酒曲中主要微生物的分离及鉴定
基于酒曲中产凝乳酶微生物菌株的分离筛选及鉴定分析
基于酒曲中产凝乳酶微生物菌株的分离筛选及鉴定分析作者：唐贤华来源：《现代食品》 2018年第15期酒曲本身含有微生物，此类微生物源自代谢与发酵的产物。
通过筛选能够获得优良的霉菌原料，从而提炼出优质的凝乳酶。
在细菌的辅助下，对微生物菌株有必要妥善予以筛选，同时还要妥善分离并且施行综合性的菌株鉴定处理。
因此，在目前实践中，关于上述的酒曲分离与筛选技术应当侧重保障最根本的菌株安全，在此前提下完成精确的菌株鉴定操作。
1 微生物菌株的筛选与分离1.1 菌株筛选在初次筛选菌株时，针对发酵酒曲可以借助纯化与分离的方式来获得纯净度较高的菌落形态。
在此前提下，确保将酪蛋白平板连接于各个菌株的相应位置上，然后将其置于恒温培养箱并且完成2 d 左右的菌株培养。
通过全方位的菌株测定与菌株观察，可以测出其中的水解圈与凝乳圈直径大小[1]。
具体在筛选不同菌株时，如果测定的水解圈直径为零，则意味着此类菌株并不会生成相应的凝乳酶成分。
反之，如果菌株本身表现为较大的白色凝乳圈，则意味着此类菌株具备较高的凝乳活力。
从干酪风味的角度讲，经过水解处理以后的菌株活力很可能影响特殊的干酪风味。
可见，在筛选多种菌株时，最好选择较低水解活力并且富含较多蛋白成分的微生物菌株。
1.2 菌株分离对于不同特性的微生物菌株有必要妥善予以分离，然后分别测定相应的凝乳酶比例。
在初次筛选的基础上，运用酪蛋白法可以选出其中具备独特优势的微生物菌株，并且将上述菌株放置于酪蛋白的平板范围内进行分离。
经过菌株的全面分离操作以后，还需经过一天的菌株培养，而后才能生成活化种子液。
在不同的培养基内，至少需要完成1 d 的菌株培养操作，确保其符合120 r/min 的摇床振荡频率以及30 ℃的菌株培养温度[2]。
通过观察各类菌株，可知在4 h 以内的时间段内，微生物菌株的生长速度相对缓慢，而与之相应的生物量也会基本维持恒定。
到了12 h 的时候，多数微生物菌株都能达到最快的菌株生长速度，其中某些菌株呈现几何级的菌类细胞增长趋向。
甜酒曲中主要的微生物菌群分离及发酵优化
In sweet wine tune main microorganisms colony isolation and fermental optimization 作者： 李永波 岳文 邓功成 肖国学
作者机构： 黔南民族师范学院生命科学系,贵州都匀558000
出版物刊名： 黔南民族师范学院学报
页码： 102-105页
年卷期： 2013年 第6期
主题词： 酒曲 酵母菌 根霉菌 发酵 蒽酮——硫酸法
摘要：酿造酒的独特风味、质量与酒曲中的微生物密切相关.从选取的民间传统酒曲中主要分离得到发酵效率高的酵母菌3株和根霉菌2株.分别用平板测量法和血球记数法测定2株根霉菌和3株酵母菌,选择生长速度最快的根霉菌M1和酵母菌S1作为菌种自制酒曲,酿制甜酒.以优质糯米为原料,经浸米、蒸饭、淋饭、拌药、下缸、糖化和发酵等工序,得到醇甜清爽、酸甜适口,风味和营养俱佳的糯米甜酒酿.在波长为620nm处用蒽酮——硫酸法测定甜酒中的总糖含量最高达13.92％.。
酒曲中微生物的分离原理
酒曲中微生物的分离原理酒曲中微生物的分离原理主要包括选择性培养基、稀释平板法、过筛法、单菌分离法等。
首先，选择性培养基是指根据不同微生物对物理化学条件的要求，选择特定的培养基，以抑制其他微生物的生长，使目标微生物得以生长。
在酒曲中，选择性培养基常用的有青霉素培养基、抑菌剂培养基等。
青霉素培养基主要通过青霉素对细菌的抑制作用来选择性培养曲酵母菌，而抑菌剂培养基则利用添加某些抑制性物质来抑制一部分酒曲中的微生物，从而选择性培养其他微生物。
其次，稀释平板法是将样品进行逐级稀释，使得微生物的数量相对稀释，从而将微生物分离在不同的平板中，形成单个菌落，方便进行单菌分离。
稀释平板法通常包括系列稀释、接种平板、培养孵育、计数等步骤。
在酒曲分离中，常使用的平板培养基有琼脂平板培养基、马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基等。
另外，过筛法是通过筛孔的大小来筛选不同大小的微生物，分离出较纯的微生物。
过筛法主要包括筛选培养液和通过筛网将微生物分离的步骤。
在酒曲中，常用的筛选培养液有酒曲水浸液、含有酶的培养基等。
