2015 《中国药典》无菌检查法修订解析
药典三部(2015版)-通则-1101微生物检查法
1101 无菌检查法无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。
若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
无菌检查应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求，检验全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度确认。
隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求.日常检验还需对试验环境进行监控。
培养基硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养，也可用于需氧菌培养；胰酪大豆胨液体培养基用于真菌和需氧菌的培养。
培养基的制备及培养条件培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基或成品培养基。
配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的环境,若保存于非封闭容器中，一般在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。
1. 硫乙醇酸盐流体培养基胰酪胨15.0g 氯化钠2.5g酵母浸出粉5。
0g 新配制的0。
1% 刃天青溶液1。
0ml无水葡萄糖5。
0g 琼脂0.75gL-胱氨酸0.5g 水1000ml硫乙醇酸钠0.5g（或硫乙醇酸) （0。
3ml）除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH为弱碱性,煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH，使灭菌后在25℃的pH值为7。
1±0.2。
分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层(粉红色）不超过培养基深度的1/2。
灭菌。
在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5,否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却,只限加热一次，并防止污染。
2015版中国药典微生物检查方法及培养基变更参照
2015版中国药典微生物检查方法及培养基变更参照1.无菌检查法1.1变更内容1.1.1无菌检查方面，使用胰酪胨大豆肉汤（胰酪胨大豆液体培养基/大豆酪蛋白肉汤培养基）取代改良马丁培养基与硫乙醇酸盐流体培养基配合进行细菌和真菌的全面微生物检测。
1.1.2菌液制备环节，使用胰酪胨大豆肉汤、胰酪胨大豆琼脂取代营养肉汤、营养琼脂进行金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和大肠埃希氏菌的菌液制备。
1.1.3菌液制备环节，使用沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基取代改良马丁培养基、改良马丁琼脂进行白色念珠菌和黑曲霉菌液的制备，同时对沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂的配方进行了变更。
1.1.4适用性试验中，胰酪胨大豆肉汤使用枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉进行灵敏度检查；硫乙醇酸盐流体培养基使用金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、生孢梭菌、铜绿假单胞菌进行灵敏度检查。
1.2培养基信息2010版2015版无菌检查/菌液制备——硫乙醇酸盐流体培养基无菌检查/菌液制备——改良马丁培养基菌液制备——改良马丁琼脂培养基菌液制备——营养肉汤菌液制备——营养琼脂无菌检查——0.5%葡萄糖肉汤培养基供试品制备——0.1%蛋白胨水培养基无菌检查/菌液制备——硫乙醇酸盐流体培养基无菌检查/菌液制备——胰酪胨大豆肉汤菌液制备——胰酪胨大豆琼脂菌液制备——沙氏葡萄糖琼脂菌液制备——沙氏葡萄糖肉汤无菌检查——0.5%葡萄糖肉汤培养基供试品制备——0.1%蛋白胨水培养基供试品制备——pH7.0氯化钠—蛋白胨缓冲液1.3参考文件（国家药典委员会—中国药典2015版附录征求意见稿—1101无菌检查法）http://w w /cms/new scenter/new s/000603.html2.非无菌产品微生物限度检查2.1变更内容2.1.1供试品制备环节，除了pH7.0氯化钠—蛋白胨缓冲液、pH6.8磷酸盐缓冲液、pH7.6磷酸盐缓冲液外，添加了pH7.2磷酸盐缓冲液和胰酪胨大豆肉汤。
无菌检查法PPT
无菌检测过程
无菌检测过程
• 结果判断
阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。否则，试验无效。 若供试品管均澄清， 或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定；若供试品管中任何 一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试 验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。当符合下列至少一个条件 时方可判试验结果无效： （1）无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查 法的要求。 （2）回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。 （3）供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的 物品和（或）无菌操作技术不当引起的。 试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查， 若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符。
