PCR技术介绍PPT课件
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PCR技术教程PPT课件
Ct值的含义：每个反应管内的荧光信号到达设定的 阈值时所经历的循环数。
第10页/共71页
特别说明： 1、荧光探针和荧光染料：
分别用探针或荧光染料与特异序列结合来指示扩增产物，前者特异性高， 后者操作简单。
TaqMan探针：寡核苷酸探针，荧光基团连接在5’端，淬灭基因连在3’
端。5’端荧光基团吸收能量后转移给临近的3’端淬灭基团，发生共振能 量转移（FRET），只要探针完整，能量就会被淬灭。
GC含量；避免连续相同碱基排列或开成回纹结构；避免形成引 物二聚体。 5、Tm=(G+C)×4+(A+C) ×2 6、primer 5.0 7、模板纯度：不一定要纯，但要确定不含蛋白变性剂、DNA酶、 Mg2+螯合剂等。模板量（100ng/100μl）
第5页/共71页
PCR类型：
普通PCR RT-PCR TAIL-PCR Real-time PCR 数字PCR
循 环
56℃ 72℃
退火 延伸
目的：引物先与模板匹配 1-2 min 目的：聚合酶在引物3’端加
核苷酸，合成新链
12℃ 保存
特异性强、灵敏度高、快速、简便
第3页/共71页
循环次数 1 2 3 20 30
DNA数量 2 4 8
1048576 1073741824
第4页/共71页
特殊说明：
1、Taq酶：具有5’→3’聚合酶和外切酶活性，无3’→5’外切酶活性， 不
第8页/共71页
第9页/共71页
原理：在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料（如 SYBR GREEN 1）或特异性的荧光探针（如
Taqman探 针），利用荧光信号累积实时检测整个PCR过程，
再 通过标准曲线或内参基因对未知基因进行定量分析 的方法。
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特别说明： 1、荧光探针和荧光染料：
分别用探针或荧光染料与特异序列结合来指示扩增产物，前者特异性高， 后者操作简单。
TaqMan探针：寡核苷酸探针，荧光基团连接在5’端，淬灭基因连在3’
端。5’端荧光基团吸收能量后转移给临近的3’端淬灭基团，发生共振能 量转移（FRET），只要探针完整，能量就会被淬灭。
GC含量；避免连续相同碱基排列或开成回纹结构；避免形成引 物二聚体。 5、Tm=(G+C)×4+(A+C) ×2 6、primer 5.0 7、模板纯度：不一定要纯，但要确定不含蛋白变性剂、DNA酶、 Mg2+螯合剂等。模板量（100ng/100μl）
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PCR类型：
普通PCR RT-PCR TAIL-PCR Real-time PCR 数字PCR
循 环
56℃ 72℃
退火 延伸
目的：引物先与模板匹配 1-2 min 目的：聚合酶在引物3’端加
核苷酸，合成新链
12℃ 保存
特异性强、灵敏度高、快速、简便
第3页/共71页
循环次数 1 2 3 20 30
DNA数量 2 4 8
1048576 1073741824
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特殊说明：
1、Taq酶：具有5’→3’聚合酶和外切酶活性，无3’→5’外切酶活性， 不
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原理：在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料（如 SYBR GREEN 1）或特异性的荧光探针（如
Taqman探 针），利用荧光信号累积实时检测整个PCR过程，
