第十二章蛋白质药物的分析
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生物化学第12章、蛋白质的降解及氨基酸代谢
三、蛋白质降解的反应机制：
真核细胞对蛋白质的降解有二体系： 一是溶酶体系，即溶酶体降解蛋白质，是非选 种择性； 二是以细胞溶胶为基础的，依赖ATP机制，即 泛肽标记选择性蛋白质降解方式
四、机体对外源蛋白质的消化
（一）体内的蛋白酶系
1、 按存在部位分： （1）胃：胃蛋白酶 （2）小肠：胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白 酶、 羧肽酶（A、B）、氨肽酶。
五、生酮氨基酸和生糖氨基酸
一、生酮氨基酸
1、生酮氨基酸：有些氨基酸在分解过程中转变为 乙酰乙酰CoA，而乙酰乙酰CoA在动物的肝脏中 可变为酮体（乙酰乙酸和β-羟丁酸）。 2、种类：Leu、Lys、Trp、Phe、Tyr。
二、生糖氨基酸
1、生糖氨基酸：凡能生成丙酮酸、α-酮戊二酸、 琥珀酸和草酰乙酸的氨基酸，它们都能导致生成 葡萄糖和糖原。 2、种类：15种
（2）外切酶：从氨基端或羧基端逐一的向内水 解肽链成氨基酸
氨肽酶：从N末端水解肽键； 羧肽酶A：水解除Pro、Arg、Lys外的C末端残基； 羧肽酶B：水解Arg、Lys为C末端的残基；
蛋白质经过上述消化管内各种酶的协同作用， 最后全部转变为游离的氨基酸。
第二节、氨基酸的分解代谢
一、氨基酸降解
二、氨的代谢去路
氨对生物机体是有毒物质，特别是高等动物的 脑对氨极为敏感。血液中1%的氨就可引起中枢 神经系统中毒。
1、 氨的转运
在血液中主要以谷氨酰胺（需谷氨酰胺合成酶） 形式转运到肝脏，形成尿素；
COOH CH2 CH2 CHNH2 COOH Glu
N H3
ATP
A D P+ P i
生物药物分析期末总结范文
生物药物分析期末总结范文生物药物分析是现代生物技术的重要组成部分，涉及到药物研发、生产、质量控制等方面。
本文将从生物药物分析的基本原理、常用分析方法、质量控制和挑战等方面进行总结。
一、基本原理生物药物是以生物制剂为基础的药物，包括蛋白质药物、抗体药物、基因工程药物等。
生物药物分析的基本原理是基于这些药物的特性和作用机制，通过各种分析方法对其进行定性定量分析。
1.蛋白质药物分析蛋白质药物通常是通过重组DNA技术等方法制备的，其分析主要涉及到蛋白质表达、纯化、结构和功能等方面的研究。
常用的分析方法包括：基于质谱的蛋白质定量分析、免疫学方法、生物活性检测等。
2.抗体药物分析抗体药物是指基于抗体的药物，广泛应用于肿瘤治疗等领域。
抗体药物的分析方法包括免疫学方法、结构分析、生物活性检测等。
其中，流式细胞术、ELISA、Western blotting等是常用的抗体药物分析方法。
3.基因工程药物分析基因工程药物是指基于基因工程技术制备的药物，主要包括基因疗法、基因工程疫苗等。
基因工程药物的分析方法主要包括基因的表达、载体的转染、基因传递效率的测定等。
二、常用分析方法生物药物分析涉及到多种分析方法，常用的分析方法包括物理化学方法、免疫学方法、分子生物学方法等。
1.物理化学方法物理化学方法主要用于药物的理化性质研究和分析。
其中，红外光谱、紫外-可见光谱、荧光光谱等用于药物的结构表征和纯度检测；高效液相色谱、气相色谱等用于药物成分分离和纯化。
此外，还有核磁共振、电泳、质谱等方法。
2.免疫学方法免疫学方法是生物药物分析中常用的方法之一，包括免疫印迹、酶联免疫吸附实验、荧光免疫测定等。
这些方法主要用于检测药物中的蛋白质、抗体等成分。
3.分子生物学方法分子生物学方法主要用于药物的基因表达、结构和功能研究。
常用的方法包括PCR、RT-PCR、DNA测序、基因克隆等。
这些方法可以用于药物的生物合成、基因表达、突变检测等。
三、质量控制生物药物分析中，质量控制是非常重要的一环。
第十二章 乳蛋白质化学
（二）β -乳球蛋白的理化性质
