 嗜血 杆 菌相 似 ； 物 Ⅱ型 （ ｉｔｐ Ⅱ） 生 ｂｏｙ ｅ 为非 Ｎ ＡＤ 依
赖型 ， 为 ２ 血清 型 ， 分 个 即原 类溶 血 巴氏杆 菌 。本文 主要讨 论 ＮＡＤ依 赖 型 ＡＰ Ｐ。 由于 ＡＰ Ｐ对 营养要 求 很严 格 ， 在普 通 培养 基上 不生 长 ， 血平 板 上生 长不 良， 在 因此要 制备 营养 丰 富
｛ 刍 务 霉 刍曼皇 圭 皂 ￡ 刍 刍 是 ｛ 要 ￡ 圭 ｇ ￡｛ ｅ皇 呈刍ｇ皇 刍 ￡ 旦 刍 刍 刍 ￡ ￡ 是刍 ｇ
水 ２ ｇ饮水 。及 时 清理 粪便 ， 舍 喷雾 消毒 ， 料 ０ｋ 鸡 饲 中添 加多 种维 生 素 。５天后 ， 亡 停止 ， 鸡 恢 复很 死 病
表 现 出黄绿 色 的局 限性 圆形 下陷 坏死 灶 ． 大小 不一 。
有 的连 成一 片 。
４ 诊 断 采集 新鲜 的盲 肠 内容物 ． 加温 至４ 用 ０Ｃ左 右 的 生理 盐 水稀 释｝ 制 成 悬 浮液 ， 悬 浮 液一 滴 昆匀 取 于干 净 的载 玻 片上 镜 检 。见 大 小不 一 、 端 有 短鞭 一 毛 、 钟摆 样运 动 的近似 圆形 的变形 虫样虫 体 。 作
根据 实 验 室检 验 ， 合 临 床症 状 、 检 变 化 ， 断 为 结 剖 诊
弧菌 性肝 炎 。
结 合发病 情 况 、 临床 症状 、 检变化 和 显微镜 检 剖
查 确诊 为火 鸡组 织滴 虫病 。 ５ 防治 （ ） 即将 病 火鸡 全部 隔 离 饲 养 ， 舍 内 １立 鸡 地面、 壁、 墙 垫料 及 各种 饲 养 用具 用 ３ 苛 性 钠彻 底 进 行 消毒 。２ 病鸡 用０ ０ 甲硝 哒唑 （ （） ．４ 灭滴 灵 ） 混于 拌 料 ， 喂 ５天 。 ３天后 ， 连 停 再用 ０ ０ 呋 喃唑酮 （ ．６ 痢
猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及药敏试验
养猪 Ｓ ＷＩ ＮＥ Ｐ Ｒ Ｏ Ｄ ＵＣ Ｔ Ｉ ＯＮ（ ６ ）
２ ０ １ ６
猪 胸 膜 肺 炎 放 线 杆 菌 的 分 离 鉴 定 及 药 敏 试 验
车勇 良 ， 陈如 敬 ， 吴 学敏 ， 王晨 燕 ， 王 隆柏 ， 刘 玉涛 ， 周 伦 江
（ 福建省农业科学 院畜牧 兽医研 究所／ 福建省畜禽疫病 防治工程技术研 究中心 ， 福建 福州 ３ ５ ０ ０ １ ３ ）
收稿 日期 ： ２ ０ １ ６ — ０ ９ — １ ９ 基金 项 目： 福建省 公益 类科研 专项 （ ２ ０ １ ０ Ｒ１ ０ ２ ５ — ２ ） ； 福 建省 生猪
为 ０ ％， 保 育猪 成活 率也 为 ７ ０ ％， 肥育猪 成 活率 为 ８ ０ ％。剖 检病变显现 为出血 性肺炎、胸膜炎和心包 炎， 支气管和气 管内分泌物增 多。
１ ． ３ 试 验 方 法
１ ． ３ ． １ 细菌分离与纯化 用火焰灭菌的接种针挑取 病猪 肺脏 ， 划 线接种 于 Ｔ Ｓ Ａ培 养板 ， 并在接 种 线 的 垂直方 向划线接种金黄色葡萄球菌 ， 放置于 ３ ７℃恒 温箱 中培养 ２ ４ ～ ４ ８ ｈ后 ，观察菌落形态 并挑取可疑 菌落进行革兰 氏染色镜检 。并将可疑单菌落接种于 Ｔ Ｓ Ａ培养 基进行 纯化培养 ， 直至 菌落 形态大小均一 、