再 通过标准曲线或内参基因对未知基因进行定量分析 的方法。
pcr技术课件
数据处理
对实验数据进行统计分析，如计算Ct值、分析扩增效率等。
04
pcr技术的优化和注意事项
优化pcr反应条件
01
02
03
温度循环
优化pcr反应的变性、退 火、延伸等温度循环，以 提高扩增效率和特异性。
镁离子浓度
调整镁离子浓度，以获得 最佳的pcr扩增效果，镁 离子浓度过高或过低都可 能影响扩增效率。
02
pcr技术的基本原理
核酸的复制
核酸是生物体的遗传物质，负 责携带和传递遗传信息。
在细胞内，核酸通过复制传递 遗传信息，确保遗传信息的稳 定性和连续性。
核酸复制过程中，DNA双链解 开，以母链为模板，r技术基于核酸的复制原理， 通过特定的引物和耐高温的DNA 聚合酶，在体外实现核酸的快速
数字PCR技术具有高灵敏度和高特异性，但设备成本较高；实时PCR技术具有操作简便和 成本较低的优点，但在灵敏度和特异性方面可能略逊于数字PCR技术。
pcr与其他技术的结合
pcr技术与测序技术的结 合
通过将PCR技术和测序技术相结合，可以实 现高通量、高精度的核酸分子检测和分析， 有助于深入研究和理解基因组学和转录组学 等领域。
pcr技术的应用领域
遗传病诊断
通过检测特定基因的突变，对遗传病 进行早期诊断和产前诊断。
微生物检测
用于检测和鉴定细菌、病毒和其他微 生物，在食品安全、环境保护和疾病 控制等领域有广泛应用。
古生物学和考古学
用于分析古代生物遗骸的DNA，研 究物种进化和人类起源。
法医学
用于鉴定个体身份、亲子关系和生物 样本的来源，在犯罪调查和法庭科学 中具有重要应用价值。
扩增。
pcr反应体系中包含模板DNA、 引物、dNTPs和耐高温的DNA聚
对实验数据进行统计分析，如计算Ct值、分析扩增效率等。
04
pcr技术的优化和注意事项
优化pcr反应条件
01
02
03
温度循环
优化pcr反应的变性、退 火、延伸等温度循环，以 提高扩增效率和特异性。
镁离子浓度
调整镁离子浓度，以获得 最佳的pcr扩增效果，镁 离子浓度过高或过低都可 能影响扩增效率。
02
pcr技术的基本原理
核酸的复制
核酸是生物体的遗传物质，负 责携带和传递遗传信息。
在细胞内，核酸通过复制传递 遗传信息，确保遗传信息的稳 定性和连续性。
核酸复制过程中，DNA双链解 开，以母链为模板，r技术基于核酸的复制原理， 通过特定的引物和耐高温的DNA 聚合酶，在体外实现核酸的快速
数字PCR技术具有高灵敏度和高特异性，但设备成本较高；实时PCR技术具有操作简便和 成本较低的优点，但在灵敏度和特异性方面可能略逊于数字PCR技术。
pcr与其他技术的结合
pcr技术与测序技术的结 合
通过将PCR技术和测序技术相结合，可以实 现高通量、高精度的核酸分子检测和分析， 有助于深入研究和理解基因组学和转录组学 等领域。
pcr技术的应用领域
遗传病诊断
通过检测特定基因的突变，对遗传病 进行早期诊断和产前诊断。
微生物检测
用于检测和鉴定细菌、病毒和其他微 生物，在食品安全、环境保护和疾病 控制等领域有广泛应用。
古生物学和考古学
用于分析古代生物遗骸的DNA，研 究物种进化和人类起源。
法医学
用于鉴定个体身份、亲子关系和生物 样本的来源，在犯罪调查和法庭科学 中具有重要应用价值。
扩增。
pcr反应体系中包含模板DNA、 引物、dNTPs和耐高温的DNA聚
pcr培训课件ppt
遵循标准化操作流程，确保实验 的一致性和准确性。
数据分析
对实验数据进行统计分析，识别 并排除异常值。
质量控制标准
制定质量控制标准，对实验结果 进行评估和监测。
04
PCR技术发展与展望
PCR技术的改进与创新
1 2
优化反应体系
通过调整反应成分和条件，提高PCR的特异性和 灵敏度，降低背景噪音。
新型PCR技术的开发
PCR技术的原理
双链DNA加热变性
在高温下，双链DNA解旋为单链 DNA。
引物与单链DNA结合
根据已知序列设计特异性引物， 在低温下与单链DNA结合。