• 2.β -乳球蛋白的变性 • 碱性物质、加热、有机化合物和金属离子均会 引起β -乳球蛋白变性。 • 在pH8以上β -乳球蛋白的变性变得明显，pH由 8 变为 l0, 二聚体解离为单体； pH11 时 α - 螺旋 结构不变， β - 折叠转化为任意构象， pH12 时 结构完全呈任意状态。 • 变性速度随pH增加而变快，最终产生大量的凝 集。
• （四）胶体磷酸钙 • 酪蛋白胶体除含各种酪蛋白外，还含有Ca, Mg、无 机磷酸盐和柠檬酸盐。 • 阴阳离子的相互作用构成了胶体相中的胶体磷酸钙， 它和酪蛋白相互作用成为酪蛋白胶体的一部分。 • 胶体磷酸钙的结构存在有两种不同的观点：一种认 为胶体磷酸钙是以Ca3(PO4)的形式存在；一种认为 酪蛋白的磷酸酯化基团和钙结合在一起。也有人认 为胶体磷酸钙应是一个不同于前两种形态的特殊类 型结构。
• α- 酪蛋白能防止其它酪蛋白的钙诱导沉淀，这是乳 中含有大量钙，足以使 αs1- 酪蛋白、 αs2- 酪蛋白、 β酪蛋白沉淀而酪蛋白胶体呈溶解性的原因。 • 钙和酪蛋白的结合受pH、温度、离子强度的影响， 和钙离子导致沉淀的浓度影响呈一致性。 • 故平衡结合常数随pH、温度的增加而增加，随离子 强度的增加而下降，这些常数对αs1-酪蛋白、β-酪蛋 白是相似的。
（二）β -乳球蛋白的理化性质
• 3.β -乳球蛋白和有机物质的结合
（二）β -乳球蛋白的理化性质
• 4.β -乳球蛋白和离子的结合 • 乳球蛋白能和单价、二价金属离子结合。 • Na+ 能在其等电点以上结合于羲基和咪哇基团 上。 • Ag+、Cu2+、Hg2+与游离硫琉基结合。 • I- 专一性地和 β - 乳球蛋白中的硫巯基结合， 产生二者间的络合物。
生物检定法
第一节 概述
一、生物检定的应用范围
（一）药物的效价测定 采用理化方法无法测定含量或理化测定不能反映临床生物活 性的药物可用生物检定法来控制药物质量。
（二）微量生理活性物质测定 一些神经介质、激素等微量生理活性物质，有很强生理活性
的，在体内的浓度很低，加上体液中各种物质的干扰，很难用 理化方法测定。 ➢ 而生物测定法由于灵敏度高、专一性强，对供试品稍做处理
1.体内反应 体内试验的受试对象一般是整体动物，给药于整体动物后， 观察规定时间内（非立时）的反应，这时反应代表生物药品 对动物或整个在位组织的反应，包括血浆中药物或其代谢物 的浓度、代谢效应、代谢产物的作用、细胞间相互作用、体 内释放物质的作用及反馈机制等。
其反应指标代表了该药物的整个药理作用。
第一节 概述
第二节 抗生素的微生物检定法
一、概述
（一）概念 抗生素是指由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高
等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的 一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物 质。
抗生素可分为天然品和人工合成品。 ➢ 天然品是由微生物产生，如青霉素； ➢ 人工合成品是由化学合成的方式生产的或通过结构改造形
成全新结构的全合成抗生素，如氯霉素、利奈唑烷等。
第二节 抗生素的微生物检定法
（二）抗生素微生物检定法 抗生素微生物检定法是利用抗生素在低微浓度下选择性的
抑制或杀死微生物的特点，以抗生素的抗菌活性为指标，来 衡量抗生素中的有效成分效力的方法。这种经典的抗生素效 价测定方法，多用于结构十分复杂和多组分抗生素的含量测 定。
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第四章 生物检定法
【知识目标】
1.掌握生物检定法的概念和常用方法及抗生 素的微生物检定法；
生化-第12章-蛋白质的生物合成(20150512)
2．方向性（direction） 起始密码子总是位于编码区5′-末端， 而终止密码子位于3′-末端，每个密码子的 三个核苷酸也是按照5′→3′方向阅读，不能 倒读。
5′ 读码方向 3′
N
肽链延伸方向
C
3．简并性（degeneracy） 遗传密码中，除色氨酸和甲硫氨酸 仅有一个密码子外，其余氨基酸均有2
