PCR技术基本原理及相关知识
PCR技术与原理
PCR技术与原理PCR（聚合酶链式反应）是一种在体外扩增DNA片段的技术，是基因工程和分子生物学中最重要的实验方法之一、PCR技术基于DNA复制的自然原理，通过反复进行多轮DNA扩增，从而快速、高效地产生大量特定DNA片段。
PCR技术的基本原理是模拟DNA复制过程。
DNA复制是由DNA聚合酶酶催化完成的，它不断在DNA模板上合成新的DNA，复制出两个完全相同的DNA分子。
PCR反应中需要三种主要成分：模板DNA、DNA聚合酶和引物。
PCR反应的具体步骤如下：1.反应体系的混合：PCR反应需要合适的反应体系，包含了合适的缓冲液、DNA聚合酶、引物和核苷酸。
反应体系的组成需要根据所需扩增的DNA片段的特点来调整。
2. Denaturation（变性）：PCR反应开始，反应体系会被加热到94-98℃的高温，使DNA两条链分离。
高温能够破坏氢键，使DNA分子解旋成两个单链。
这个步骤通常需要30-60秒。
3. Annealing（退火）：反应体系在退火温度（一般为50-65℃）下冷却，使引物与模板DNA 片段结合。
引物是两个向相互补的DNA片段，它们会定向结合到模板DNA 上。
这个步骤通常需要20-40秒。
4. Extension（延伸）：反应体系温度提高到68-72℃，正常的体温使DNA聚合酶催化引物向其互补的DNA链上延伸合成新的DNA。
这个步骤通常需要1-2分钟。
延伸的过程中酶会不断合成新的DNA分子，原有DNA的双链结构再次恢复。
5.重复步骤：上述三个步骤会反复进行多次，每轮循环会使DNA片段数目呈指数级增加。
通常反应会重复25-35轮，每一轮的反应时间在几十秒到几分钟之间。
经过多轮循环之后，原始的DNA片段会被扩增成数百万甚至数十亿个拷贝。
1.高度灵敏：PCR可以检测并扩增极低浓度的DNA片段。
只需少量的模板DNA，就能够在短时间内扩增出足够多的DNA片段。
2.特异性：PCR反应中引物的特异性决定了扩增的DNA片段的特异性。
PCR技术基本原理及相关知识
PCR技术基本原理及相关知识PCR（聚合酶链式反应）是一种分子生物学技术，用于扩增DNA分子。
PCR技术革命性地改变了分子生物学的研究和应用领域，并且在医学、农业、环境科学等领域具有广泛的应用。
以下是PCR技术的基本原理及相关知识。
1. 变性（Denaturation）：将目标DNA融合成两条单链，使其成为单股DNA。
在PCR反应开始时，样本中的DNA经过高温处理（通常为95°C），使其双股DNA分离，形成单股DNA。
2. 退火（Annealing）：通过引入两个特异性引物，使其与目标DNA的靶序列互补结合。
延伸引物是由短的DNA或寡核苷酸片段（18-24个核苷酸）组成的特定DNA序列，它与目标序列的两端相互补。
在PCR反应温度较低时（通常为50-65°C），引物结合到目标DNA的两端。
3. 延伸（Extension）：通过DNA聚合酶的催化，将引物与目标DNA形成的复合物延长，生成新的DNA分子。
在PCR反应中，引物延长所需要的二倍体DNA将通过DNA聚合酶的催化作用来实现。
DNA聚合酶能够识别引物与模板DNA之间的同源性，并在引物的3'末端开始合成新的DNA链。
以上三个步骤组成一个PCR循环，每个循环将扩增目标DNA的数量。
通常，在30-40个PCR循环后，目标DNA的量将扩增到百万级。
1.DNA模板：DNA模板是PCR反应的起点，它可以是基因组DNA、cDNA或已知序列的DNA片段。
2.引物设计：引物的选择非常重要，引物应该与目标DNA序列的两端相互补，以确保引物的有效结合和延长。
3. DNA聚合酶：DNA聚合酶是PCR反应的催化剂，通常使用热稳定聚合酶（如Taq聚合酶）。
热稳定聚合酶能够在高温下保持稳定，并且具有较高的DNA聚合活性。
4.PCR缓冲液：PCR反应需要在特定的pH和离子浓度条件下进行，PCR缓冲液可以提供适宜的反应环境。
5.循环条件：PCR反应需要在特定的温度条件下进行循环反应。
pcr技术的知识点
pcr技术的知识点PCR，全称为聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），是一种在体外扩增DNA分子的技术。
自从其产生以来，PCR技术在生物学、医学等领域都扮演着重要角色。
本文将介绍PCR技术的基本原理、主要步骤及其应用。
一、PCR技术的基本原理PCR技术是利用DNA聚合酶能够在适宜条件下从单链DNA模板向其补体的方向合成新的互补双链DNA的特性，通过体外操作使目标DNA区段被扩增的一种技术。
PCR技术相当于“放大器”，它把少量的DNA分子扩增成数百万分子，这种扩增是平凡的、快速的和特异的。
PCR从样本中扩增一段特定目的序列的DNA，应该是由以下三个部分所组成：一段待扩增的DNA序列，一对荧光探针（引物）和一种特殊的聚合酶。
PCR反应主要可分为以下三个阶段：1. 解旋（Denaturation）：将待扩增的DNA序列在高温条件下变性，形成两条单链DNA模板。
2. 引物与合成（Annealing and Extension）：在低温条件下，引物与模板DNA的互补匹配，并由聚合酶在其5'-3'方向上合成新的DNA链。