6.革兰氏---染色
• •
• •
第一步：结晶紫使菌体着上紫色 （染色1min后用水洗） 第二步：碘和结晶紫形成脂溶性大分子复合物，分子大，能被细胞壁阻留在 细胞内。 （染色1min后用水洗） 第三步：酒精脱色，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水 洗细胞壁成分和构造不同，出现不同的反应。 第四步：番红复染3min，增加脱色菌与背景的反差并区别于未脱色菌
染色结果
• 保持初染时深紫色的菌体，称为革兰氏染 色阳性菌（G + 菌） • 而能染红色的菌体称为革兰氏染色 阴性菌（G - 菌）。
2015 年 版 《 中国药典 》 无菌检 查法的重大修订
1 、实验环境的重大修订 2、培养基体系的重大修订 3 、一、二、三部药典附录的整合修订。（...）
无菌检查法的重大修订
细菌
真菌
霉菌：黑曲霉
4.细菌的结构
• 基本结构：细胞壁、细胞膜、细胞质、核 质
15版《中国药典》微生物学检验技术实施指导与修订解读
一、15版药典结构—总述
药典由原来的三部改为四部，预计15年7月颁布执行： 其中一部、二部、三部分别为中药、化药、生物药， 四部：中国药典2015版总则，主要包括：
凡例：主要增加对检测方法适用性、制剂通则、辅料 标准适用性等的要求
杨凌化药质量部ＱＣ周国娟 电话：15991721352 2015.04.21
目录
一、15版药典结构； 二、非无菌产品微生物检查； 2.1微生物计数法 2.2控制菌检查法 2.3微生物限度标准 三、微生物实验室质量控制内容； 3.1实验菌株的质量控制 3.2培养基的质量控制实验 3.3微生物鉴定技术 四、制药用水的检验及修订内容； 五、药品微生物实验室规范指导原则增修订的内容
2.1微生物计数法
定义：系指对能在有氧条件下生长的嗜温细菌和 真菌的计数，不适用于活菌制剂的检查。本法 适用于检查非无菌制剂及其原料、辅料等是否 符合规定的微生物限度标准。
2015版 1105非无菌产品微生物限度检查--微生物计数 法
2.1微生物计数法
1、试验环境
操
2、供试液制备
作
流
3、培养基配制
1、根据供试品的理化特性与生物学特性，来制备供 试液。常用的制备方法详见“通则1105非无菌产 品微生物限度检查--微生物计数法”中规定。其 中不同于10版药典就是缓冲液、某些样品量的规 定有所变化；
2、供试液的浓度，按照方法确认的结论进行确定；
3、供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不 应超过45℃；
程
4、试验方法选择
5、培养计数及结果报告
2.1微生物计数法—试验环境
项目
检测 环境
2015版中国药典微生物限度检查法计数法修订解析
三、通用要求
5、计数方法 （1）平皿法：包括倾注法和涂布法。该项下明确可
使用直径较大平皿，且培养基的用量应相应增加。 （2）薄膜过滤法 （3）最大可能数（Most-Probable-Number Method,
简称MPN）。MPN法用于微生物计数时精确度较 差，仅在供试品需氧菌总数没有适宜计数方法时 使用，不适用于霉菌计数。 （4）方法选择原则：根据供试品理化特性和微生物 限度标准等因素选择。
一、修订背景
3、兼顾国情： （1）适用性试验增加供试品对照组 （2）菌种采用CMCC （3）检验量、样品制备依照《中国药典》
2010年版，与ICH不同。主要工艺、剂型限 制，例如贴剂检验量规定完全不同。
一、修订背景
4、依据以上原则修订后具有以下特点： （1）修订后的计数法明确了《中国药典》2010年
接种试验用菌株后， 30～35 ℃ 培养不超过72小时，与对照培
养基比较，试验菌应生长良好。（建议：培养基呈混浊的液体， 或划线于相应的分离平板上，培养后呈现典型菌落）
备注：该培养基同时用于稀释液的制备和控制菌检查时，需要考虑同时满足计数 和控制菌检查培养基适用性检查控制要求。
四、培养基适用性检查
一、修订背景
• 2、方法科学性和灵活性 • （1）准确度：方法适用性试验模拟样品污
染微生物后进行方法试验性验证。 • （2）精密度：结果判定以变化范围进行规
定，符合微生物计数规律。 • （3）培养体系：采用更适宜的培养体系。 • （4）偏差调查：微生物检验结果偏差调查
的引入。 • （5）与微生物指导原则、理念有机统一。
2015年版《中国药典》微生物限 度检查法计数法修订解析
一、修订背景
• 1、国际化 • （1）美国、欧盟、日本制药产品占世界市场份额
15版20版药典无菌检查法对比
序
2015 版药典
2020 版药典
对比说明
号
1. 无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原 无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器械
——
料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。
具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。
2. 单向流空气区、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒 单向流空气区、工作台面及受控环境应定期按医药工业洁净室