参与核糖体循环的起始因子
原核生物蛋白质合成起始阶段
• • • • 起始三元复合物的形成； mRNA在小亚基定位结合； 起始氨基酰-tRNA定位在P位； 起始复合物的形成。
1．起始三元复合物的形成
2．mRNA在小亚基定位结合
SD序列（Shine-Dalgarno sequence） ： 在mRNA起始密码子的上游8~13个核苷酸处有一 段4~9个核苷酸组成的富含嘌呤核苷酸的序列，以 AGGA为核心，它可与核糖体小亚基中的16S rRNA 3′-端富含嘧啶的序列（UCCU）互补。
二、肽链合成的起始
指mRNA和起始氨基酰-tRNA与核蛋白体共 同构成起始复合物 。这一过程需要起始因子 （IF）、GTP和镁离子参与。 起始氨基酰-tRNA的表示方法：tRNAiMet
真核生物： Met-tRNAiMet
原核生物： fMet-tRNAifMet
甲硫氨酸 甲酰甲硫氨酰
原核生物中的起始因子有3种： IF1直接结合到小亚基A位，阻止tRNA过早与A 位结合； IF2具有GTP酶活性，催化fMet-tRNAifMet结合 至小亚基，并阻止其它负载tRNA与小亚基结合。 IF3结合于小亚基E位，阻止小亚基与大亚基的 结合，并促进fMet-tRNAifMet结合至核糖体的P位。
NH2 A1 A2A3A4……Anp……………….Amp…………….Aup……………COOH
酶分析法
酶的比活力也称比活性，代表酶制剂的纯度，是指每毫克酶蛋白所具 有的活力单位数。对同一种酶来说，酶的比活力越高，纯度越高。
第一节 概述
二、酶促反应条件 选择酶反应条件的基本要求是：所有待测定的酶分子都应 该能够正常发挥它的作用。这就是说，反应系统中除了待测定 的酶浓度是影响速度的唯一因素外，其他因素都处于最适于酶 发挥作用的水平。确定反应条件时应该考虑以下因素： 1.底物 2.pH 3.温度 4.辅助因子 5.空白和对照
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—适用于制药类专业
第一章 绪论 第二章 药物分析基本知识 第三章 生物药物的检查法 第四章 生物检定法 第五章 免疫分析法 第六章 电泳分析法 第七章 色谱法 第八章 酶分析法
化学工业出版社
第九章 氨基酸、肽类、蛋白质类药物的分析 第十章 抗生素类药物的分析 第十一章 维生素类药物的分析 第十二章 核酸类药物的分析 第十三章 甾体激素类药物的分析 第十四章 药物制剂及工艺用水的分析 第十五章 基因工程药物分析 第十六章 体内药物分析常用方法与应用
（8-2） 式中，V为测定时的反应速度，VMAX为最大反应速度，[S]为底物浓度。按 反应速度定义：
（8-3） 式中，t为反应时间，k为正反应的速度常数。
第一节 概述
将上式进行积分得：
（8-4）
（8-5）
式中 为初始底物浓度，在半对数坐标纸上， 与t之间呈直线关系，已知t与 ， 即可求得 ，并可计算速度常数k。 酶促反应接近完全反应所需时间为：
第一节 概述
一、基本概念
酶活力是指在一定条件下，酶所催化的反应初速度。酶催化反应的速 度，可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示。
酶活力的大小，可用酶活力单位来表示。1961年国际生物化学与分 子生物学联合会规定：在特定条件下（温度可采用25℃，pH值诸条件均 采用最适条件），1min催化1μmol的底物转化产物的酶量定义为1个酶 活力单位，这个单位称为国际单位（IU）。
第一节 概述
二、酶促反应条件 选择酶反应条件的基本要求是：所有待测定的酶分子都应 该能够正常发挥它的作用。这就是说，反应系统中除了待测定 的酶浓度是影响速度的唯一因素外，其他因素都处于最适于酶 发挥作用的水平。确定反应条件时应该考虑以下因素： 1.底物 2.pH 3.温度 4.辅助因子 5.空白和对照
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—适用于制药类专业
