生物化学实验PCR实验17页PPT
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第二章-PCR技术ppt课件
模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
（2）引物浓度
0.1-0.5 mol/L
浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性 下降。
（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反 应产量。
（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度
低浓度引物
高浓度引物
2. 反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片 段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析 ,如探索邻接已知 DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长 cDNA的 克隆,扩增基因的插入DNA；建立基因组步移文 库。
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
• 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了 聚合酶链反应（PCR） • 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 • 最初采用 E-coli DNA 聚合酶进行 PCR ，由于该酶 不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错
引物2 Taq酶
PCR的基本原理
第1轮结束 第2轮开始
• PCR反应条件 72℃ 95℃ • PCR过程 • PCR的特点
PCR的基本原理
Taq
• PCR反应条件 72℃ 50℃ 95℃ Taq • PCR过程 • PCR的特点
Taq
TaqLeabharlann PCR的基本原理第2轮结束
• PCR反应条件 72℃ • PCR过程 • PCR的特点
形 成
DNA 2
55 22
条变 单性 链
子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性
（2）引物浓度
0.1-0.5 mol/L
浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性 下降。
（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反 应产量。
（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度
低浓度引物
高浓度引物
2. 反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片 段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析 ,如探索邻接已知 DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长 cDNA的 克隆,扩增基因的插入DNA；建立基因组步移文 库。
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
• 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了 聚合酶链反应（PCR） • 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 • 最初采用 E-coli DNA 聚合酶进行 PCR ，由于该酶 不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错
引物2 Taq酶
PCR的基本原理
第1轮结束 第2轮开始
• PCR反应条件 72℃ 95℃ • PCR过程 • PCR的特点
PCR的基本原理
Taq
• PCR反应条件 72℃ 50℃ 95℃ Taq • PCR过程 • PCR的特点
Taq
TaqLeabharlann PCR的基本原理第2轮结束
• PCR反应条件 72℃ • PCR过程 • PCR的特点
形 成
DNA 2
55 22
条变 单性 链
子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性
分子生物学PCR技术课件
2020/4/17
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
14
引物设计基本原则
引物的长度
典型的引物为18-24个核苷酸，在一定范围内 引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列 存在于非目的序列位点的可能性；引物长度的上 限主要与反应效率有关，所以一般又不能太长， 因为过长会导致其延伸温度大于72℃，即Taq酶 的最适温度。
4
Kary B. Mullis
<<The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction>>