通过过筛法可以分离出不同大小的酒曲微生物，如酵母菌、霉菌等。
最后，单菌分离法是将经过稀释平板法或过筛法分离得到的单个菌落进行进一步分离，得到纯种的微生物。
单菌分离法主要包括传代分离、悬滴分离、微操作分离等。
在酒曲中，常用的单菌分离方法是通过传代分离，即将分离的菌落连续接种到新的培养基上，经过多次传代，得到纯种培养。
综上所述，酒曲中微生物的分离原理主要包括选择性培养基、稀释平板法、过筛法、单菌分离法等。
通过这些方法可以将酒曲中的不同微生物分离出来，并进行纯种培养，有助于深入研究酒曲的微生物组成及其功能。
米曲霉-茅台酒酒曲中5株真菌的分离_纯化_鉴定初报
1771.9 1771.9
84.0
307.4
84.0
307.4
库房
56.00
1.74
3.77
2004.4
天人洞 56.10
1.78
3.65
184.1 178.2
229.34 222.05
1646.0 1594.0
78.1
310.5
75.6
310.4
库房
55.70
1.82
3.58
2005.3
天人洞 55.90
红曲属
曲霉属
根霉属
米曲霉种
红色红曲菌种
黑曲霉种
米根霉种
· 36 ·
第六期
刘洪伟：茅台酒酒曲中 5 株真菌的分离、纯化、鉴定初报
2009
图 1 霉菌 R1 的菌落和个体形态
图 2 霉菌 R2 的菌落和个体形态
图 3 霉菌 R3 的菌落和个体形态
图 4 霉菌 R4 的菌落和个体形态
图 5 霉菌 R5 的菌落和个体形态 本实验对茅台酒酒曲中的 5 株真菌菌种进行了分离、纯 化和初步鉴定，菌种编号为 R1、R2、R3、R4、R5。结果如表 1 和图 1~5,研究表明：
霉菌菌株 R2 的菌落呈放射状条纹，中间隆起，菌落生长 紧密，呈局限。菌丝具有分枝，横隔，多核，含油滴，有深浅不一 的红色色素，菌丝及其分枝的顶端孢子单生或链状，闭囊壳球 形 ，有 柄 。 鉴 定 结 果 为 子 囊 菌 门（Ascomycota），真 子 囊 菌 纲 （Euascomycetes）， 散 子 囊 菌 目 （Eurotiales）， 红 曲 菌 科 （Monascaceae），红曲菌属（Monascus），红色红曲菌（Monascusruber Van Tieghem）。
酒曲中根霉的分离纯化
综合性设计实验（初步设计）一、目标要求：1、掌握倒平板的方法和分离纯化微生物的基本操作技术。
2、根据根霉菌生长特性设计特有的分离及形态观察方法。
二、实施条件：1.培养基：PDA培养基马铃薯 40g葡萄糖 4g琼脂 3—4g水 200mlPH 自然2. 试剂及仪器：盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，含有9毫升水的试管，无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，无菌水，酒曲，玻片，染液等。
三、实验方案：1、平板划线分离法（1）倒平板：将PDA培养基加热溶化，冷至55-60℃时，倒三个平板。
（2）划线：在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种坏，挑取10-1酒曲悬液在接种环上后在平板培养基上连续划线，划线结束后，盖上培养皿，倒置于室温培养48小时。
（3）接种培养：从分离的平板上单个菌落挑取少许菌苔，接种在PDA斜面培养基24小时。
2.显微镜观察：在试管斜面挑取少许菌苔，进行简单的染色后进行显微镜观察。
若发现有杂菌，需再进行一次分离，纯化，直到获得纯培养物。
3.根霉的制片①涂片：取一洁净的载玻片，再其中央部位滴加一小滴无菌水（或无菌生理盐水），用接种环以无菌操作从斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。
②干燥：涂布后，待其自然干燥。
③固定：将已干燥的标本涂面向上，在微火中通过3~4次进行固定④染色：将玻片平放，滴加1—2滴染液于涂片上（染液刚好覆盖薄膜为宜）吕氏碱性美蓝染色1~2min，石碳酸复红（或草酸铵结晶紫）染色约1min。
⑤水洗:倒去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。
⑥干燥：自然干燥，或用电吹风吹干，或用吸水纸轻轻吸干。
⑦镜检：涂片干后镜检。