第一章 绪论 第二章 药物分析基本知识 第三章 生物药物的检查法 第四章 生物检定法 第五章 免疫分析法 第六章 电泳分析法 第七章 色谱法 第八章 酶分析法
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第九章 氨基酸、肽类、蛋白质类药物的分析 第十章 抗生素类药物的分析 第十一章 维生素类药物的分析 第十二章 核酸类药物的分析 第十三章 甾体激素类药物的分析 第十四章 药物制剂及工艺用水的分析 第十五章 基因工程药物分析 第十六章 体内药物分析常用方法与应用
（8-2） 式中，V为测定时的反应速度，VMAX为最大反应速度，[S]为底物浓度。按 反应速度定义：
（8-3） 式中，t为反应时间，k为正反应的速度常数。
第一节 概述
将上式进行积分得：
（8-4）
（8-5）
式中 为初始底物浓度，在半对数坐标纸上， 与t之间呈直线关系，已知t与 ， 即可求得 ，并可计算速度常数k。 酶促反应接近完全反应所需时间为：
第一节 概述
一、基本概念
酶活力是指在一定条件下，酶所催化的反应初速度。酶催化反应的速 度，可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示。
酶活力的大小，可用酶活力单位来表示。1961年国际生物化学与分 子生物学联合会规定：在特定条件下（温度可采用25℃，pH值诸条件均 采用最适条件），1min催化1μmol的底物转化产物的酶量定义为1个酶 活力单位，这个单位称为国际单位（IU）。
生物化学第十二章-蛋白质的生物合成
第十二章蛋白质的生物合成一、蛋白质生物合成体系：生物体内的各种蛋白质都是生物体利用约20种氨基酸为原料自行合成的。
蛋白质的生物合成过程，就是将DNA传递给mRNA的遗传信息，再具体的解译为蛋白质中氨基酸排列顺序的过程，这一过程被称为翻译（translation)。
参与蛋白质生物合成的各种因素构成了蛋白质合成体系，该体系包括：1.mRNA：作为指导蛋白质生物合成的模板。
mRNA中每三个相邻的核苷酸组成三联体，代表一个氨基酸的信息，此三联体就称为密码。
共有64种不同的密码。
遗传密码具有以下特点：①连续性；②简并性；③通用性；④方向性；⑤摆动性；⑥起始密码：AUG；终止密码：UAA、UAG、UGA。
2.tRNA：在氨基酸tRNA合成酶催化下，特定的tRNA可与相应的氨基酸结合，生成氨基酰tRNA，从而携带氨基酸参与蛋白质的生物合成。
tRNA反密码环中部的三个核苷酸构成三联体，可以识别mRNA上相应的密码，此三联体就称为反密码。
反密码对密码的识别，通常也是根据碱基互补原则，即A—U，G—C配对。
但反密码的第一个核苷酸与第三核苷酸之间的配对，并不严格遵循碱基互补原则，这种配对称为不稳定配对。
能够识别mRNA中5′端起动密码AUG的tRNA称为起动tRNA。
在原核生物中，起动tRNA是tRNAfmet；而在真核生物中，起动tRNA是tRNAmet。
3．rRNA和核蛋白体：原核生物中的核蛋白体大小为70S，可分为30S小亚基和50S大亚基。
真核生物中的核蛋白体大小为80S，也分为40S小亚基和60S大亚基。
核蛋白体的大、小亚基分别有不同的功能：⑴小亚基：可与mRNA、GTP和起动tRNA结合。
⑵大亚基：①具有两个不同的tRNA结合点。
A位——受位或氨酰基位，可与新进入的氨基酰tRNA 结合；P位——给位或肽酰基位，可与延伸中的肽酰基tRNA结合。
②具有转肽酶活性。
在蛋白质生物合成过程中，常常由若干核蛋白体结合在同一mRNA分子上，同时进行翻译。
生物制药工艺学第12章制备型HPLC
一、分离方法之间的组合 四步纯化法： Preparation: Capture:(Isolate,concentrate and stabilize) Intermediate purification:(Remove bulk impurities) Polishing:(Achieve final high level purity）
第二节 分离方案的设计
