NMR原理_WJF_091227

1.3 NMR的基本原理
1945年F.Bloch和E.M.Purcell为首的两个研究小组分别基于核磁感应理论和量子光学中能量吸收的观点独立发现NMR现象而获得了诺贝尔物理学奖。

其中基于Purcell量子光学的理论认为原子核和电子一样也有自旋角动量，对于自旋角动量不为零的原子核自旋时，会产生一个与原子核自旋方向相同的磁矩，其大小与原子核的自旋角动量成正比。

当把原子核置于外加磁场中时，原子核会发生进动，其进动的能量与磁场、核磁矩、磁矩和磁场的夹角 相关。

在外加射频场的作用下提供原子核进行跃迁所需要的能量，当外加射频场的频率与原子核自旋进动的频率相同的时候，射频场的能量才能有效地被原子核吸收，发生能级的跃迁，产生NMR信号（如图1-2A）。

基于Bloch的核磁感应理论，认为磁化强度本质上是宏观磁矩，它在线圈中有自身的磁通量。

当磁化强度绕磁场旋进时，线圈中的磁通量就会发生周期性的变化，因而在线圈中可以记录到振荡频率为γћB0的交变电流，从而产生NMR信号（如图1-2B）[54]。

(A)(B)
图1-2 NMR实验的两种解释示意图[54]
（A）能量吸收图解；（B）电磁感应图解
通过核磁共振的分析能够为代谢物提供以下三种结构信息：化学位移，偶合常数，和各种核的信号强度比。

1.3.1 化学位移
同一种核由于其所在的分子不同，或在同一分子内邻近于不同的化学基团，共振频率会略有不同，因而把同一种核在分子中不同化学环境下共振吸收频率不
同的现象称为化学位移（chemical shift ）[55]。

化学位移产生的原因是，分子中运动的电子受到外磁场的影响产生感生电流，进而产生感生磁场，感生磁场与外磁场相互叠加，使核本身受到的有效场发生变化，原子核就会在略微不同的磁场强度下发生共振，此种现象又被称为屏蔽效应，用屏蔽因子σ表示。

核外成键电子产生的屏蔽效应分为两部分，第一部分是成键电子云在外场作用下，被极化产生的感应电子环流，呈现逆磁的感应磁矩，产生一个与外场方向相反的内部场，使核实际感受到的磁场小于外磁场，此种现象称为抗磁性屏蔽。

第二部分是由于化学键限制成键电子在外场中的运动而产生顺磁性屏蔽。

由于在实际工作中测量的都是相对的化学位移，因而为了比较在不同谱仪操作条件下的化学位移，实际工作中常选用一种与磁场强度无关的，无量纲的值δ来表示化学位移的大小（公式如下），其中νsam 和νref 分别是样品和参考物的共振频率。

化学位移δ的大小只取决于样品的种类、溶剂和温度等，而与谱仪的实际工作频率无关。

6
ref ref sam 10νν-νδ⨯=
若所研究的质子附近有高电负性的基团存在，则其周围的电子云密度降低，屏蔽效应也降低，顺磁性增加，σ下降，产生共振所需磁场强度小，吸收峰向低场移动；反之，若有几个低电负性基团存在，则它周围的电子云密度增加，抗磁性效应增强，化学位移向高场移动。

一般来讲分子中核受到的屏蔽与邻近基团的磁各向异性，范德华效应，溶剂作用，氢键效应，pH 值的影响，温度的影响.等相关。

1.3.2 自旋偶合和自旋裂分
原子核周围的电子云密度和它们对外加磁场的屏蔽作用决定了它们的化学位移。

除了核外电子云的作用以外，每种化学环境中的原子核还受到邻近原子核两种自旋态的小磁场的作用。

这种因分子中相邻质子间的自旋相互作用，称为自旋偶合。

由自旋偶合作用而形成的共振吸收峰分裂的现象，称为自旋裂分。

核自旋之间的相互作用形式分为两种，一种是核与核之间直接磁偶极相互作
用，称为偶极-偶极相互作用；另一种是通过成键电子传递的间接相互作用，称为自旋-自旋偶合，它是核-核之间的间接偶合。

它不同于偶极偶极相互作用，与和所处的空间方位有关，也不同于核-电子偶合，与外磁场B0无关，且只有当样品中存在两类化学位移不等价的磁性核时才可能出现自旋-自旋偶合裂分现象。