四.实验结果预测及分析1.在PDA培养基上经过24小时培养后，培养基上形成一些大小各异的菌落。
分析：经过PDA培养基后使得只有根霉在培养基上存活，后经过划线分离使得菌落呈单个生长，生成一个个的单一疏松棉絮状菌落，。
2.在试管斜面菌落得以很好生长，且得到疏松絮状的形态统一的菌落。
有关酿酒微生物的研究技术程
有关酿酒微生物的研究技术程
酿酒微生物是指在酿酒过程中起主要作用的微生物，包括酵
母菌和乳酸菌等。
研究酿酒微生物的技术主要是通过分离、鉴
定和评价微生物菌种的特性，以及利用分子生物学和基因工程
技术研究酿酒微生物的遗传机制和代谢途径等。
酿酒微生物的分离和鉴定技术是研究酿酒微生物的基础，常
用的方法有传统的菌落计数、培养和鉴定，以及现代的分子生
物学方法。
传统的分离和鉴定方法主要是通过培养微生物在不
同培养基上的生长特性、形态和生理特性来进行鉴定，例如通
过菌落形态、孢子形态和色素产生等来判断菌种的差异。
而现
代的分子生物学方法则是通过提取微生物菌株的基因组DNA，使用PCR技术进行扩增，然后进行序列分析和比对，以确定微生物的属种和种类。
此外，还可以使用生物化学和生理学方法来评价酿酒微生物
的特性。
通过测定微生物对各种酵母营养源的利用情况、酶活
性和代谢产物等，可以评价其对酿酒过程中参数的影响和贡献。
在酿酒微生物的研究中，分子生物学和基因工程技术也扮演
着重要的角色。
通过基因克隆、基因敲除和基因表达等技术，
可以研究酿酒微生物的遗传机制和代谢途径，进一步了解其在
酿酒过程中的功能和作用。
例如，可以通过基因敲除得到某一
代谢途径的突变株，然后比较突变株和野生株在酿酒过程中的
差异，从而了解该代谢途径对酿酒的影响。
总结起来，研究酿酒微生物的技术主要包括传统的分离、培养和鉴定方法，以及现代的分子生物学和基因工程技术。
通过这些技术的应用，可以深入了解酿酒微生物的特性和功能，为酿酒工艺的改进和优化提供科学依据。
茅台酒酒曲中5株真菌的分离、纯化、鉴定初报
为球 形 ， 囊 为球 形 ， 直 径 为 １ ２ ｍ， 囊 表 面 顶 其 ０ｔ 顶 ｘ 全面 可 育 ， 包 结构 双 层 ， 基 （２ １ ）（～ ） ｍ， 产 梗 １ — ５×５ ７ 图 ５ 霉 菌 Ｒ。 菌 落和 个体形 态 的
，
全 面 可 育 ， 球 形 ， 面 全 面 可 表 育 ， 径 １２ ｍ 直 ０ｉ ｘ 孢 囊梗
顶囊
可育
，
可 育 ， 直 径 直径 ７０ ５ ｍ 直 径 ４ ｉｍ ３ ４ ｍ ２ ６ ｕ ｘ
．
黄 色 ， 长 度 在
９ ０ ｍ ６ｐ
单 层 ， 梗 （－ ０ 瓶 ８ １）
个 重 复 。３ 。 ２ Ｃ恒 温 培 养 ４ ｈ ７ ｈ 挑 取 平 板 上 带 ８￣２ ，
２ 结 果 与 分 析
５株真 菌菌 种 的培养 特 征和显 微 形态 如表 １ 。
有 个 体 特 征 为 霉 菌 的 单 菌 落 分别 接 种 于 Ｐ Ａ 培 Ｄ
第４ Ｏ卷 第 ４期
２１ 年１ 月 ０１ ０
菌 落质 地 ， 有无 分泌 物 等 。
１ ． 显微 形 态观察 ．４ ２
茅 台酒 酒 曲 ： 由贵州 茅 台酒 厂提 供 。 主 要 培 养 基 ：孟 加 拉 红 培 养 基 ， Ｄ 培 养 ＰＡ
基。
制 备 临 时 玻 片 ： 照 乳 酸 １ｇ 甘 油 ２ ｇ 苯 按 ０， ０， 酚 １ ｇ 蒸 馏水 １ｍｌ ０， ０ 的配方 配 制 乳 酸 苯 酚 液 。吸 取 一 滴 乳 酸 苯 酚 液 于载 玻 片 上 ，从 菌 落 的边 缘 挑 取 少 许 菌 丝 和 孢 子 置 于乳 酸 苯 酚 液 中 ，加 盖 玻 片 。显微 镜 下 观 察并 记 录菌 种 的 显微 形 态 ： 包 括 分生孢 子头 、 囊 、 孢 结构 、 基 、 梗 、 顶 产 梗 瓶 分
酒曲中产凝乳酶微生物菌株的分离筛选及鉴定
酒曲中产凝乳酶微生物菌株的分离筛选及鉴定腾军伟，赵 笑，杨亚威，张 健，赵爱梅，姜云芸，李 柳，郑 喆，杨贞耐*（北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京工商大学，北京 100048）摘 要：针对酒曲中的微生物进行分离纯化，得到11 株细菌和2 株真菌，并采用酪蛋白平板法和Arima 时间法筛选出了1 株产凝乳酶的细菌菌株编号为LB-51。