3. 延伸（Extension）：利用DNA聚合酶在适宜温度下合成新的互补双链DNA，形成两个完全相同的分子。
通过不断的循环这三个阶段，从而使得PCR反应体系中的待扩增物质呈指数级别的增长。
二、PCR技术的主要步骤PCR主要分为以下几个步骤：1. 样品获取PCR技术对样品数量和质量要求较高。
通常采用的是细胞、肝脏、皮肤、血液等组织或器官中提取DNA分子作为扩增目标。
同时，需要注意样品的保存和处理以避免DNA降解。
2. DNA提取DNA提取技术是PCR技术的基础。
不同的样品需要采用不同的DNA提取方法，常见的DNA提取方法有基于酸性、碱性或复合的物理或化学方法等。
3. 引物设计PCR扩增需要引物特异性和长度适宜，且引物与待扩增的DNA序列互补匹配度高，通常由专业的引物设计软件完成。
pcr技术的原理及应用
PCR技术的原理及应用1. PCR技术概述PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种基因工程技术，用于在体外扩增DNA片段。
它是由美国生物化学家Kary B. Mullis于1983年发明的，已经成为现代分子生物学和生物医学研究中最基础和最重要的技术之一。
PCR技术的原理是通过逐渐增加DNA双链的方法，在体外扩增某一特定DNA片段，使之达到可以测定和分析的水平。
PCR技术的基本原理包括DNA的变性、引物的结合和DNA合成。
2. PCR技术的步骤PCR技术通常包括以下三个主要步骤：2.1 变性（Denaturation）PCR反应开始时，DNA样本被加热至高温（通常是94-98℃），使DNA双链变性，即将两个DNA链分离成两条单链。
2.2 引物结合（Annealing）PCR反应温度下降时，引物与目标DNA片段中的互补序列结合。
引物是短的DNA片段，以逆向互补的方式与目标DNA序列的两端配对。
引物的选择是PCR反应成功的关键，需要根据目标序列的特性进行设计。
2.3 DNA合成（Extension）在PCR反应过程中，酶（通常是热稳定的DNA聚合酶）通过引物作为起始点，沿着DNA模板合成新的DNA链。
该过程通常在高温下进行，使酶能够稳定在DNA链上进行复制。
每个PCR循环会产生两条新的DNA链，其中一条是目标序列的补充链。
3. PCR技术的应用PCR技术广泛应用于各个领域，包括基因检测、遗传学研究、医学诊断和法医学等。
3.1 基因检测PCR技术可以用于检测和鉴定各种基因突变、插入、缺失等基因变异。
通过PCR技术可以扩增出需要检测的基因片段，并可以通过其他技术（如DNA测序）对扩增产物进行分析和验证。
3.2 遗传学研究PCR技术在遗传学研究中起着重要的作用，可以用于DNA指纹鉴定、基因组重组、基因表达调控研究、基因治疗等方面。
例如，PCR技术被广泛应用于DNA 指纹鉴定，通过对DNA样本进行PCR扩增和电泳分析，可以确定个体之间的遗传关系。
pcr概念和基本原理
pcr概念和基本原理
PCR（聚合酶链式反应）是一种基于DNA复制的体外合成DNA的技术。
它是由克利夫·库里思和凯瑟琳·穆利斯于1983年发明的，该技术后来获得了1993年的诺贝尔化学奖。
PCR的基本原理如下：
1. 反应体系：PCR反应需要DNA模板、DNA引物、DNA聚合酶、dNTPs（四种脱氧核苷三磷酸）以及缓冲液等组成的反应体系。
2. Denaturation（变性）：反应开始时，将反应体系加热至高温（通常为94-98℃），使DNA双链分离成单链。
这一步骤将使模板DNA的两条链分开，使引物能够结合。
3. Annealing（退火）：将反应体系降温至50-65℃，使引物与模板DNA的单链互补配对。
引物是一段短DNA序列，它会识别并结合模板DNA的特定区域。
4. Extension（延伸）：将反应体系温度升高至72℃，加入DNA聚合酶以及dNTPs。
DNA聚合酶会从引物结合的位置开始向模板链的3'端延伸，并在每个引物的序列上合成一条新的DNA链。
以上的三个步骤构成了PCR的一个循环。
在一个PCR反应过程中，这个循环可以重复多次，通常需要进行20-40个循环。
每次循环都会使目标DNA区域的数量成倍增加，因此可以在
几小时内从极少量的DNA样本中合成大量的DNA。
PCR可以用于多种应用，包括基因突变的检测、DNA序列的测定、基因克隆、疾病诊断等。
它在分子生物学研究、医学诊断和法庭鉴定等领域起着重要作用。
pcr技术基本原理
pcr技术基本原理PCR技术基本原理。
PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种在分子生物学和生物技术领域中被广泛应用的技术，它能够迅速、高效地复制DNA片段。
PCR技术的基本原理是通过不断重复的循环反应，将少量的DNA片段扩增至足够多的数量，从而能够进行进一步的分析和研究。
PCR技术的基本原理包括三个主要步骤，变性、退火和延伸。
在PCR反应中，首先将待扩增的DNA片段加热至高温，使其两条链分离，这个过程称为变性。
接下来，降温使引物与目标DNA序列结合，这个过程称为退火。