1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大 科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣 获1993年度诺贝尔化学奖。
2020/4/17
25
PCR反应条件
1）PCR反应成分
（1）模板 一般100ng DNA模板/100L。模板浓度过高 会导致反应的非特异性增加。
2020/4/17
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
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（2）引物浓度
0.1-0.5 mol/L
浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下 降。 （3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
的粗提DNA
2020/4/17
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
12
3. PCR反应体系和反应条件
• 反应体系： （五要素）
– 模板（template）
• DNA
pcr培训ppt课件
实验操作人员应接受专业培训，熟悉安全操作规程，避免在实验过程 中受伤或感染。
07
总结与展望
Pcr技术的总结
PCR技术的原理
PCR是一种在生物实验室中广泛应用的分子生物学技术，其基本原理是通过特定的DNA 聚合酶，在DNA双链之间进行热循环，从而实现DNA的快速扩增。
PCR技术的应用领域
PCR技术在许多领域都有广泛的应用，包括遗传学、医学、生物技术和农业等。通过PCR 技术，科学家们可以快速、准确地检测和鉴定DNA序列，这对于遗传疾病的诊断、生物 多样性的研究和基因工程等领域具有重要意义。
安全问题
生物安全
PCR实验涉及的生物材料可能具有传染性，因此需要采取适当的生物 安全措施，如穿戴个人防护装备、实验室内消毒等。
废物处理
实验产生的废物应按照相关规定进行妥善处理，避免对环境和人类健 康造成危害。
防止污染
PCR实验过程中应采取措施防止污染，如设置阴性对照、定期检测实 验室环境等。
人员安全
PCR技术的优缺点
PCR技术具有高灵敏度、高特异性和操作简便等优点，但也存在一些局限性，如对模板 DNA的纯度要求高、易受污染等。因此，在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的 PCR方法。
Pcr技术的发展趋势
要点一
提高灵敏度和特异性
随着基因组学和分子生物学研究的深 入，对PCR技术的灵敏度和特异性提 出了更高的要求。因此，未来的PCR 技术需要进一步提高其灵敏度和特异 性，以满足更广泛的研究和应用需求 。
05
Pcr技术的拓展应用
基因克隆与表达
基因克隆
通过PCR技术，科学家可以快速、准 确地获取特定基因片段，为基因克隆 提供基础。
基因表达
利用PCR技术，可以检测基因在不同 条件下的表达水平，有助于理解基因 功能和调控机制。
07
总结与展望
Pcr技术的总结
PCR技术的原理
PCR是一种在生物实验室中广泛应用的分子生物学技术，其基本原理是通过特定的DNA 聚合酶，在DNA双链之间进行热循环，从而实现DNA的快速扩增。
PCR技术的应用领域
PCR技术在许多领域都有广泛的应用，包括遗传学、医学、生物技术和农业等。通过PCR 技术，科学家们可以快速、准确地检测和鉴定DNA序列，这对于遗传疾病的诊断、生物 多样性的研究和基因工程等领域具有重要意义。
安全问题
生物安全
PCR实验涉及的生物材料可能具有传染性，因此需要采取适当的生物 安全措施，如穿戴个人防护装备、实验室内消毒等。
废物处理
实验产生的废物应按照相关规定进行妥善处理，避免对环境和人类健 康造成危害。
防止污染
PCR实验过程中应采取措施防止污染，如设置阴性对照、定期检测实 验室环境等。
人员安全
PCR技术的优缺点
PCR技术具有高灵敏度、高特异性和操作简便等优点，但也存在一些局限性，如对模板 DNA的纯度要求高、易受污染等。因此，在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的 PCR方法。
Pcr技术的发展趋势
要点一
提高灵敏度和特异性
随着基因组学和分子生物学研究的深 入，对PCR技术的灵敏度和特异性提 出了更高的要求。因此，未来的PCR 技术需要进一步提高其灵敏度和特异 性，以满足更广泛的研究和应用需求 。
05
Pcr技术的拓展应用
基因克隆与表达
基因克隆
通过PCR技术，科学家可以快速、准 确地获取特定基因片段，为基因克隆 提供基础。
基因表达
利用PCR技术，可以检测基因在不同 条件下的表达水平，有助于理解基因 功能和调控机制。
生物化学实验-PCR实验
• 出现片状拖带或涂抹带 • PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原 因往往由于酶量过多或酶癿质量 差，dNTP浓度过高， Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其 对策有：减少酶量，或调换另一来源癿酶。②减少dNTP 癿浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次 数。
DNA片段的琼脂糖凝胶电泳