色泽一致为止 。 １ ． ３ ． ２ 生化 试验
使用 微 生物生 化管 进行 生化 鉴
定， 包 括 尿 素酶 接触 试 验 、 溶 血 性试 验 、 过氧 化 氢
试验 、 卫 星现象 等 ， 糖发 酵反应 试 验包括 ： 木糖 、 甘 露醇、 棉 子糖 、 阿 拉伯 糖 、 麦 芽糖 、 蔗糖 、 果糖 和 葡 产业体 系 萄糖 等 。 作者简 介 ： 车 勇良（ １ ９ ７ ６ 一 ） ， 男， 江西临川人 ， 副研 究 员， 主要从 事 １ ． ３ ＿ ３ 细菌基 因组 Ｄ Ｎ Ａ提 取 挑 取纯化 后 的单个 预 防兽 医 学研 究． Ｅ — ｍａ ｉ ｌ ： ｃ ｙ １ １ ９ ７ ６ ０ ８ １ ０ ＠１ ６ ３ ． ｃ ｏ ｍ 菌落 接种 于含 ５ ％小牛 血清 和 ０ ． ０ ０ ５ ％Ｎ Ａ Ｄ的 Ｔ Ｓ Ｂ 通讯作者 ： 周伦 江（ １ ９ ７ ３ 一 ） ， 男， 福 建周 宁人 ， 研 究员， 博士， 主要 从 液体培养液 中， ３ ７℃振荡培养 过夜 。离心沉 淀后加 事 畜禽传 染病 防控研 究． Ｅ — ｍａ ｉ ｌ ： ｌ ｕ ｎ ｊ ｉ ａ ｎ ｇ ＠１ ６ ３ ． ｃ ｏ ｎ ｒ
_猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定与药敏试验
2 结果与分析
2． 1 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定结果 病料触片以及分离纯化菌革兰氏染色、镜检都可见有革
兰氏阴性、多形态的细菌，多为球杆菌、短杆菌，偶有成丝状的 细菌，着色不均。在加入 0． 04% NAD 的 TSA 固体培养基上 初次分离培养 24 h，可见 1 ～ 2 mm、露珠状、半透明的菌落，共 获得 3 株分离菌。3 株分离菌在靠近溶血性金黄色葡萄球菌 的地方出现明显的溶血区域，即 CAMP 试验阳性。3 株分离
可水解尿素酶，液体培养基变为粉红色，菌株生长需要 NAD， 症状明显减轻，一般给药 3 次左右，大多数猪的体温、食欲基
3 株分离菌株为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌。
本恢复正常。中药复方 2 口服 + 头孢噻肟肌肉注射组有效率
2． 2 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的药敏试验结果
达 100% ，治愈率达 92． 78% ，相对增重率达 78． 82% ，且没有
那霉素、红霉素、麻黄、黄芩不敏感。
较好。
表 2 高敏药物对猪传染性胸膜肺炎的治疗试验结果
组别
试验数 （ 只）
Ⅰ组氟苯尼考注射
20
Ⅱ组头孢噻肟注射
20
Ⅲ组中药复方 2 口服
20
Ⅳ组中药复方 2 口服 + 头孢噻肟注射
20
Ⅴ组感染对照
20
Ⅵ组空白对照
20
注： 同列数据后不同小写字母表示差异显著（ P ＜ 0． 05） 。
