实验一——鸡胚成纤维细胞的培养
鸡胚成纤维细胞(CEF)的制作及细胞培养
鸡胚成纤维细胞（CEF）的制作及细胞培养（一）CEF的制备1. 实验试剂1×DMEM（不含丙酮酸钠）、小牛血清、高压过的PBS、胰酶、双抗。
2. 实验设备和材料酒精灯、酒精喷壶、酒精棉、打火机、计时器、一次性手套废液缸、镊子、细胞瓶、50 mL试管架、50 mL离心管、1000ul 移液枪及枪头、100 uL移液枪及枪头、塑料吸管、一次性培养皿、SPF鸡胚（9-11日龄均可）将3把小镊子、1把剪刀、1个50 mL离心管、1个玻璃培养皿放入一个大号饭盒内；取一中号锥形瓶，瓶口由内到外分别盖上6层纱布、锡箔纸、报纸包好，高压30 min备用。
3. 实验步骤（1）将所用材料放入超净工作台（小牛血清及胰酶除外），紫外照射30 min。
（2）用镊子取出高压过的平皿、镊子，倒入PBS液；（3）酒精消毒气室处蛋壳，去除蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，取出鸡胚，置于培养皿中用镊子去除头、四肢和内脏，并将胚体置于另一个培养皿中冲洗干净；（4）将胚体置于高压过的50 mL离心管内，略水平放置，用剪刀充分剪碎，越碎越好；（5）加入胰酶（5 mL/个），37℃水浴锅内消化5-8 min，待胚体呈绒毛状即可，吸除消化液；（6）加入30 mL含10%血清的DMEM，充分吹打，静置片刻，过滤至锥形瓶内；（7）重复第六步；（8）分装至培养瓶或将细胞按1.2×106 cells/well传到6孔板中，每孔 2 mL。
（二）细胞冻存（1）倒去细胞上清液，加入PBS洗去残留的培养基，洗两次。
（2）加入0.25%的胰酶，消化10-20 s后倒去。
（3）1瓶细胞加入1 mL培养基吹打均匀，吸入到离心管中。
（4）将细胞离心，1000 rpm，2-3 min。
（5）根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20% FBS+10% DMSO）重悬细胞，一般两瓶细胞冻存三管（FBS越高，细胞复苏时活力越大）。
DMSO一定要配成10%。
鸡胚成纤维细胞的制作及培养
鸡胚成纤维细胞培养1、准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2、布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。
3、选胚：取9-10日龄鸡胚，（注：鸡胚日龄越小，形成细胞活力越好，但产量较低）用新洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台。
用碘酒、酒精消毒蛋壳。
用镊子打开气室。
4、用另一套镊子将壳膜打开将鸡胚夹起去头、爪、眼，放灭菌生理盐水中。
5、把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
6、剪切：用眼科剪把组织切成1~2毫米大小的块，以便于消化。
7、处理组织：将已剪碎的组织碎片倒入一个带玻璃珠的灭菌三角瓶中，其中加入0.25%的胰酶，10个胚约7ml，或加组织消化液，一个胚1ml（组织消化液以及胰酶的配置见微生物指导）结扎瓶口或塞以胶塞。
8、消化：将其置入37℃水浴箱中或用恒温水浴，消化中应不停摇动，如用电磁恒温搅拌器消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
消化10－15分钟。
一般约12分钟。
视鸡胚日龄大小而定。
越小消化时间越短。
见组织松软即可。
一般不可消化时间太长否则容易导致细胞活力不足。
9、分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，加入0.5％的含5％犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液少许。
（制法见微生物试验实习指导），用力震摇，或用吸管吹打。
使细胞分散，脱落。
然后用纱布过滤或随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清（可以不离心吸掉上清），加入适量含有血清的培养液。