• 原 理 • 丌同大小和丌同构象癿DNA分子在相同癿电泳条件下（如 凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等）有丌同癿迁秱率，可 通过电泳使其分离。凝胶中癿DNA可染料溴化乙锭（EB） 结合，在紫外灯下可看到荧光条带，籍此分析实验结果。
操作步骤
• （一）凝胶制备 • 琼脂糖0.8g放入250ml癿三角烧杯中，加入100ml 1×TAE 缓冲液，混匀后，将烧瓶置于电炉上，加热煮沸，至琼脂 糖完全溶解，冷却至70℃左右时加入溴化乙锭（10mg/ml） 5μl，混匀后，即将凝胶溶液倒入凝胶成形模具，室温下 待凝胶完全凝固。 • （二）上样电泳 • 将凝胶板放入电泳槽中，在电泳槽中加入1×TAE缓冲液， 以高出凝胶表面2mm为宜。PCR产物管中加入上样缓冲 液，混匀后用加样器加入凝胶样品孔中。接通电源，调节 电压至50~100伏，电泳45分钟。 • （三）观察结果 • 电泳后，将凝胶板叏出，在紫外灯下观察。
• 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制 剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中癿 组蛋白，④在提叏制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性丌彻底。在酶和引物质量好时，丌出现扩增带， 极有可能是标本癿消化处 理，模板核酸提叏过秳出了毛 病，因而要配制有效而稳定癿消化处理液，其秳序亦应 固定丌宜随意更改。 • 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是 否因酶癿活性丧失或丌够而 导致假阴性。需注意癿是有 时忘加Taq酶或溴乙锭。
PCR详细讲解PPT课件
2021/3/7
CHENLI
26
引物设计的基本原则
1、引物应具有足够的特异性。
如果需要从基因组等较复杂的模板中扩 增特定的DNA序列，则需要考虑目的DNA序列 的保守性，尽量避免所选引物设计区域序列 的非特异性。
引物与非特异序列的同源性不超过70% 或有连续8个互补碱基。
NCBI Primer BLAST
29
引物设计的基本原则
3、引物长度一般为18-30个碱基之间。
引物长度与反应的特异性和解链温度成
正相关。
过短：扩增特异性下降 过长：引物自身形成二级结构，以及引物二 聚体。
2021/3/7
CHENLI
30
引物设计的基本原则
4、G+C含量一般为40%-60%
引物的碱基组成也会对引物的解链温度 产生影响。
2021/3/7
CHENLI
68
退火温度与时间取决于引物的 碱基组成、长度和浓度。退火温度 可以通过计算推断，通常采用温度 梯度PCR的方法进行摸索。
PC1-P20 退火温度摸索
45.0 45.5 46.9 49.0 51.4 53.8 56.2 58.6 60.9 63.1 64.5 65.0 M
CHENLI
8
低温退火
2021/3/7
CHENLI
9
中温延伸
2021/3/7
CHENLI
10
2021/3/7
CHENLI
11
2021/3/7
CHENLI
12
2021/3/7
CHENLI
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• 理论：2n递增（n为循环次数）， 如果扩增30循环，目标DNA可增加 230也就是109倍。
PCR技术培训讲座PPT课件
第10页/共46页
短柄圆环探针荧光PCR原理
分子信标是一种荧光标记的寡核苷酸链，一般含有25～35个核苷 酸。在结构上，分子信标大体上可以分为三部分：（1）、环状区： 一般由15～30个核苷酸组成，可以与靶分子特异结合；（2）、茎 干区：一般由5～8个碱基对组成，在分子信标与靶分子结合过程中 可发生可逆性解离。（3）、荧光基团和淬灭基团：荧光基团一般 连接在5ˊ端；淬灭基团一般连接在3ˊ端，常用4-（4-二甲基氨基偶 氮苯基）苯甲酸（DABCYL）作为淬灭基团。根据Foerster理论， 中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比。所以只有荧光 基团与淬灭基团之间达到一定的距离时才会产生荧光。
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试剂盒组成
1、痰DNA提取液 2、PCR反应液
结核引物1和2、结核探针、 TaqE、缓冲液 （10mmol/L Tris-HCl） 、dNTP、内参照 模板、内参照引物1和2、内参照探针、石蜡 油 3、PCR增强剂：MgCl2 4、强阳性对照：结核杆菌阳性质粒（或卡介苗） 5、弱阳性对照：结核杆菌阳性质粒（或卡介苗） 6、阴性对照：超纯水
2 、 活 性 对 比 ： 待 测 Ta q 酶 与 对 照 Ta q 酶 做 对 比 实 验 ， 测 定 室 内 质 控 品 B 、 G 系 列 ， B 系 列样品全部为阴性，荧光强度在，50以下；G系列样品应能测出1fg/ul DNA，待测酶 与对照酶测定100fg/ul DNA的相对荧光强度均值相比波动不超过±15％。
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荧光PCR试剂盒检测结果
第21页/共46页
第22页/共46页
第23页/共46页
3种方法检测痰标本结果
组别 肺结核
涂片
+ + -
短柄圆环探针荧光PCR原理