通过形态学观察、生理生化实验和16S rDNA 序列分析鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌，将该产凝乳酶菌株命名为解淀粉芽孢杆菌GSBa-1。
该菌株在液体LB 培养基中发酵72 h 产凝乳酶的凝乳活力为（431.53±15.89）SU /mL ，蛋白水解活力为（5.05±0.59）U /mL ，所产凝乳酶凝乳活力高而蛋白水解活力低，凝乳酶粗酶单位酶活力为1.54×105 SU /g 。
解淀粉芽孢杆菌GSBa-1是分离筛选自酒曲中的一株高产凝乳酶细菌，因此其来源安全，可作为工业化候选菌株进一步研究开发。
关键词：酒曲；凝乳酶；分离鉴定；解淀粉芽孢杆菌Isolation and Identification of Microbial Strains Producing Rennet from Jiuqu , a Traditional Chinese Fermentation StarterTENG Junwei, ZHAO Xiao, YANG Yawei, ZHANG Jian, ZHAO Aimei, JIANG Yunyun, LI Liu, ZHENG Zhe, YANG Zhennai *(Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, Beijing Engineering and Technology Research Center ofFood Additives, Beijing Technology & Business University (BTBU), Beijing 100048, China)Abstract: Eleven bacterial strains and two fungal strains were isolated from Jiuqu , a traditional Chinese fermentation starter for rice wine. Out of these, one bacterial strain, designated LB-51, capable of producing rennet was screened by the casein plate method and the Arima method. The strain was identified as Bacillus amyloliquefaciens by its morphological characteristics, physiological and biochemical tests (API 50CHB system) and 16S rDNA sequence analysis and species specific gene analysis and named as B. amyloliquefaciens GSBa-1. The rennet and proteolytic activities were (431.53 ± 15.89) SU /mL and (5.05 ± 0.59) U /mL, respectively, after 72 h shaking culture (120 r /min) at 30 ℃ for 72 h in liquid LB medium. The enzyme exhibited high milk-clotting activity and low protein hydrolysis activity. The milk-clotting activity was 1.54 × 105 SU /g. B. amyloliquefaciens GSBa-1, an efficient producer and a safe source of rennet activity, is worth further research and development as a candidate strain for industrial production of rennet.Key words: Jiuqu ; rennet; isolation and identification; Bacillus amyloliquefaciens DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716004中图分类号：TS252.