10、计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。
对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。
鸡胚成纤维细胞的制备
实习三鸡胚成纤维细胞（CEE）的制备目的：1.初步掌握CEE的培养方法和待染色的细胞培养物的制备。
2.了解一般细胞培养要求的条件。
材料：10~12天龄鸡胚、BSS（每100ml加3.5%NaHCO3和庆大霉素各1.0ml）、Hanks水解乳蛋白液（每100ml加小牛血清5ml、庆大霉素1ml）、小牛血清、0.06%胰酶、3.5%NaHCO3、庆大霉素（5000单位/ml）、蛋架、剪刀、镊子、铁线钩、烧杯、三角瓶、、链霉素瓶、吸管、注射器（2ml、5ml、10ml）、培养架、酒精灯、酒精棉、漏斗及尼龙滤网、离心管、天平、平衡杯、离心机、羊皮纸、1/2盖玻片等。
内容与方法：1．准备好平皿、烧杯、三角瓶、细胞瓶、吸管、注射器（2ml、5ml、10ml）、漏斗子，及尼龙滤网、离心管、1/2盖玻片等。
预先包扎好，15磅30分高压灭菌。
小铁钩、剪刀和镊子等可在用前煮沸15分钟。
2．用碘酒棉和酒精棉消毒蛋壳，无菌操作打开蛋的气室，钩起鸡胚，在平皿内剪去头、脚及去掉内脏，然后放入烧杯内，并尽量剪碎胚体。
3．用约10ml BSS将组织碎块倒入三角瓶，并冲洗2次，以除去其中的红细胞。
4．加入0.06%胰酶10ml，于37℃水浴消化约10分钟，迅速用BBS将组织碎块轻轻冲洗2次，最后一次冲洗液弃去后即加10ml营养液（营养液里的血清将终止残存胰酶的作用），用吸管反复吹打组织碎块，直至大部分细胞分散而上层液变浑浊。
5．经100目尼龙滤网滤入离心管，并用羊皮纸封口，平衡后1000r/min离心5分钟，弃去上层液，确定细胞压积后，以1：300的稀释倍数加入新的营养液，然后重新悬浮细胞。
6．每一细胞瓶加入细胞悬液；制备待固定、染色的细胞培养物可在瓶内加入半块盖玻片，使其浸入细胞悬液中。
在瓶上方做上标记，置37℃培养，1~2天后CEE可生长形成单层。
细胞工程实验总结
实验一、细胞培养实验器材和试剂的准备1、哪些物品适合于高压灭菌，并说明理由。
①材料：微孔滤膜(直径25 cm)：孔径为0.22μm、微孔滤膜(直径90 cm)：孔径为0.22 μm、过滤器(直径25 cm)。
②仪器和器材：眼科剪刀和镊子、长镊子、培养皿、培养瓶、试剂瓶（或盐水瓶）、移液枪、10毫升试管、10毫升离心管、巴氏吸管、5毫升（或10毫升）吸量管、不锈钢过滤器、塑料过滤器、注射器、超净工作台、干燥箱、高压灭菌锅、正压泵。
理由：适合于高压灭菌是布类、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些耐高温的塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如Hanks液、PBS等)。
2、细胞培养常用液体如何配制和灭菌？1）PBS ：8.0g NaCl、0.2gKCl、2.2gNa2HPO4、0.12gKH2PO4溶于1000 mL双蒸水，高压灭菌，4℃保存。
（准备试剂瓶）灭菌方法：高压灭菌。
2）干粉培养基过滤除菌（先准备好不锈钢过滤器及滤膜，安装后高压灭菌，适度烘干；铝盒4个，三角瓶2个，容量瓶，不锈钢过滤器一套，酒精灯，酒精棉球3瓶，吸耳球3个，吸量管10毫升和5毫升各5根，分装用瓶，血清，超纯水，抗生素）认真阅读说明书。
说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。
这些成分有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。
配制方法（1L）：1）在一个尽可能接近总体积的容器中加入大约500mL双蒸水。
2）在室温（20℃到30℃）的水中加入干粉培养基。
3）水洗袋内残留培养基，全部转移到容器内，轻轻搅拌，不要加热。
4）完全溶解之后，1袋1L粉状DMEM加3.7g NaHCO3，1mmoL∕L丙酮酸钠，即0.11g/L，添加双抗。
5）用双蒸水定容到1L，搅拌溶解。
注意不要过分搅拌。