分子信标是一种荧光标记的寡核苷酸链，一般含有25～35个核苷 酸。在结构上，分子信标大体上可以分为三部分：（1）、环状区： 一般由15～30个核苷酸组成，可以与靶分子特异结合；（2）、茎 干区：一般由5～8个碱基对组成，在分子信标与靶分子结合过程中 可发生可逆性解离。（3）、荧光基团和淬灭基团：荧光基团一般 连接在5ˊ端；淬灭基团一般连接在3ˊ端，常用4-（4-二甲基氨基偶 氮苯基）苯甲酸（DABCYL）作为淬灭基团。根据Foerster理论， 中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比。所以只有荧光 基团与淬灭基团之间达到一定的距离时才会产生荧光。
第14页/共46页
试剂盒组成
1、痰DNA提取液 2、PCR反应液
结核引物1和2、结核探针、 TaqE、缓冲液 （10mmol/L Tris-HCl） 、dNTP、内参照 模板、内参照引物1和2、内参照探针、石蜡 油 3、PCR增强剂：MgCl2 4、强阳性对照：结核杆菌阳性质粒（或卡介苗） 5、弱阳性对照：结核杆菌阳性质粒（或卡介苗） 6、阴性对照：超纯水
2 、 活 性 对 比 ： 待 测 Ta q 酶 与 对 照 Ta q 酶 做 对 比 实 验 ， 测 定 室 内 质 控 品 B 、 G 系 列 ， B 系 列样品全部为阴性，荧光强度在，50以下；G系列样品应能测出1fg/ul DNA，待测酶 与对照酶测定100fg/ul DNA的相对荧光强度均值相比波动不超过±15％。
第20页/共46页
荧光PCR试剂盒检测结果
第21页/共46页
第22页/共46页
第23页/共46页
3种方法检测痰标本结果
组别 肺结核
涂片
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生物信息学与pcr ppt课件
PCR反应循环
94℃
变性
55℃
退火
PCR循环
72℃
延伸
内 涵：
前提：人工合成一对特定引物作向导，
始动DNA合成。
酶促：体外试管内进行酶促生化合成
（非化学合成）。
靶子：特导扩增目的靶序列（目的）。 高效：极微量模板、百万倍扩增 快速：短时高速完成实验。
三、PCR工作原理
PCR的基本原理
变性、复性、半保留复制
PCR过程：3步曲 + 1循环
高温变性 90～97℃
降温退火 45～55℃
适温延伸 72℃左右
变变
反复循环
90变95变
70变75变
变变
变变 40变60变
分四个阶段讲述其原理：
（一）高温模板变性
制备好含有扩增靶序列/目的基因的样品DNA （模板DNA）。然后在高温下（90 - 95℃）使双 键模板DNA变性，解链，获得单链模板DNA，为 DNA 合成作好准备。 （二）降温引物退火
长度。
➢ 为了保证扩增的特异性和有效性，引物与模板相匹配部分应
* 如何设计PCR引物——要素之一
（A）引物来源： （1) 购买成套检测试剂盒，简单省力、
易出错、成本高 （2) 自己合成
1）查文献、查序列库（计算机） ①直接查引物序列→合成； ②查靶序列自己设计
2）依PCR目的，选定靶序列上的两侧翼序列如 作检测，靶序列应保守、特异（种、属、 型特异）
220+1
n
2
2n
2n+1-2n-2 2n+1
(恒定不变) (线性增加)(近似指数增加) (指数增加)
从表中可知，
20次PCR循环后，反应产物DNA链拷贝数 220 起始模板可略去不计，5′端长链数40个， 只占总数40/220≈3.5×10-5.比例相当小。
分子生物学课件PCR
70℃
60 核苷酸/S/酶分子
55℃
24 核苷酸/S/酶分子
高于90℃时， DNA合成几乎不能进行
延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃。
反应时间，可据扩增片段的长度而定：
◆ 一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min足够。
◆ 3～4kb的靶序列需3～4min；
◆ 10Kb需延伸至15min
2. 酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点， 用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段， 此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还 能进行变异性研究。
3. 分子杂交：如Southern印迹杂交：在两引物之间 另合成一条寡核苷酸链，标记后做探针，与PCR产 物杂交。此法既可作特异性鉴定，还可知其分子量。
第3轮扩增
PCR循环过程
第4轮扩增第5轮扩增
第6轮扩增
PCR的反应动力学
PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量 呈指数上升。平均扩增效率的理论值为100%，但 在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期， 靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产 物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增 加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞 效应”，这种效应期称平台期。大多数情况下， 平台期的到来是不可避免的。
PCR扩增体系
模A 5’
TaqDNA聚合酶
引物—— 5’ATCCGGAC
Mg2+
dGTP dTTP dATP 底物 dCTP
PCR 反应体系
PCR反应五要素：引物、酶、dNTP、模板和 Mg2+
标准的PCR反应体系：
10×扩增缓冲液 10ul
成功、产物条带位置及大小