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2017）16-0023-06引文格式：腾军伟, 赵笑, 杨亚威, 等. 酒曲中产凝乳酶微生物菌株的分离筛选及鉴定[J]. 食品科学, 2017, 38(16): 23-38. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716004. TENG Junwei, ZHAO Xiao, YANG Yawei, et al. Isolation and identification of microbial strains producing rennet from Jiuqu , a traditional Chinese fermentation starter[J]. Food Science, 2017, 38(16): 23-38. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716004. 收稿日期：2016-11-03基金项目：国家自然科学基金面上项目（31371804）；北京市百千万人才工程资助项目（B 类）；国家自然科学基金青年科学基金项目（31601488）；2016年北京工商大学研究生科研能力提升计划项目；公益性行业（农业）科研专项（201303085）作者简介：腾军伟（1988—），男，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。
山西边城酒大曲中优势霉菌的分离和形态鉴定
山西边城酒大曲中优势霉菌的分离和形态鉴定摘要：本研究对山西边城酒大曲样本进行初步分离、纯化，获得2种霉菌：l1和l2。
显微镜形态观察鉴定发现：l1菌株的菌落颜色为灰黑色、有细长皱褶、形状不规则、形态较大，l2菌株的菌落颜色为白色、菌丝呈放射状、形态较大，且l1和l2都可看到帚状的分枝和膨大的孢子囊；对2个菌株进行生理生化研究鉴定表明：利用氮源方面，两个菌株在含有酵母粉和牛肉膏的培养基中生长较好；利用碳源方面，2个菌株都能利用葡萄糖、半乳糖以及麦芽糖，但是都不利用蔗糖。
通过对边城酒的优势霉菌的检测，为边城酒生产过程中综合质量的提高提供理论依据；为酒曲生产工艺的改进提供理论基础。
关键词：边城酒；霉菌；酒曲；分离和鉴定中图分类号：ts262.3 文献标识码：a前言我国的酒类繁多，各具特色，并且我国酒文化的历史源远流长、酿酒技术历史悠久，早在夏朝时期就有历史记载。
酿酒的关键在于酒曲，酒曲可分为：麦曲、大曲、小曲、红曲、麸曲[1-2]。
对于边城酒的相关研究可以提高边城酒的生物营养价值，以及边城酒的综合质量[3]。
1 材料与方法1.1 实验材料山西省大同市天镇县边城酒酒厂提供。
1.2 培养基的制备查氏基础培养基：硝酸钠3g、磷酸氢二钾1g、氯化钾0.5g、蔗糖30g、琼脂15g、水1l、ph4.7。
在121℃下灭菌30min。
提供碳源培养基：葡萄糖、麦芽糖、硝酸钠1g、磷酸氢二钾1.3g、磷酸氢二铵0.5g、硫酸钠0.8g、水1l。
在121℃下灭菌30min。
提供氮源培养基：硫酸铵0.8g、蛋白胨、酵母粉、硝酸钠1g、亚硝酸钠1g、水1l。
在121℃下灭菌30min。
pda培养基：（去皮马铃薯、琼脂、水、葡萄糖）；取去皮处理干净的马铃薯200g，切成小块，加入水1000ml后煮沸30min左右，用多层纱布过滤，取滤汁，再依次加入琼脂、糖分装于试管中。
再在121℃下灭菌30min。
麦芽汁琼脂培养基：（干大麦、水、琼脂）；取干净干大麦泡在水中培养获得较长麦芽，把干麦芽捣碎糖化后过滤，获得滤汁，再加入琼脂形成培养基。
西藏青稞酒曲中真菌的分离与鉴定