What is the intended use of the product? What kind of starting material is available and how should it be handled? What are the purity issues in relation to the source material and intended use of the final product? What has to be removed? What must be removed completely? What will be the final scale of purification? What are the economical constraints and what resources and equipment are available?
速率理论:研究各种动力学因素对峰展宽的影 响。 H= A+Cu
有关参数
容量因子：溶质在固定相中的总摩尔数与流 动相中总摩尔数之比。容量因子k与柱效参数 及定性参数密切相关，而且比分配系数易于 测定，在色谱分析法中一般都是用容量因子 代替分配系数。
t R t0 k t0
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氨基酸对照品。
21
实例：L-精氨酸——高氯酸滴定法
取本品约0.1g，精密称定，置50ml烧杯中， 加冰醋酸10ml与醋酸汞试液5ml，缓缓加热 溶解。
放冷后，用高氯酸液（0.1mol/L）滴定，并 将滴定的结果用空白试验校正。
每 1 ml 的 高 氯 酸 液 相 当 于 1 0 . 5 3 mg 的 C6H14N4O2·HCl。
沉降常数（S）： 扩散常数（D）： 粘度：在一定溶质浓度下，取决于溶质
的分子量和形状
6
蛋白质为两性电解质
蛋白质分子至少具有一个自由氨基 和一个自由羧基，具有两性解离性 质
蛋白质电泳、离子交换
7
双缩脲反应
双缩脲试剂的成分:碱性硫酸铜溶液 碱性溶液中，双缩脲(H2NOC—NH—CONH2)能与
蛋白质水解速度和水解程度的测定。
15
（四）甲醛滴定法
在pH中性下，甲醛迅速与氨基酸上的氨基结 合，使平衡向右移动，促进氢离子释放，使 溶液酸度增加。
每释放出一个氢离子，相当有一个氨基氮
16
（五）非水溶液滴定法
非水溶液滴定法：是氨基酸在冰醋酸中用高 氯酸的标准溶液滴定其含量
酸碱的质子学说：一切能给出质子的物质为 酸，能接受质子的物质为碱。
9
第二节 氨基酸类药物的分析
一、氨基酸鉴别 二、氨基酸定量
10
一、氨基酸鉴别
茚三酮：溶液均显蓝紫色。 旋光性： 薄层色谱鉴别法 ： 紫外光谱鉴别：酪氨酸、色氨
酸、苯丙氨酸，在紫外区有最 大吸收 红外光谱鉴别：压制成溴化钾 片，在4000～667 cm-1范围 内测定吸收图谱
11
二、氨基酸定量
选定导数光谱波长范围为322～270nm，按导数 分光光度法测定色氨酸、酪氨酸的一阶，二阶和三 阶导数光谱。
在三阶导数光谱中色氨酸在287、284、280nm 有三个导数光谱峰，而酪氨酸在零线上，选定三阶 导数分光光度法。
20
八、HPLC法
对于多种氨基酸配制成的氨基酸注射 液，可用HPLC进行含量测定。
凝胶过滤层析
(gel filtration chromatography )
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE ）
SDS- polyacrylamide gel electrophoresis
梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳法
（gradient PAGE ）
25
超离心沉降速度
原理：在转速较高时（50000至60000转/分 钟） ，均匀分布在溶剂中的蛋白质分子以一定 的速度移向离心池底部，并形成一个界面，分 子量越大的物质，界面移动越快。
氨基酸与蛋白质药物的分析