DNA聚合酶催化延伸
在适宜温度下，耐高温的DNA聚 合酶催化引物沿着单链DNA延伸
，合成互补链。
重复加热变性、退火和延伸
反复进行变性、退火和延伸，实 现DNA片段的指数级扩增。
产物检测与鉴定
电泳检测
可以使用琼脂糖凝胶电泳 或聚丙烯酰胺凝胶电泳检 测PCR产物。
荧光检测
可以使用荧光染料或探针 检测PCR产物。
测序鉴定
如果需要，可以对PCR产 物进行测序，以确定其序 列是否与预期一致。
03
PCR实验注意事项
实验安全
实验室安全须知
确保实验室内环境整洁，避免交 叉污染。
个人防护措施
THANKS
食品安全检测
利用PCR技术检测食品中的微生物、毒素和污染 物，保障食品安全。
PCR技术的研究方向
提高灵敏度和特异性
进一步优化PCR技术，提高检测的灵敏度和特异性，降低假阳性 或假阴性的可能性。
标准化和质量控制
建立PCR技术的标准化和质量控制体系，确保实验结果的可靠性和 可比性。
数据分析
对实验数据进行统计分析，识别 并排除异常值。
质量控制标准
制定质量控制标准，对实验结果 进行评估和监测。
04
PCR技术发展与展望
PCR技术的改进与创新
1 2
优化反应体系
通过调整反应成分和条件，提高PCR的特异性和 灵敏度，降低背景噪音。
新型PCR技术的开发
PCR技术的原理
双链DNA加热变性
在高温下，双链DNA解旋为单链 DNA。
引物与单链DNA结合
根据已知序列设计特异性引物， 在低温下与单链DNA结合。
DNA聚合酶催化延伸
在适宜温度下，耐高温的DNA聚 合酶催化引物沿着单链DNA延伸
，合成互补链。
重复加热变性、退火和延伸
反复进行变性、退火和延伸，实 现DNA片段的指数级扩增。
产物检测与鉴定
电泳检测
可以使用琼脂糖凝胶电泳 或聚丙烯酰胺凝胶电泳检 测PCR产物。
荧光检测
可以使用荧光染料或探针 检测PCR产物。
测序鉴定
如果需要，可以对PCR产 物进行测序，以确定其序 列是否与预期一致。
03
PCR实验注意事项
实验安全
实验室安全须知
确保实验室内环境整洁，避免交 叉污染。
个人防护措施
THANKS
食品安全检测
利用PCR技术检测食品中的微生物、毒素和污染 物，保障食品安全。
PCR技术的研究方向
提高灵敏度和特异性
进一步优化PCR技术，提高检测的灵敏度和特异性，降低假阳性 或假阴性的可能性。
标准化和质量控制
建立PCR技术的标准化和质量控制体系，确保实验结果的可靠性和 可比性。
pcr ppt课件教程
引物二聚体
总结词
引物二聚体是指引物之间形成的二聚体，影响PCR扩增效率。
详细描述
引物二聚体的形成可能由于引物设计不当、引物浓度过高、退火温度过低等原因 导致。为解决这一问题，可以优化引物设计，降低引物浓度，适当提高退火温度 等措施。
05
PCR 实验设计
选择合适的引物
引物长度
根据基因序列选择合适的引物长度， 通常为18-30bp。
设置PCR 仪温度循环
设置变性温度
将PCR仪温度设置为95℃，进 行变性处理，使DNA双链解开
成单链。
设置退火温度
根据引物特异性，设置适当的 退火温度，使引物与单链DNA 结合。
设置延伸温度
设置适当的延伸温度，使DNA 聚合酶从引物起始合成DNA链 。
设置循环数
根据实验目的和DNA片段大小 ，设置适当的循环数，确保目
PCR PPT课件教程
目录
• PCR 简介 • PCR 原理 • PCR 实验步骤 • PCR 常见问题与解决方案 • PCR 实验设计 • PCR 数据分析
01
PCR 简介
PCR 定义
• 聚合酶链式反应（PCR）：一种在生物体外复制特定DNA的分子生物学技术，通过DNA聚合酶的作用，以一对寡核苷酸引 物定向导引下完成特定DNA的片段扩增。
在PCR中，DNA的复制是通过特定的引物和聚合酶，在特定的温度和循环次数下完 成的。
引物与模板DNA结合后，聚合酶从引物的3’端开始合成新的DNA链。
聚合酶与引物
聚合酶是生物体内负责DNA复 制的酶，具有耐高温的特性。