西藏青稞酒曲中真菌的分离与鉴定郭小芳;王燕鸽;刘帅;罗开放;张柯【摘要】酒曲微生物对酒的产出率和品质有极大影响.研究西藏青稞酒酒曲中微生物的多样性对于高品质青稞酒的开发具有重要意义.取自西藏6个地区的9份民间青稞酒酒曲中分离、纯化得到67株霉菌;观察固体培养特征和显微特征,将这些菌株分为4个属,7个种,分别为总状毛霉(Mucor racemosus)、鲁氏毛霉(Mucor rouxii)、爪哇毛霉(Mucor javanicus)、米根霉(Rhizopus oryzae)、常现青霉(Penicillium frequentans)、灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)及粗糙脉胞菌(Neurospora crassa).【期刊名称】《西藏大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2014(029)002【总页数】7页(P37-43)【关键词】西藏青稞酒;酒曲;真菌;鉴定;分离【作者】郭小芳;王燕鸽;刘帅;罗开放;张柯【作者单位】西藏大学理学院西藏拉萨850000;西藏大学理学院西藏拉萨850000;西藏大学理学院西藏拉萨850000;西藏大学理学院西藏拉萨850000;西藏大学理学院西藏拉萨850000【正文语种】中文【中图分类】S512.3我国用曲酿酒已有几千年的历史，酒曲是中国酒酿造的糖化、发酵和生香剂,含有多种微生物及其产生的酶,其质量对酒的产出率和品质有极大的影响。
其中，酒曲微生物是制酒原动力，酒曲的质量离不开其微生物菌群功能的发挥。
因此，研究酒曲微生物的性能对揭示我国酒的酿造规律有着十分重要的意义。
随着科学技术与酿酒工业的发展，20世纪90年代以后，我国酒曲微生物的研究迅速兴起,并极大地推动了制曲酿酒的迅猛发展。
罗文等[1]从4种酒曲中分离得到7株糖化菌和4株酵母菌。
张东亮等[2]筛选出具有较高糖化和酯化能力的曲霉菌。
于博等[3]对广东肇庆传统小曲的优势霉菌进行了分离,得到糖化酶活力强的一株米根霉。
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酒曲中主要微生物的分离及鉴定
㈠实验目的：本实验对选取的优良酒曲进行微生物的分离和鉴定，把主要的优良功能菌种进行纯种保藏，希望能为酿酒优良
菌种的筛选、高效酒曲的生产提供参考。
㈡实验材料：1，酒曲微生物来源：经多次酿酒液发酵筛选得的优良民间传统酒曲。
2，主要培养基：牛肉膏-蛋白胨培养基
3，主要试剂：牛肉膏，蛋白胨，75%和95%酒精，10%
氯化钠，氢氧化钠-盐酸缓冲液（pH7.0） 4，仪器：培养皿，超净工作台，生化培养箱，普通光
学显微镜。
㈢实验方法：
1，牛肉膏-蛋白胨培养基的配制
⑴，配方及配量：牛肉膏0.3克，蛋白胨1克，氯化钠0.5
克，琼脂1.5克，水100ml,pH7.2-7.4。
⑵，称取药品
⑶，加热溶解
⑷，调pH值
⑸，分装：将配置好的培养基分装在相应的玻璃器皿内待灭
菌。
⑹，加棉塞
⑺，包扎：在棉塞外再包上一层牛皮纸，以防灭菌时冷凝
水直接沾湿棉塞及存放中防止尘埃等污染。
⑻，灭菌：将待灭菌的培养基放入加压灭菌锅内，于121℃
灭菌20min。
⑼，贮存：经无菌试验，证实培养基已灭菌彻底后，才能收
藏于冰箱或清洁的柜内贮存备用，在存放期间应尽量避
免反复移位或晃动等易造成污染的行为。
2，制备无菌生理盐水
称0.85克氯化钠至盛有100ml蒸馏水的三角瓶中，塞上棉塞，塞外包上一层牛皮纸，置加压蒸汽灭菌锅内121℃下灭菌20min 即为生理盐水。
3，酒曲悬液的制备：把所选取的酒曲均匀研成粉末并制成悬液。
⑴，取6-8支无菌试管，依次编号为10-1,10-2,10-3，…,10-6(或
10-8)；再取10套无菌培养皿，依次编号10-4,10-5,10-6（或
10-6,10-7,10-8），各稀释浓度做三个重复测定平板，留下一
个平板作空白对照。
⑵，以无菌操作法用 5ml移液管分别精确吸取4.5ml无菌的生
理盐水于上述各编号的试管中。
⑶，每次稀释待测菌的原始样液时，先将其充分摇匀。
然后用
1ml无菌移液管在原始样液中来回吹吸数次，再精确移取
0.5ml菌液至10-1的试管中，然后另取1ml无菌移液管，
以同样的方式，先在10-1试管中来回吹吸样品数次，并精
确移取0.5ml菌液至10-2的试管中，如此稀释至10-6（或
10-8）为止。
4，酒曲微生物的分离、纯化
分别取上述稀释液0.1ml，采用平板划线分离法接种于牛肉膏-蛋白胨培养基上；每个稀释浓度分别接种9个平板并各取3个平板分别置于18℃、25℃、30℃下培养1-3d，观察。