最后，通过DNA聚合酶的作用，引物延伸合成新的DNA链，这个过程称为延伸。
PCR技术的关键因素之一是引物的设计。
引物是PCR反应中的重要组成部分，它们是用来识别目标DNA序列并作为DNA合成的起始点。
引物的设计需要考虑目标DNA序列的特点，如长度、GC含量、配对性等，以确保引物能够特异性地结合目标DNA序列，避免出现非特异性扩增。
另一个关键因素是PCR反应体系的优化。
PCR反应需要合适的温度、时间和反应物浓度来保证反应的高效进行。
合理选择反应体系的条件，可以提高PCR反应的特异性和效率，避免产生非特异性产物或者引物二聚体。
PCR技术的应用非常广泛，包括基因克隆、基因突变分析、病原体检测等。
在基因克隆中，PCR技术可以快速扩增目标基因片段，为后续的克隆和表达提供足够的DNA模板。
在基因突变分析中，PCR技术可以通过扩增目标基因片段，进而进行测序分析，从而检测基因的突变情况。
在病原体检测中，PCR技术可以快速、灵敏地检测病原体的存在，为疾病的早期诊断提供帮助。
总之，PCR技术作为一种高效、快速、特异性的DNA扩增技术，在分子生物学和生物技术领域扮演着重要的角色。
通过深入理解PCR技术的基本原理，合理设计引物和优化反应条件，可以更好地应用PCR技术进行科研和实验工作，为生命科学领域的发展做出贡献。
PCR技术的不断发展和应用，将为人类健康和生命科学研究带来更多的机遇和挑战。
请简述PCR的原理及应用
PCR的原理及应用1. PCR的原理PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应）是一种用于扩增特定DNA 片段的基因技术。
其基本原理是通过逐渐增加DNA片段的数量，使之达到可以检测的水平。
PCR的核心步骤包括三个温度循环：变性（denaturation）、退火（annealing）和延伸（extension）。
•变性：将DNA双链分离成单链，通常在95℃下进行，这个步骤会导致DNA链断裂。
•退火：在较低的温度下（通常在50-65℃之间），引入特定的引物（primers），使其与DNA片段的末端互补连接。
引物是短的DNA序列，能够识别特定的DNA片段。
•延伸：借助DNA聚合酶（DNA polymerase）的作用，在适合其工作的温度下（通常在72℃），DNA聚合酶沿着DNA模板链在引物的引导下合成新的DNA链。
这样，每个循环都会生成两倍于初始DNA片段数的DNA片段。
PCR通常需要进行多个循环，每个循环的结果都是上一个循环的DNA片段数量的两倍。
由于指数级的扩增，几个循环之后，初始数量非常少的DNA片段就可以被扩增到足够多的数量，以便进行后续分析。
PCR中的关键因素包括引物的设计和选择、DNA聚合酶的选择以及PCR反应体系的条件设置等。
正确的引物设计和选择可以确保PCR扩增特定的DNA片段，而DNA聚合酶的选择和PCR反应体系的条件设置会影响PCR的效率和特异性。
2. PCR的应用PCR技术已经广泛应用于许多领域，其应用范围不断扩大。
以下是PCR技术的一些常见应用：2.1. 遗传病的诊断和筛查PCR技术可以用于遗传病的诊断和筛查。
通过设计引物，可以扩增特定基因的DNA片段，并进行后续的序列分析和突变检测，以确定是否存在遗传病相关的突变。
2.2. 基因工程和转基因研究PCR在基因工程和转基因研究中起到了关键作用。
它可以用于克隆目的基因，构建基因表达载体，并将目的基因导入到目标细胞中。
几种pcr的原理及应用
几种PCR的原理及应用1. PCR简介PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应）是一种基于DNA聚合酶的体外扩增技术。
该技术可以在短时间内大量复制特定DNA序列，从而方便进行基因分析、疾病诊断、基因工程等研究和应用。
2. PCR基本原理PCR的基本原理是通过反复进行DNA的三步循环复制，每一步循环被称为一轮PCR循环。
每一轮PCR循环包括三个步骤：变性、退火和延伸。
2.1 变性变性步骤使得DNA双链解开，得到两条单链DNA。
这一步骤通常在高温下进行，通过断裂氢键使DNA双链解开。
2.2 退火退火步骤是将两个引物结合到目标DNA序列的两侧，使引物可以作为DNA复制的起始点。
引物的设计需要与目标DNA序列的两端互补，以确保特异性扩增。
2.3 延伸延伸步骤是通过DNA聚合酶酶活性，引物向目标DNA序列方向延伸合成新的DNA链。
这个过程是通过向反应体系中加入四种碱基（dNTPs）来完成的。
3. PCR的应用PCR技术被广泛运用于许多领域，特别是在分子生物学和医学研究中。
以下是几种PCR的应用：3.1 基因分型PCR可以用于基因的分型，例如确定某个基因是否存在突变。
通过引物的设计，PCR可以扩增出目标基因片段，进而通过测序等方法进行基因分型和分析。
3.2 疾病诊断PCR可以用于疾病的诊断，特别是对于遗传病的检测。
通过扩增疾病相关基因的片段，可以判断患者是否携带该疾病基因。
3.3 基因工程PCR在基因工程中也有广泛应用。
例如，通过PCR扩增目标基因，将其插入到表达载体中，构建重组蛋白表达系统。
3.4 环境微生物学PCR可以用于环境中微生物的检测和鉴定。