第一节 概述 第二节 氨基酸类药物的分析 第三节 蛋白质类药物的分析
1第一Biblioteka 概述一、氨基酸的性质 二、蛋白质的性质
2
一、氨基酸的性质
具有旋光性 光吸收：酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸，在近紫外
区有最大吸收。 酸碱性：两性电解质，净电荷为零时的pH称为等
电点（pI ）， 生理条件下多数以负离子形式存在。
范围：0.5-50μg
13
（二）三硝基苯磺酸法
TNBS在偏碱性的条件下与氨基酸反应，先 形成中间络合物。
酸性溶液中，中间络合物转化成TNB-氨基 酸，吸收值移至340nm处。
14
（三）铜复合物紫外吸收法
在合适的pH条件下，二分子α-氨基酸与一分子 铜离子形成氨基酸-铜复合物。
复合物呈蓝色，除了在620nm有吸收峰外，在 230nm有最大吸收。
利用光学方法测定界面的移动速度。
Svedberg公式：
S为溶质分子的沉降速度 。
26
沉降平衡法原理
在低速（7000-8000转/分）的离心条件下，沉 降分子向离心池底部移动的速度很小。
溶质分子在沉降时产生了浓度梯度，引起与沉降 相反方向的扩散。
两个相反方向移动的溶质分子，在一定时间内达 到平衡状态。
18
标准曲线的绘制
精密吸取1.2，2.0，3.0，4.0，5.0， 6.0ml色氨酸对照品溶液，置100 ml 量瓶中，用氢氧化钠液稀释至刻度， 在280，303.2nm处分别测定，计算 吸收度差值△A 。
在0.5～3.0mg/100ml范围，浓度与 吸收度差值呈良好性关系。
19
（七）、导数分光光度法
3
茚三酮反应
茚三酮在酸性溶液中与α－氨基酸共热，引起 氨基酸氧化脱氨、脱羧反应，最后茚三酮与反 应产物－氨和还原茚三酮反应生成紫色物质。
4
二、蛋白质的性质
高分子有机物 两性电解质 双缩脲反应 福林酚反应 紫外吸收
5
蛋白质为高分子有机物
蛋白质水溶液具有亲水胶体的性质，还 具有扩散和沉降作用，粘度大和不透过 半透膜等
弱碱在酸性溶剂中碱性显得更强，而弱酸在 碱性溶剂中酸性显得更强。
适合成品测定，测定范围是几十毫克
17
（六）双波长分光光度法
消除共存组分干扰
等吸收波长的选择:复方氨基酸 注射液在320～280 nm范围内， 只有色氨酸和酪氨酸有吸收度。
酪氨酸在280，303.2波长处吸 收度相等，选用280与 303.2nm为等吸收波长。
Cu2+作用，形成紫色或紫红色的络合物
8
Folin －酚反应（Lowry）
包括两步反应： （1）在碱性条件下，与铜试剂作用生成蛋
白质－铜络合物； （2）此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原，
生成深蓝色混合物，颜色深浅与蛋白含量成 正相关
660nm测定，灵敏度比双缩脲法高100倍 适于微量蛋白的测定。
（一）茚三酮法 （二）三硝基苯磺酸法 （三）铜复合物紫外吸收法 （四）甲醛滴定法 （五）非水溶液滴定法 （六）双波长分光光度法 （七）导数分光光度法 （八） HPLC法
12
（一）茚三酮法
茚三酮在酸性条件下和氨基酸反应，氨基酸被氧化 分解生成醛，放出氨和二氧化碳，还原型茚三酮。
还原型茚三酮与氨及另一分子茚三酮缩合生成蓝紫 色的物质，最大吸收值波长570 nm。
22
第三节 蛋白质药物的分析
一、蛋白质纯度测定 二、蛋白质分子量测定 三、蛋白质药物的含量测定 四、蛋白质组成氨基酸的分析
23
一、蛋白质纯度的鉴定方法
1、层析 2、电泳 3、免疫化学法 4、其它方法（分光光度法，酶活力，超
速离心沉降）
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二 、蛋白质分子量测定
超离心沉降速度
离心沉降平衡
21
实例：L-精氨酸——高氯酸滴定法
取本品约0.1g，精密称定，置50ml烧杯中， 加冰醋酸10ml与醋酸汞试液5ml，缓缓加热 溶解。
放冷后，用高氯酸液（0.1mol/L）滴定，并 将滴定的结果用空白试验校正。