13. 0.1%无菌蛋白胨水溶液取蛋白胨 1.0g，加水 1000ml，微温溶解，滤清， 0.1%无菌蛋白胨水溶液取蛋白胨 1.0g，加水 1000ml，微温溶解，
——
调节 pH 值至 7.1±0.2，分装，灭菌。
必要时滤过使澄清滤清，调节 pH 值至 7.1±0.2，分装，灭菌。
14. pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液取磷酸二氢钾 3.56g，无水磷酸氢二钠 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液取磷酸二氢钾 3.56g，无水磷酸
22. 供试品处理及接种培养基：操作时，用适宜的消毒液对供试品容器表面 进行彻底消毒，如果供试品容器内有一定的真空度，可用适宜的无菌器 材（如带有除菌过滤器的针头）向容器内导入无菌空气，再按无菌操作 启开容器取出内容物。
23. 薄膜过滤法：薄膜过滤法一般应采用封闭式薄膜过滤器。无菌检查用的 滤膜孔径应不大于 0.45μm。 直径约为 50mm。根据供试品及其溶剂的
培养基应保存在 2～25℃、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般 菌程序灭菌。 制备好的培养基应保存在 2～25℃、避光的环境，
在 3 周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。
若保存于非密闭容器中，一般在 3 周内使用；若保存于密闭容器中，
讲义五：2015年版版中国药典四部增修订情况
讲义五：2015年版版中国药典四部增修订情况第一篇：讲义五：2015年版版中国药典四部增修订情况2015 年版《中国药典》四部增修订概况2015年版《中国药典》已于2015年6月5日由国家食品药品监督管理总局正式颁布。
2015年版《中国药典》最大的变动之一是将原药典各部附录整合，并与药用辅料标准单立成卷，首次作为《中国药典》第四部，解决了长期以来药典各部共性检测方法重复收录、彼此之间方法不协调、不统一、不规范，给药品检验实际操作带来不便的问题。
2015年版《中国药典》四部内容包括凡例、通则和药用辅料，药典通则涵盖了通用性要求、检验方法、指导原则以及试剂和标准物质等药品标准的共性要求，是药典标准的基础，不但反映了我国药品质量控制整体状况和药品检验技术水平;同时也对规范药品研究、生产、检验、加强药品监管发挥重要作用。
现就2015年版《中国药典》四部整体情况简要介绍如下。
1.2015 年版《中国药典》四部增修订整体情况2015 年版《中国药典》四部收载通则总数317个;将药典一部、二部、三部制剂整合后共计38个;检测方法附录287个，其中新增通则28个(检定方法通则27个、制剂通则1个)，整合通则63个，修订通则67 个;新增生物制品总论3个;指导原则共计30个，其中新增15个，修订10个。
辅料收载总数约270个品种，其中新增137 个，修订97个，不收载2个。
2.2015 年版《中国药典》四部主要特点2.1 整体提升质控水平《中国药典》凡例、通则、总论是药典的重要组成部分，对药品标准的检测方法和限度进行总体规定，对药典以外的其他药品国家标准具同等效力。
通过对2010年版《中国药典》相关内容的全面增修订，全面完善了药典标准基本共性规定(表2)，从整体上提升对药品质量控制的要求，形成了以凡例为统领，通则为同类药品基本准则、各论作为基本要求的药典标准体例。
药品标准控制更加全面化、系统化、规范化。
2.2 药典标准体系更加完善 2015年版《中国药典》四部首次纳入“国家药品标准物质通则”以及“国家药品标准物质制备指导原则”、“药包材通用要求”和“药用玻璃材料和容器”等指导原则，进一步完善了药用辅料和药包材通用性要求，从影响药品质量的等各方面，包括原料药及其制剂、药品标准物质、药用辅料和药包材的制定控制要求，形成了全面、完善的药典标准体系。
药品微生物检查和无菌检查
硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml，胰酪
大豆胨液体培养基每管装量不少于10ml。供试品检
查时，培养基的用量和高度同方法适用性试验。
一 5.供试品的无菌检查
、
• 培养及观察
无
– 将上述接种供试品后的培养基容器分别按各培
菌
养基规定的温度培养14天；接种生物制品供试 品的硫乙醇酸盐流体培养基的容器应分成两等
药品微生物检查和无 菌检查
本课件是结合《中国药典》 2010年版与 2015年版通则微生物内容第三次公示稿 (2014-09-28发布)进行讲解。
网址：
2015年版微生物学检验中的重大修订及意义
1、实验环境的重大修订 ①无菌检查环境洁净度规定 ②微生物限度检查环境洁净度规定
2、培养系统的重大修订 ①无菌检查中培养基的修订 ②微生物计数法中培养基的修订 ③控制菌检查法中控制菌的修订 ④抑菌效力测定法中培养基的修订
菌
– 1、非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法
产 品
– 2、非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法
微
– 3、非无菌药品微生物限度标准
生
物
限
度
检
查
二 1.非无菌产品微生物限度检查：
、 非
----微生物计数法
无
1.1 总则：环境、要求
菌
1.2 计数方法：平皿法、薄膜过滤法、最可能数法
产
（MPN法）
品
30~35℃
18h~24h
生孢梭菌
硫乙醇酸盐流体培养基
白色念珠菌 黑曲霉
沙氏葡萄糖液体（琼脂）培 养基 【10版：改良马丁 （琼脂）培养基 】
沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基
或用适宜方法制成孢子悬液 【10版：改良马丁琼脂斜面 培养基 】