一般说来，当偶合常数远小于化学位移频率差时自旋裂分数可以应用n+1规律。

即一组相同的磁性核所具有的裂分峰书目，是由邻近的磁核数目n所决定的，其裂分数为2n I+1，对质子而言，因I=1/2，故裂分数为n+1。

需要补充的是，自旋偶合和自旋裂分通常在邻近碳原子上的质子之间发生，非相邻碳原子的偶合作用比较小。

由自旋偶合作用产生的多重峰中相邻两峰的距离（峰间隔）被称为自旋自旋偶合常数，通常用符号J表示。

影响偶合常数的因素大体可分为两个部分：原子核的磁性和分子结构。

与原子核通过化学键作用的核的磁性的大小和有无决定了偶合常数的大小和存在与否。

一般说来，原子核的磁性越大，偶合常数越大，反之亦然。

因为核旋磁比γ实际上是核的磁性大小的度量，因此偶合常数与旋磁比有直接的关系。

分子结构对偶合常数的影响可概括为两个基本因素：几何构型和电子结构。

几何构型包括键长、键角两个因素；电子结构包括核周围电子密度和化学键的电子云分布两个因素。

1.3.3 1D 和2D NMR谱的原理
脉冲傅里叶变换核磁共振谱是采用射频脉冲激发在一定范围内所有欲观测的核，通过傅里叶变换得到NMR谱图（如图1-3）。

图1-3 1D NMR谱的基本原理[56]
自二维NMR谱出现以来，它以直观的主要优势被广泛的应用于复杂波谱的解析中。

一维NMR谱把共振信号展示在一个频率坐标轴上，而二维NMR谱有两个时间变量，把一维谱分别在两个独立的坐标轴上展开，将化学位移、偶合常数等多种与化合物结构相关信息在2D NMR平面图上显示出来，减少了谱线重叠的现象，有利于谱图的解析，而且还提供了自旋核之间相互作用的信息。

它通过利用多脉冲序列对核自旋系统进行激发，在多脉冲序列作用下的核自旋系统得到两个独立的频率变量的函数，再通过对两个时域函数自由衰减信号进行两次傅里叶变换，最后得到2D NMR谱线。

通常2D谱的脉冲序列包括四个区间：预备期，发展期（t1），混合期（tm）和检测期（t2）。

其中在预备期主要通过脉冲延迟达到实验热平衡从而使核自旋体系处于初始平衡状态或通过系列脉冲使各质子的磁矢量处于某种特定的相位调制状态。

然后在发展期打破平衡状态，当样品中的核自旋被激发后，以确定频率进动并延续一段时间，通过演化期固定的时间增量△t1进行一系列实验，从而产生一系列FID信号。

混合期由一组固定长度的脉冲和延迟组成，在此期间通过相干或极化传递，建立检测的条件。

最后混合期产生的横向磁化矢量受到新的Halmilton量的作用进行演化，在检测期检测到信号的发生[57]。

1.3.4 谱峰归属的解析思路
在得到复杂的谱图后，首先根据分子中处于不同环境氢核的化学位移值大概地推断可能是什么样的基团，如1.0ppm附件多为甲基相关的信号，6.5~8区域多为芳香族化合物苯环的信号，9~10左右多为-COOH或-CHO内氢的信号。

然后根据谱峰的裂分模式，偶合常数确定分子中存在的自旋系统，得到邻近基团和连接方式，再与13C NMR数据做相应的关联确定自旋系统对应的结构单元；最后再根据化学位移将相关的官能团与自旋系统归属的结构单元相连接。

此外可以通过二维核磁共振波谱有助于推测复杂的分子结构。

如通过同核J 分解谱可以从复杂重叠的谱峰中得到相邻峰的偶合常数及裂分模式；1H-1H同核相关谱（COrrelation SpectroscopY，COSY）可以得到分子中相邻碳上的氢1H-1H
之间（< 3J HH）的偶合关系；1H-1H同核质子全相关谱（Total COrrelation SpectroscopY，TOCSY）可以通过某一质子出发，找到处于同一偶合体系内所有质子的相关峰；1H-13C异核单量子相关谱（Heteronuclear Singles Quantum Coherence，HSQC）和1H-13C异核多量子相关谱（Heteronuclear Multiple Quantum coherence，HMQC）可以把直接相连的碳和氢的信息关联起来；而1H-13C异核多键相关谱（Heteronuclear Multiple Bond Coherence，HMBC）可以获得13C-1H 之间长程偶合的信息，把季碳原子和其它碳氢基团的信息关联起来。

1.3.5 MAS的基本原理
一般情况下核的自旋会产生一些相互作用力，主要的三种相互作用力包括偶极-偶极相互作用、化学位移各向异性和核四级矩，容易导致谱线增宽信号丢失等问题。

魔角旋转（magic angle spinning，MAS）技术就是让生物组织样品在与静磁场成魔角（θ=54.7°）的方向旋转, 通过样品的旋转来达到减小分子相互作用的目的，有效平均掉样品内各种相互作用和磁化率不均匀引起的谱线变宽等影响, 从而获得与液体高分辨NMR 相媲美分辨率的生物谱图。

目前，HR-MAS NMR 已经被用于人类和动物各种组织器官的分析和研究中，包括脑组织、心脏、肝脏和肾脏等[58-60]。