在PCR中，常用的聚合酶有Taq 酶和Tfl酶等。
引物是人工合成的短片段DNA ，能够与目标DNA特异性结合 ，为聚合酶提供起始点。
pcr技术课件ppt简短
通量PCR检测。
pcr技术的应用范围
01
02
03
基础研究
基因克隆、基因表达、基 因组测序、单核苷酸多态 性(SNP)检测等。
医学诊断
感染性疾病、遗传性疾病 、肿瘤等疾病的诊断。
生物多样性研究
物种鉴定、种群遗传学分 析、生态学研究等。
02
CATALOGUE
pcr技术的基本步骤
样本准备
样本类型
选择合适的样本类型，如 血液、组织等，以便后续 实验操作。
根据目的基因序列，选择特异性好、扩增 效率高的引物。
确认模板DNA的质量
设置合理的反应体系
确保使用的模板DNA无降解、无污染，浓 度和纯度适中。
根据引物、模板和PCR仪的规格，设置合理 的反应体系。实验Βιβλιοθήκη 的注意事项控制好反应温度和时间
PCR反应中，每个温度点的反应时间和升温/降温速度应保持一致。
避免出现非特异性扩增
将DNA模板、引物、dNTPs、酶等 试剂加入PCR反应管中。
进行PCR扩增
将PCR反应管放入PCR仪中，按照设 定的程序进行扩增。
产物检测和分析
收集PCR扩增产物，进行电泳分析或 荧光定量PCR等检测方法，确定目标 基因序列是否被成功扩增。
实验后处理
数据分析和结论
对实验数据进行统计和分析，得出结论。
将用过的引物和模板妥善储存，以备后续实验使 用。
仪器的维护与保养
定期对PCR仪进行维护和保养，确保设备的正常 运行。
05
CATALOGUE
pcr技术的优缺点
优点
01
02
03
04
灵敏度高
PCR技术可以检测出微量的 DNA，灵敏度非常高。
pcr技术的应用范围
01
02
03
基础研究
基因克隆、基因表达、基 因组测序、单核苷酸多态 性(SNP)检测等。
医学诊断
感染性疾病、遗传性疾病 、肿瘤等疾病的诊断。
生物多样性研究
物种鉴定、种群遗传学分 析、生态学研究等。
02
CATALOGUE
pcr技术的基本步骤
样本准备
样本类型
选择合适的样本类型，如 血液、组织等，以便后续 实验操作。
根据目的基因序列，选择特异性好、扩增 效率高的引物。
确认模板DNA的质量
设置合理的反应体系
确保使用的模板DNA无降解、无污染，浓 度和纯度适中。
根据引物、模板和PCR仪的规格，设置合理 的反应体系。实验Βιβλιοθήκη 的注意事项控制好反应温度和时间
PCR反应中，每个温度点的反应时间和升温/降温速度应保持一致。
避免出现非特异性扩增
将DNA模板、引物、dNTPs、酶等 试剂加入PCR反应管中。
进行PCR扩增
将PCR反应管放入PCR仪中，按照设 定的程序进行扩增。
产物检测和分析
收集PCR扩增产物，进行电泳分析或 荧光定量PCR等检测方法，确定目标 基因序列是否被成功扩增。
实验后处理
数据分析和结论
对实验数据进行统计和分析，得出结论。
将用过的引物和模板妥善储存，以备后续实验使 用。
仪器的维护与保养
定期对PCR仪进行维护和保养，确保设备的正常 运行。
05
CATALOGUE
pcr技术的优缺点
优点
01
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03
04
灵敏度高
PCR技术可以检测出微量的 DNA，灵敏度非常高。
PCR详细讲解PPT课件
2021/3/7
CHENLI
26
引物设计的基本原则
1、引物应具有足够的特异性。
如果需要从基因组等较复杂的模板中扩 增特定的DNA序列，则需要考虑目的DNA序列 的保守性，尽量避免所选引物设计区域序列 的非特异性。
引物与非特异序列的同源性不超过70% 或有连续8个互补碱基。
NCBI Primer BLAST
29
引物设计的基本原则
3、引物长度一般为18-30个碱基之间。
引物长度与反应的特异性和解链温度成
正相关。
过短：扩增特异性下降 过长：引物自身形成二级结构，以及引物二 聚体。