6）通过缓慢搅拌加入1N NaOH 或1N HCL调节pH值培养基在过滤前要保持密封。
实验报告——精选推荐
实验报告细胞培养实验写报告内容1⽬的2 原理3材料与⽅法（操作步骤）4实验结果5结论或结果分析实验⼀鸡胚原代成纤维细胞的制备与培养实验⼆滤泡性⼝炎病毒（VSV）的增殖（纯培养）实验三 Hep-2细胞的传代培养实验四 VSV TCID50滴定实验五⼲扰素活性（效价）的测定实验六 VSV中和试验（稀释⾎清固定病毒法）实验⼆鸡胚原代成纤维细胞的制备与培养⼀、⽬的1、掌握鸡胚原代成纤维细胞的制备及培养的基本步骤；2、掌握活细胞的显微镜下观察；3熟悉病毒在细胞内增殖的基本判断⽅法。
⼆、原理离体动物组织通过温和的⼿段（机械和酶消化）形成单个细胞后，在适宜的外界环境中，包括温度、酸碱度和⽓相环境，并给予充⾜合适的营养条件，能⽣存、⽣长形成单层细胞，这种原代培养的细胞具有原来体内所具备的基本特性，⽐如肌⾁细胞的收缩功能；上⽪细胞的分泌功能等。
通常把这种从体内取出组织细胞开始培养到第⼀次进⾏传代之前的这⼀段时期称为原(初)代培养。
原代细胞最接近体内细胞的特性，因⽽对外界环境的变化也最敏感，因此⽐较适合病毒的增殖，药物的作⽤机制等的研究。
三、材料（按2⼈/组的量发放）四、操作步骤1、在DMEM和Hank’s 液中分别⽆菌操作以1％的量加⼊双抗，吸出10～15mlHank’s 液⾄⽆菌平⽫中备⽤；2、碘酒和酒精棉球分别拭擦鸡胚⽓室外卵壳；3、取出两只⽆菌平⽫，并标记①和②，待⽤。
4、⼤镊⼦轻敲卵壳顶部然后⼩⼼去掉⽓室外卵壳；5、消毒镊⼦后⼩⼼撕破卵膜，两⼈互相配合取出鸡胚置于盛有Hank’s 液的平⽫①中，⼩⼼去头、内脏、⽖和粘液及⾎球，洗涤后置于盛有Hank’s 液的平⽫②中，再充分洗涤；6、取出洗净的组织块置于⼤青霉素瓶中，在⽕焰附近⽤⽆菌眼科剪⼑将其剪成约0.5～1mm3的⼩块（约250次），此时体积约0.5ml；⽤Hank s’液洗涤两次。
7、按照10倍量加⼊0.25％胰蛋⽩酶，调节pH⾄约7.3～8.0（⾁眼观为⾁红⾊）盖上瓶塞，写好标记；8、将上述细胞瓶置于37℃⽔浴中，开始计时，约15～30min，其间缓慢摇匀以充分消化。
鸡胚成纤维细胞制备.pptx
实验所需器材、试剂
超净工作台，检卵灯，灭菌的细胞培养瓶、眼科剪、眼科镊、平皿、 吸管、离心管等；9-11日龄鸡胚；PBS，0.25%胰酶消化液，DMEM营养 液，75%酒精棉。
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实验步骤
（一）操作前的准备 1、预热培养液：把已经配制好的生长液、Hanks
液和胰蛋白酶液放入37℃水浴锅内预热； 2、用75%酒精棉擦拭双手和紫外线照射过的超净
将剪碎的组织块放入锥形瓶中，加入适量的胰酶。包 紧瓶口，37℃水域消化30min，每隔5min轻轻摇动1次。当组织 块变得蓬松透明时，吸弃消化液，用PBS洗两遍，中止消化。 如再继续消化，可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够 ，则细胞不易分散。
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实验步骤
（2）分散细胞 将消化好的细胞悬液从水浴锅中取出，弃去上层液体
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鸡胚成纤维细胞元代培养 CEF的培养是在一定条件下，在体外模拟体内生理环 境，使从体内取出的成纤维组织细胞生存、生长和传 代，并维持原有组织细胞的结构和功能特性。
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实验原理
病毒能在易感的组织或单层细胞内增殖，并可产生细胞病变，因此， 细胞培养是病毒学研究的重要手段，是进行病毒性疫苗生产和病毒性 疾病诊断必不可少的工具。原代细胞培养是体外制备细胞培养物的必 经过程，从供体体内取出组织分散成单个细胞接种于培养液中为初次 培养，从初次培养到第一次传代培养为原代培养。本实验以鸡胚成纤 维细胞作为原代细胞，通过细胞培养实践操作，认识和体会原代细胞 的制备方法和影响细胞培养的主要因素，并掌握原代细胞培养的方法 。