YC03 22 17 14 11 10 5 10 5 15 13 10 7 12 18 14
菌离金黄色葡萄球菌越近，菌落越大、越多； 反之菌落越小、越 2． 3 高敏药物对猪传染性胸膜肺炎的治疗试验结果
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该 分 离茵对 氟苯尼考 、强力霉素和 先锋 Ⅵ等 药物 高度敏 感 ．
研 究 结 果 为猪 传 染性 胸 膜肺 炎放 线 杆 菌病 的诊 断及 治 疗提 供
指 导意义 ，同时也 为进 一步研 究猪传 染性胸膜肺 炎放 线杆菌
炎 放 线 杆 菌 的形 态 和 染 色 特 征 。对 比两 种 营 养 肉汤 的 浑 浊 度
体温升高 ，耳 、鼻及 四肢皮肤呈 蓝紫色 ，咳嗽 、呼吸极 度困
难 ，有 的呈犬 坐姿势 ，临死 前 １ ： ３ 鼻孔 流 出血色 或 白色 的泡 沫 。剖检见胸腔含有粉红色 液体 ，心包积液 ，纤维 素性 心包 炎 ，纤维紊 眭腹膜炎 、肺炎 ，胸 壁和肺粘连很严重 。为更好 的控制该病 ，本实验通过病原分 离鉴定确定细菌 ，并 以此为 依据做药物敏感性试验 ，提 出合理的防治方案 。
维素性肺炎 、慢性纤维 素性 坏死 性胸膜肺炎 ，急性 发病 死亡
率高 ，是 当今危害养猪业 的一种重要 细菌性疾病 ｌ ｌ ｌ 。严 重危 害着我 国养猪业 的发展 。
蘸 取 分 离菌 的肉汤 培 Fra bibliotek 物 ，接种 于血 琼脂 平 板 ，将 各 种 药
敏纸片分别平贴于培养基表面 ，３ ７ ℃培养 ２ ４ ｈ ，测定抑菌环。
摘 要 ：猪 传染性胸 膜肺 炎是 一种 高度传 染性呼吸道 疾病 ．影
５ ２ ８ ２ ３ １ ）
生物科 技公 司 ；金黄色葡萄球菌及 Ｖ因子 （ Ｎ Ａ Ｄ，烟酰胺腺 嘌呤二核苷酸 ）为佛山科学技术学 院预 防兽医实验室保存 。
１ ． ２ Ｖ 因子 需要 试 验
响全球 养猪 业的发展 。本 研 究采 用 多种培 养基 进行 接 种培 养 ．从 具有猪 传染性胸 膜肺炎临床症状病 死猪 的肺 脏和胸腔
从具有猪传染性胸膜肺炎临床症状病死猪的肺脏和胸腔渗出液分离到革兰氏阴性杆菌通过细菌分离涂片染色镜检卫星现象试验v因子依赖性试验诊断最终确定所分离的细菌为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌
疫病防治 ｌ
猪传 染性胸膜肺炎放线杆菌 的 分 离鉴定 与药敏试验
谭 素媚 聂 立欣 付 强 ｚ
（ １ ，广 东省肇 庆 市农业 学校 ５ ２ ６ ０ ７ ０ ；２ ，佛 山科 学技 术 学 院 生命 科 学学 院
某规模 化猪 场存 栏生 猪 ５ １ ９头 ，其 中公 猪 ５头 ，母 猪
２ ８ ０头 ，后 备母猪 １ ３ ４头 ，断奶仔猪 １ ０ ０头 ，养殖方式 为 自
２ 剖 检 病 变
肺脏表 面可 见大小不等 的出血点或 出血斑 ，肺膈叶观察 到暗红色 的突变 区 （ ３ ／ ３ ） ；肺表面 出现纤维素性 渗出物 ，肺 与胸壁或膈肌相 粘连 （ ２ ／ ３ ） ；胃底腺体 区观察 到弥漫性 出血