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CHENLI
30
引物设计的基本原则
4、G+C含量一般为40%-60%
引物的碱基组成也会对引物的解链温度 产生影响。
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CHENLI
68
退火温度与时间取决于引物的 碱基组成、长度和浓度。退火温度 可以通过计算推断，通常采用温度 梯度PCR的方法进行摸索。
PC1-P20 退火温度摸索
45.0 45.5 46.9 49.0 51.4 53.8 56.2 58.6 60.9 63.1 64.5 65.0 M
CHENLI
8
低温退火
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CHENLI
9
中温延伸
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CHENLI
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CHENLI
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CHENLI
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• 理论：2n递增（n为循环次数）， 如果扩增30循环，目标DNA可增加 230也就是109倍。
pcr技术PPT课件
课题2
多聚酶链式反应（PCR)扩增 DNA片段
温故知新1
• 组成DNA分子的基本单位是什么? • 这些基本单位是如何连接成DNA分子的? • DNA分子结构有什么特点？
脱 氧 磷酸
脱氧
核 苷
核糖 脱氧核苷
腺嘌呤（A） 嘌呤
酸
含氮
鸟嘌呤（G）
碱基 嘧啶 胞嘧啶（C）
胸腺嘧啶（T）
5 4
3
1 2
OH HO P O
弹体
三种炸药：
普通炸药
小 型
普通炸药
爆炸
铀235 外壳
原
子 Ｕ235 裂变
弹
氘、氚、重 氢化钾等
氘、氚 聚变
引爆装置
2 1
H
3 1
H
4 2
He
01 n
氢弹爆炸形成的磨姑云
三、受控热核反应——核聚变的利用
可控热核反应将为人类提供巨大的能源,和平利用聚变产生的 核量是非常吸引人的重大课题，我国的可控核聚变装置“中国 环流器1号”已取得不少研究成果.
2、铀核的裂变
（1）发现
1939年12月，德国物理学家哈恩和他的助手 斯特拉斯曼发现，用中子轰击铀核时，铀核发 生了裂变。
（2）裂变产物 多种多样
235 92
U+
1 0
n
→15464
Ba
+
89 36
Kr
+310
n
235 92
U+
1 0
n
→15461Ba
+
92 36
Kr
+310
n
请计算铀裂变时释放的能量 已知铀核裂变的反应：
热核反应和裂变反应相比较，具有许多优越性。
多聚酶链式反应（PCR)扩增 DNA片段
温故知新1
• 组成DNA分子的基本单位是什么? • 这些基本单位是如何连接成DNA分子的? • DNA分子结构有什么特点？
脱 氧 磷酸
脱氧
核 苷
核糖 脱氧核苷
腺嘌呤（A） 嘌呤
酸
含氮
鸟嘌呤（G）
碱基 嘧啶 胞嘧啶（C）
胸腺嘧啶（T）
5 4
3
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OH HO P O
弹体
三种炸药：
普通炸药
小 型
普通炸药
爆炸
铀235 外壳
原
子 Ｕ235 裂变
弹
氘、氚、重 氢化钾等
氘、氚 聚变
引爆装置
2 1
H
3 1
H
4 2
He
01 n
氢弹爆炸形成的磨姑云
三、受控热核反应——核聚变的利用
可控热核反应将为人类提供巨大的能源,和平利用聚变产生的 核量是非常吸引人的重大课题，我国的可控核聚变装置“中国 环流器1号”已取得不少研究成果.