每 1 ml 的 高 氯 酸 液 相 当 于 1 0 . 5 3 mg 的 C6H14N4O2·HCl。
沉降常数（S）： 扩散常数（D）： 粘度：在一定溶质浓度下，取决于溶质
的分子量和形状
6
蛋白质为两性电解质
蛋白质分子至少具有一个自由氨基 和一个自由羧基，具有两性解离性 质
蛋白质电泳、离子交换
7
双缩脲反应
双缩脲试剂的成分:碱性硫酸铜溶液 碱性溶液中，双缩脲(H2NOC—NH—CONH2)能与
蛋白质水解速度和水解程度的测定。
15
（四）甲醛滴定法
在pH中性下，甲醛迅速与氨基酸上的氨基结 合，使平衡向右移动，促进氢离子释放，使 溶液酸度增加。
每释放出一个氢离子，相当有一个氨基氮
16
（五）非水溶液滴定法
非水溶液滴定法：是氨基酸在冰醋酸中用高 氯酸的标准溶液滴定其含量
酸碱的质子学说：一切能给出质子的物质为 酸，能接受质子的物质为碱。
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第二节 氨基酸类药物的分析
一、氨基酸鉴别 二、氨基酸定量
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一、氨基酸鉴别
茚三酮：溶液均显蓝紫色。 旋光性： 薄层色谱鉴别法 ： 紫外光谱鉴别：酪氨酸、色氨
酸、苯丙氨酸，在紫外区有最 大吸收 红外光谱鉴别：压制成溴化钾 片，在4000～667 cm-1范围 内测定吸收图谱
11
二、氨基酸定量
选定导数光谱波长范围为322～270nm，按导数 分光光度法测定色氨酸、酪氨酸的一阶，二阶和三 阶导数光谱。
在三阶导数光谱中色氨酸在287、284、280nm 有三个导数光谱峰，而酪氨酸在零线上，选定三阶 导数分光光度法。
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八、HPLC法
对于多种氨基酸配制成的氨基酸注射 液，可用HPLC进行含量测定。
凝胶过滤层析
(gel filtration chromatography )
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE ）
SDS- polyacrylamide gel electrophoresis
梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳法
（gradient PAGE ）
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超离心沉降速度
原理：在转速较高时（50000至60000转/分 钟） ，均匀分布在溶剂中的蛋白质分子以一定 的速度移向离心池底部，并形成一个界面，分 子量越大的物质，界面移动越快。
氨基酸与蛋白质药物的分析
第一节 概述 第二节 氨基酸类药物的分析 第三节 蛋白质类药物的分析
1第一Biblioteka 概述一、氨基酸的性质 二、蛋白质的性质
2
一、氨基酸的性质
具有旋光性 光吸收：酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸，在近紫外
区有最大吸收。 酸碱性：两性电解质，净电荷为零时的pH称为等
电点（pI ）， 生理条件下多数以负离子形式存在。
范围：0.5-50μg
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（二）三硝基苯磺酸法
TNBS在偏碱性的条件下与氨基酸反应，先 形成中间络合物。
酸性溶液中，中间络合物转化成TNB-氨基 酸，吸收值移至340nm处。
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（三）铜复合物紫外吸收法
在合适的pH条件下，二分子α-氨基酸与一分子 铜离子形成氨基酸-铜复合物。
复合物呈蓝色，除了在620nm有吸收峰外，在 230nm有最大吸收。
利用光学方法测定界面的移动速度。
Svedberg公式：
S为溶质分子的沉降速度 。