取9-11日龄的鸡胚，用检卵灯选取血管清楚、活动正常的 鸡胚，置蛋架上，令气室端向上，用碘酒棉消毒蛋壳气室部位 。 （2）胚体采集
鸡胚成纤维细胞的制备
鸡胚成纤维细胞的制备一、材料和试剂1、鸡胚：9-10日龄发育良好的SPF胚2、试剂：0.25％胰酶，MEM培养基，新生牛血清，1万IU双抗，3%谷氨酰胺，7.5%碳酸氢钠3、仪器和器材：，带6-8层纱布的100ml烧杯两个，直径9cm的平皿两个，中号镊子四把，倒置显微镜，培养箱，50ml细胞培养瓶，10ml刻度吸管两根、5ml刻度吸管，250ml生理盐水瓶两个，无菌的细胞培养瓶，灭菌好的PBS，酒精棉球，废液缸等二、操作步骤1、操作前的准备：○1预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
○2用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
○3正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
○4点燃酒精灯：注意火焰不能太小。
○5准备好将要使用的消毒后的培养瓶。
○6取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
2、成纤维细胞制备：①将选好的9-10日龄的发育良好的SPF胚用5%的碘棉消毒蛋壳气室部位，再用酒精棉脱碘。
②无菌取出鸡胚，放入灭菌的玻璃皿内，用PH7.2的PBS冲洗一次，去头，四肢和内脏。
③再用PH7.2的PBS冲洗两次。
④用镊子捏成小块（2-3mm3）, 用PH7.2的PBS冲洗两次。
⑤鸡胚约加4ml0.25%胰酶溶液，38℃消化30min，期间15min轻摇一次。
⑥期间配制细胞培养液：培养基：MEM双抗：2%7.5% 碳酸氢钠：2%牛血清：6%3% 谷氨酰胺：1%⑦消化结束，弃掉胰酶消化液，用PH7.2的PBS冲洗两次，再用细胞生长液冲洗一次。
⑧加入适量的细胞生长液，用刻度吸管反复吹打（使细胞充分分散）。
⑨将细胞分散液倒入带6-8层纱布的100ml烧杯中（过滤之前先用少许细胞培养液润湿纱布），加入适量培养液（40ml/胚），过滤。
⑩重复步骤⑨的操作重虑一遍。
11计数，要求每1ml滤液中约含活细胞100万-150万个。
一种鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法
一种鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法1. 从鸡胚体内收集成纤维细胞：使用灭菌的工具和培养介质，从鸡胚体内收集成纤维细胞。
2. 细胞培养基的制备：制备适宜的细胞培养基，比如DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium），其中包含适当的营养物质和补充物。
3. 细胞培养底物处理：在培养器中涂覆适宜的细胞培养底物，比如胶原蛋白、明胶或聚二甲基丙烯酸甲酯（PDMA）等。
4. 细胞预处理：将收集到的鸡胚胎成纤维细胞在预处理培养基中预处理一段时间，以提高细胞的存活率和增殖速度。
5. 细胞接种：将经过预处理的细胞接种至培养器中的培养底物上，使细胞附着并形成单层或多层细胞。
6. 体外三维培养的创建：将培养器中的细胞培养至一定程度，使细胞形成三维结构，如球状或纺锤状。
7. 细胞增殖和细胞养护：提供适宜的培养条件，包括合适的培养基、温度、湿度和氧气含量，以促进细胞增殖和维持细胞的健康状态。
8. 培养基的更换：定期更换培养基，以排除废弃物和维持细胞的正常功能。
9. 细胞监测和分析：使用显微镜和其他细胞学技术，定期监测和分析培养器中的细胞状态、数量和生长速度。
10. 细胞传代：当细胞达到一定密度时，可以进行细胞传代，将细胞分离、稀释并重新接种，以维持细胞的健康状态和继续培养。
11. 细胞分离：使用适当的消化酶（如胰蛋白酶）或细胞分离缓冲液，将三维细胞结构分离为单个细胞。
12. 细胞计数：使用细胞计数仪或显微镜，对分离的细胞进行计数，以确定细胞的数量。
13. 细胞检测：采用细胞培养板或微孔板等细胞培养容器，将分离的细胞均匀地分配在不同孔或区域上，以进行后续的细胞检测和分析。