2、铀核的裂变
（1）发现
1939年12月，德国物理学家哈恩和他的助手 斯特拉斯曼发现，用中子轰击铀核时，铀核发 生了裂变。
（2）裂变产物 多种多样
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U+
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→15461Ba
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Kr
+310
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请计算铀裂变时释放的能量 已知铀核裂变的反应：
热核反应和裂变反应相比较，具有许多优越性。
PCR专题 ppt课件
pre-denaturation-denature completely Denaturation annealing Elongation cycles:25-30
PCR reaction components and their functions
template：ssDNA, dsDNA mRNA needed to be RT as cDNA samples：from blood,sperm or any other tissue,from older forensic specimens, from ancient biological samples or in the lab. From bacterial colonies or phage plaques. DNA：very stable
Kary Mullis(1985)
发明过程 Mullis 在“偶然想出的聚合酶链反应”一文中 写到: “这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝 DNA片段的方法是在不可想象的情况下，•即驾车 行驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来 的”。 发展过程： 开始使用大肠杆菌•DNA聚合酶Klenow片段， 该酶不耐热，每次加热变性DNA后都要重新补加。 耗时、费力、易出错。耐热DNA聚合酶的应用使 得自动化。
实时荧光定量PCR 原理 --------- 定量原理
•理想的PCR反应： • X=X0*2n •非理想的PCR反应： • X=X0 (1+Ex)n • • • • n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率
实时荧光定量PCR 原理 --------- 定量原理
PCR process
Principle of PCR
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- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
C. 延伸的温度与时间
温度取决于DNA聚合酶的最适温度，时间和待扩增片段长度有关（72℃）
D. 循环数
PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度（30-40次）
.
02 基本实验步骤
PCR产物检测
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶板的制备(1.5%)
加样电泳（电压80V、时间2hr）
紫外
EB，它能和碱基间的氢键结合，在 波长为254nm~365nm的紫外光照射下 呈橘红色（530nm）的荧光
熔解曲线 确认PCR反应的特异性。
.
Real Time qPCR
相对定量法分析结果
内参/管家基因 GAPDH、β-actin、18S rRNA、ACTB、β2M......（至少选择两个以上）
核酸表达量计算
R =2−ΔΔCt
例：
.
PCR
谢谢观看
Thanks
.
耐高温，在热变性时不会被钝化
使DNA聚合酶具有催化活性
包括Tris-HCl（维持PH值），KCl（利于引物的数设置
A. 变性的温度与时间
温度取决于DNA模板及PCR产物的G+C含量，时间取决于DNA的长度（95℃）
B. 退火的温度与时间
温度取决于引物的G+C含量及引物的长度，退火时间不是关键因素，但也应该加以控制（60℃）
形 成
DNA 2
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~35轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
.
02 基本实验步骤
核酸模板 引物
4种dNTP
Taq DNA聚合酶
Mg2+ 反应缓冲系统
DNA/RNA，线性，小片段模板，核酸样品应除去存在对DNA聚合酶有抑制作用的有机溶剂和金属 离子 PCR的特异性（3’端和5’端；18-25bp；0.1-0.5µM；Tm值；4种碱基随机分布；自身避免反向重 复序列；引物之间不存在互补序列；3’端选择保守的氨基酸序列；与非特异性序列的同源性） PCR的合成原料，四种dNTP浓度应相等
PCR
多聚酶链式反应技术
Polymerase Chain Reaction
.
01 原理
以拟扩增的DNA分子为模板， 以一对分别与模板互补的 寡核苷酸片段为引物，在 DNA聚合酶的作用下，按照 半保留复制的机理沿着模 板链延伸直至完成新的DNA 合成
.
01 原理
94
温
度 72
（℃）
55
22
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
荧光探针法
.
Real Time qPCR
基线（Baseline）
是指在PCR扩增反应的最初数个循环
里，荧光信号变化不大，接近一条直线，
这样的直线即基线。
。
光阈值（threshold）
一般将PCR反应前15个循环的荧光信
号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR
3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧
光域值设定在PCR扩增的指数期
.
03 衍生PCR技术
原位PCR
逆转录PCR
PCR技术
定量PCR
.
巢式PCR 多重PCR
逆转录 PCR
相对于基本PCR，在开始阶段增加步骤：RNA →cDNA合成，是单链到双链的过程。
引物 逆转录酶
RNA水解酶
.
Real Time qPCR
荧光嵌合法(TB Green™)
实时荧光定量PCR技术 (Real-Time Quantitative PCR) 是指在PCR反应 体系中加入荧光基团，利用荧光 信号积累实时监测整个PCR进程， 最后通过标准曲线对未知模板进 行定量分析的方法。
Ct (Cycle threshold)值
表示每个PCR反应管内荧光信号到达
设定的域值时所经历的循环数 .