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沉降平衡法原理
在低速（7000-8000转/分）的离心条件下，沉 降分子向离心池底部移动的速度很小。
溶质分子在沉降时产生了浓度梯度，引起与沉降 相反方向的扩散。
两个相反方向移动的溶质分子，在一定时间内达 到平衡状态。
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标准曲线的绘制
精密吸取1.2，2.0，3.0，4.0，5.0， 6.0ml色氨酸对照品溶液，置100 ml 量瓶中，用氢氧化钠液稀释至刻度， 在280，303.2nm处分别测定，计算 吸收度差值△A 。
在0.5～3.0mg/100ml范围，浓度与 吸收度差值呈良好性关系。
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（七）、导数分光光度法
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茚三酮反应
茚三酮在酸性溶液中与α－氨基酸共热，引起 氨基酸氧化脱氨、脱羧反应，最后茚三酮与反 应产物－氨和还原茚三酮反应生成紫色物质。
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二、蛋白质的性质
高分子有机物 两性电解质 双缩脲反应 福林酚反应 紫外吸收
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蛋白质为高分子有机物
蛋白质水溶液具有亲水胶体的性质，还 具有扩散和沉降作用，粘度大和不透过 半透膜等
弱碱在酸性溶剂中碱性显得更强，而弱酸在 碱性溶剂中酸性显得更强。
适合成品测定，测定范围是几十毫克
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（六）双波长分光光度法
消除共存组分干扰
等吸收波长的选择:复方氨基酸 注射液在320～280 nm范围内， 只有色氨酸和酪氨酸有吸收度。
酪氨酸在280，303.2波长处吸 收度相等，选用280与 303.2nm为等吸收波长。
Cu2+作用，形成紫色或紫红色的络合物
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Folin －酚反应（Lowry）
包括两步反应： （1）在碱性条件下，与铜试剂作用生成蛋
白质－铜络合物； （2）此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原，
生成深蓝色混合物，颜色深浅与蛋白含量成 正相关
660nm测定，灵敏度比双缩脲法高100倍 适于微量蛋白的测定。
（一）茚三酮法 （二）三硝基苯磺酸法 （三）铜复合物紫外吸收法 （四）甲醛滴定法 （五）非水溶液滴定法 （六）双波长分光光度法 （七）导数分光光度法 （八） HPLC法
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（一）茚三酮法
茚三酮在酸性条件下和氨基酸反应，氨基酸被氧化 分解生成醛，放出氨和二氧化碳，还原型茚三酮。
还原型茚三酮与氨及另一分子茚三酮缩合生成蓝紫 色的物质，最大吸收值波长570 nm。
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第三节 蛋白质药物的分析
一、蛋白质纯度测定 二、蛋白质分子量测定 三、蛋白质药物的含量测定 四、蛋白质组成氨基酸的分析
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一、蛋白质纯度的鉴定方法
1、层析 2、电泳 3、免疫化学法 4、其它方法（分光光度法，酶活力，超
速离心沉降）
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二 、蛋白质分子量测定
超离心沉降速度
离心沉降平衡