14. 细胞培养条件的优化：在细胞分离过程中，根据不同实验目的，优化培养条件，如培养基的配方、温度、湿度和氧气含量等。
15. 细胞培养的存活率和生长速度的分析：通过计算存活细胞的比例和细胞增殖速率，评估细胞培养的效果。
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2. 剪碎 用灭菌剪刀剪去鸡胚头部、腿部、翅膀和内 脏，留下躯干组织。用D-Hanks液冲洗，除去血液后 移入灭菌青瓶中，用灭菌剪刀尽量剪碎（1mm3小块）， 再用D-Hanks冲洗2次直至组织发白为止，然后将洗液 上清吸弃。 3.酶消化 根据鸡胚组织块的多少，加入大约4倍量的 胰酶(5-6mL)，于37℃温箱内消化15-20min，视其组 织碎块变松散（聚合成一团、边缘毛样模糊）即可。 轻轻吸出消化液，用D-Hank’s洗1-3次。
拔出瓶塞、塞上瓶塞时瓶口和塞子要灼烧；倾 倒液体前后都要灼烧瓶口，并且瓶口向下，低 于瓶底；倾倒液体时两瓶口之间不能接触。
瓶内是严格无菌的，所以要保证吸管不接触到 瓶口的外壁。若一旦接触，更换新的吸管。
（2）倒置显微镜 （3）超净台
实验步骤
1.取胚 选择9-11日龄鸡胚
于蛋架上，先后用碘酒和
75%酒精消毒气室部外壳。 用无菌眼科镊子击破该部
位的蛋壳和卵膜，撕破尿
囊膜和羊膜，并轻轻夹住 鸡胚颈部取出鸡胚，放入 无菌平皿中。
1气室 2卵壳 3卵黄囊 4卵白 5 尿囊腔 6绒毛尿囊 7胚胎 8羊水腔 9胚胎外腔
用75％酒精擦拭消毒双手。 超净台台面应整洁，用0.1％新洁尔灭擦净。 打开超净台的紫外灯照射台面30min左右。使用 超净台时，打开风机，点燃酒精灯。
严格在酒精灯无菌范围之内操作。 使用巴氏吸管以及其他吸管时，取出后要手拿末端 安上橡皮头后，过酒精灯火焰略烧后插在无菌盐水 瓶或试管内。 操作时，严禁说话，尽量不用手直接拿无菌的物品， 如瓶塞等，而要用器械，如镊子等去拿。 不能用手接触瓶口、吸管口以及镊子和剪刀的头部。
4.吹打 加适量1640营养液，用巴氏吸管反复吹吸数次， 使细胞分散，制成细胞悬液。静置1分钟，使未冲散 的组织块沉淀，吸出细胞悬液于20mL 营养液中。重 复3次收集细胞悬液，直至鸡胚发白为止。 将纱布置于细胞瓶口，用吸管吸取细胞悬液滤过至细 胞瓶中（注意不要将悬液溢出）。 5.培养 于37℃-CO2温箱内培养。24-48h后可长成单层 细胞。
实验结果
1、观察原代细胞的形态和生长状况；
Байду номын сангаас
2、如出现细胞培养液浑浊情况，请鉴别是否细 菌污染。
注意事项
1. 切割组织块时务必要切成小块 2. 整个操作过程要严格保持无菌
3.严格控制胰酶消化时间
4. 放入孵箱前应在培养瓶表面标明细胞名称、日期和
组别
5. 实验用品放回原处，摆放整齐
无菌操作的一般要求
第一讲 鸡胚成纤维单层细胞的制备 与培养
——预防兽医微生物组
实验目的
1.掌握无菌操作技术 2.掌握细胞培养所需的仪器、设备 3.了解细胞培养的相关理论
4.掌握鸡胚成纤维细胞的原代培养技术
实验背景
原代细胞培养因具有细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很 大变化，具备二倍体的遗传性、来源方便等优点而广泛应用 于病毒学、细胞分化、药物测试等试验。在禽类原代细胞培 养中，鸡胚成纤维细胞(chickenembryo fibroblast，CEF)得 到普遍应用。CEF的培养是在一定的条件下，在体外模拟体内 生理环境，使从体内取出的成纤维组织细胞生存、生长和传 代，并维持原有组织细胞的结构和功能特性。与其他细胞相 比，CEF相对容易获得，而且增殖能力强，适应性强，具有良 好的耐受性，性状比较稳定，不易发生转化，所以被广泛地 应用于分子和细胞生物学研究，以及疫苗的生产。
实验材料
预加10%FCS和双抗的1640培养液；消化液 (0.25%胰蛋白酶- 0.02%EDTA溶液)；D-Hanks
平衡盐溶液；
灭菌培养皿、青瓶、细胞培养瓶各1个； 巴氏吸管若干支、纱布若干；眼科镊1把，剪刀 1把； 碘酒，75％酒精棉球；酒精灯1台；废液缸。
实验设备
（1） 37℃-CO2培养箱