Real Time qPCR
Ct值无数值（undetected） 阴性
Ct值≤30.0 阳性
Ct值>30.0 表达量极少
固定循环数后，荧光信号与模板数成正比。 初始DNA量越多, 荧光达到阈值时所需要的循环数(Ct 值)越少。 起始模板的对数浓度与Ct呈线性关系，根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的模板量。
温度取决于DNA聚合酶的最适温度，时间和待扩增片段长度有关（72℃）
D. 循环数
PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度（30-40次）
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02 基本实验步骤
PCR产物检测
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶板的制备(1.5%)
加样电泳（电压80V、时间2hr）
紫外
EB，它能和碱基间的氢键结合，在 波长为254nm~365nm的紫外光照射下 呈橘红色（530nm）的荧光
熔解曲线 确认PCR反应的特异性。
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Real Time qPCR
相对定量法分析结果
内参/管家基因 GAPDH、β-actin、18S rRNA、ACTB、β2M......（至少选择两个以上）
核酸表达量计算
R =2−ΔΔCt
例：
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PCR
谢谢观看
Thanks
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耐高温，在热变性时不会被钝化
使DNA聚合酶具有催化活性
包括Tris-HCl（维持PH值），KCl（利于引物的数设置
A. 变性的温度与时间
温度取决于DNA模板及PCR产物的G+C含量，时间取决于DNA的长度（95℃）
B. 退火的温度与时间
温度取决于引物的G+C含量及引物的长度，退火时间不是关键因素，但也应该加以控制（60℃）
形 成
DNA 2
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~35轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
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02 基本实验步骤
核酸模板 引物
4种dNTP
Taq DNA聚合酶
Mg2+ 反应缓冲系统
DNA/RNA，线性，小片段模板，核酸样品应除去存在对DNA聚合酶有抑制作用的有机溶剂和金属 离子 PCR的特异性（3’端和5’端；18-25bp；0.1-0.5µM；Tm值；4种碱基随机分布；自身避免反向重 复序列；引物之间不存在互补序列；3’端选择保守的氨基酸序列；与非特异性序列的同源性） PCR的合成原料，四种dNTP浓度应相等
PCR
多聚酶链式反应技术
Polymerase Chain Reaction
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01 原理
以拟扩增的DNA分子为模板， 以一对分别与模板互补的 寡核苷酸片段为引物，在 DNA聚合酶的作用下，按照 半保留复制的机理沿着模 板链延伸直至完成新的DNA 合成
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01 原理
94
温
度 72
（℃）
55
22
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
荧光探针法
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Real Time qPCR
基线（Baseline）
是指在PCR扩增反应的最初数个循环
里，荧光信号变化不大，接近一条直线，
这样的直线即基线。
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光阈值（threshold）
一般将PCR反应前15个循环的荧光信
号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR
3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧
光域值设定在PCR扩增的指数期
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03 衍生PCR技术
原位PCR
逆转录PCR
PCR技术
定量PCR
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巢式PCR 多重PCR
逆转录 PCR
相对于基本PCR，在开始阶段增加步骤：RNA →cDNA合成，是单链到双链的过程。
引物 逆转录酶
RNA水解酶
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Real Time qPCR
荧光嵌合法(TB Green™)
实时荧光定量PCR技术 (Real-Time Quantitative PCR) 是指在PCR反应 体系中加入荧光基团，利用荧光 信号积累实时监测整个PCR进程， 最后通过标准曲线对未知模板进 行定量分析的方法。
Ct (Cycle threshold)值
表示每个PCR反应管内荧光信号到达
设定的域值时所经历的循环数 .
Real Time qPCR
Ct值无数值（undetected） 阴性
Ct值≤30.0 阳性
Ct值>30.0 表达量极少
固定循环数后，荧光信号与模板数成正比。 初始DNA量越多, 荧光达到阈值时所需要的循环数(Ct 值)越少。 起始模板的对数浓度与Ct呈线性关系，根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的模板量。