１ 材料 和方 法
１ ． １ 试 剂 和 培 养基
生化微量鉴定管 、培养 基 、药敏纸片等均购 于广州瑞舒
发现 ，添加 了 ｖ因子 的肉汤 比不添加 Ｖ因子的 肉汤浑浊 （ 见
基金项 目：广 东省 自然科学基金项 目 （ ２ ０ １ ４ Ａ ０ ３ ０ ３ １ ０ ０ ２ ０ ）和广 东高校优 秀青年创新人 才培养计划项 目 （ ２ ｏ １ ４ Ｋ Ｑ Ｎｃ ｘ１ ７ ９ ）资助 。
渗 出液分 离到革兰氏阴性杆菌 ，通过 细菌分 离、涂片染 色镜 检 、卫星现 象试验 、ｖ 因子依赖性试验诊 断，最终确定所分
离的 细 菌 为猪 传 染性 胸 膜肺 炎放 线 杆 菌 。通 过 药敏 实 验 发 现
分 离菌株分别 接种于含有 终浓度 为 ０ ． Ｏ １ ％Ｖ因子 和无 ｖ 因子的普通营养 肉汤中 ．在 ３ ７ ＇ ： Ｅ 需氧 和厌 氧条 件下培养 ２ ４ — ４ ８ ｈ 后 ，观察和记录试 验结果 。
的致 病 机 理 奠 定 基 础
分离的细菌 ，３ ７ ￣ Ｃ 培养 ２ ４ ～ ４ ８ ｈ 。
１ ． ４ 生化 鉴 定
关键词 ：猪 ；传 染性胸 膜肺 炎放 线杆 菌；病原 分 离鉴定 ；药
敏 试 验
用 分离 菌 纯培 养物进 行下 列试 验 ：硝 酸盐还 原 、尿 素
酶 、靛 基 质 、ＭＲ、Ｖ Ｐ试 验 、葡 萄 糖 、乳 糖 、硫 化 氢 、接 触
病变 ；包 皮积尿 ，挤 压后流 出茶黄 色的尿液 ，膀胱粘膜 可见
酶 、水杨苷 、麦芽糖 、蔗糖 、甘露 醇 、果糖 、木糖 、柠檬 酸
猪传染性胸膜肺炎是 由猪胸 膜肺炎放线杆菌引起 的猪的
一
盐 、山梨醇等糖 发酵试验 １ ３ １ 。接种前在发酵管中加入 ２ ｔ ｘ Ｌ的
１ ％的 Ｎ Ａ Ｄ。
１ ． ５ 药敏 实验
种高度传染性呼吸道疾病 。该 病主要表现为急性 出血 性纤
２ 结 果
２ ． １ 镜 检 结 果
在规模化养猪场 中 ，猪传染 性胸膜肺炎容易引起群 发性
死亡 ，造成 较大损失 ｌ ２ １ 。２ ０ １ ４年 １ ０月 ，广 东省肇庆某 猪场 ３月龄的猪发病并 出现大量死亡 。临床主要表现 为被毛松乱 、
病 料接种 于巧克力 培养基 。３ ７ ｑ Ｃ 培养发现菌落为露珠状 、 约２ ￣ ３ ｍｍ大小 ，闪光不透明。经革 兰氏染色 ，可见革兰 氏阴 性球杆菌 ，菌体细小 ，也可见杆状 、丝状散在菌体 （ 见图 １ ） 。 ２ ． ２ 细菌分 离培养特征 在普通平板 、麦 康凯培养基上不 生长 ；在巧克力 培养基 上长成 针尖大 、灰 白色 、圆形隆起 、闪光不透 明的菌落 ；在 鲜血琼脂 培养基 上长成更细小的透 明菌落 ，密集 时可看到形 成一片 １ ３ 溶 血区 ；挑取 菌落染色镜检 ，符合猪传染性胸 膜肺
通讯作 者：付强 （ １ ９ ８ ３ －） ，男，博士 ，研 究方向为・ Ｉ 盏 床 兽医学。
疫病防治 ｌ
一
例 高致病性猪蓝 耳病 和猪瘟混合感染 的诊 断
韩俊伟 （ 河 南省 新 乡市动物 卫 生监督 所 ４ ５ ３ ０ ０ ０ ） 杜海燕 （ 河 南省新 乡市动物 疫病预 防控 制 中心 ４ ５ ３ ０ ０ ０ ）