通过扩增微生物的特定DNA片段，可以确认环境样本中是否存在特定的微生物群体。
3.5 法医学和犯罪学PCR可以应用于法医学和犯罪学领域，例如通过对DNA样本进行PCR扩增，可以确定嫌疑人的DNA指纹，用于刑事案件的鉴定。
以上仅是PCR技术在多个领域中的一些典型应用，随着DNA技术的不断发展，PCR在更多领域中的应用也将不断扩大。
PCR技术基本原理及相关知识
PCR技术基本原理及相关知识PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学和遗传学研究中常用的基因扩增技术，其基本原理是利用体外体内的DNA聚合酶（通常是热稳定聚合酶）在DNA模板上进行逐渐增加的连续DNA合成过程。
1. 变性（Denaturation）：将DNA双链融解成两条单链。
通常使用高温（约94-98℃）使DNA的双链结构分离，使得DNA模板变为两个单链，以便后续的反应。
2. 退火（Annealing）：在较低的温度下，引物（primers）与DNA模板结合。
引物是一段长度为15-30个核苷酸的短DNA或RNA分子，能与目标DNA序列的两端互补碱基对结合。
这些引物在PCR反应中起到限制DNA合成的作用。
3. 扩增（Extension）：在适温下，DNA聚合酶利用引物开始在目标DNA序列作为模板上进行DNA合成，不断扩增目标序列。
常用的DNA聚合酶是热稳定的聚合酶，常见的是来自热液单纯病毒Taq聚合酶。
PCR反应通常进行30-40个循环，每个循环包括上述三个步骤。
每个循环的时间和温度取决于目标DNA序列和反应条件。
除了基本的PCR技术原理，以下是一些相关知识：1. 反向转录PCR（Reverse Transcription PCR，RT-PCR）：可以在RNA模板上合成相应的DNA序列，通过引物合成cDNA，然后进行PCR。
RT-PCR常用于分析转录水平、检测RNA病毒和研究基因表达调控。
3. 嵌段PCR（Nested PCR）：在传统的PCR反应后，再次进行PCR，使用内部引物扩增上一次PCR反应获得的产物。
嵌段PCR提高了灵敏度和特异性。
4. 随机引物PCR（Random Primed PCR）：使用随机引物作为引物，能扩增DNA模板上的所有可能的序列，常用于建立基因文库和DNA指纹。
PCR技术在许多领域应用广泛，如医学诊断、遗传学研究、基因工程等。
其快速、高效、灵敏和特异性的特点使其成为现代生物学研究中不可或缺的工具。
pcr的原理及应用
pcr的原理及应用
PCR(聚合酶链反应)是一种常用的基因扩增技术，其原理是通过复制DNA模板来扩增目标DNA片段的数量。
该技术主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在PCR反应开始时，通过将反应体系加热至95℃左右，DNA 双链分子会解旋成两条单链DNA。
然后，将反应温度降低至50-65℃，进入退火阶段。
在此温度下，引物(一对常规是20-30碱基的DNA片段)会与模板DNA的互补序列结合，形成DNA-RNA杂交体。
最后，将反应体系温度升高至72℃，此时酶Taq聚合酶能够在DNA模板上从引物的3'端向5'端逆向延伸，合成一条与模板DNA互补的新的DNA链。
PCR技术有广泛的应用。
首先，PCR常用于基因测序，可以扩增目标DNA片段，使其达到测序所需的足够数量。
此外，PCR也可用于检测基因突变、揭示疾病相关的遗传变异以及进行谱系分析。
另外，PCR还可用于鉴定DNA样本的来源，如在法庭上用作法医学证据。
此外，PCR也被广泛应用于生物学研究、医学诊断和农业领域等。
值得注意的是，在进行PCR实验时，需要严格控制反应条件和杂交引物的设计，以确保扩增的目标片段具有高度的专一性和准确性。
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PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
PCR的反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。
反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。
Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。
平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。
反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。
大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。
PCR反应体系的基本成分：模板DNA、特异性引物、DNA聚合酶、dNTP、Mg2+的缓冲液。
PCR反应体系与反应条件--------------------------------------------------------------------------------标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA 0.1～2ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水至100ulPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
催化一典型的PCR反应约需酶量2。
5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。
dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH 或1M Tris。
HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。
多次冻融会使dNTP降解。
在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。
浓度过低又会降低PCR产物的产量。
dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。
SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。
提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。
一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。
RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K 法，要防止RNase降解RNA。
Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。
Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
PCR反应条件的选择PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。
在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。
对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。
①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。
一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。
此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。
变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。
由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。
退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。
对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。
引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)复性温度=Tm值-(5～10℃)在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。
复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：70～80℃150核苷酸/S/酶分子70℃60核苷酸/S/酶分子55℃24核苷酸/S/酶分子高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA 片段，延伸时间1min是足够的。
3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。
延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。
对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
循环次数循环次数决定PCR扩增程度。
PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。
一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。
PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
⑤模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。
或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR 失败的原因之一。