PCR技术及其应用ppt课件
合集下载
PCR的基本原理和应用 PPT课件
PCR 的 基 本 原 理 和 应 用
聚合酶链式反应（PCR Polymerase Chain Reaction）
一种人工在体外进行快速DNA片断扩增的方法。
PCR技术基本原理
PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两 端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： 模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或 经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮 反应作准备； 模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃ 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 引物的延伸：DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反 应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多 的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循 环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期 (Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
分子克隆(clone,cloned,cloning) 在生物体外用重组技术将特定基因插入载体分子中.将DNA片段(或基因)与载体 DNA分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目 的可分为DNA和cDNA克隆两类。
Cloning vectors (克隆载体):在基因工程重组DNA技
育，形成DNA-蛋白质复合物，电泳后用放射性自显影技 术可以确定DNA条带的位置，从而确定它与蛋白质是否 结合。
A DNA bound with more than one protein to form a larger complex.
聚合酶链式反应（PCR Polymerase Chain Reaction）
一种人工在体外进行快速DNA片断扩增的方法。
PCR技术基本原理
PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两 端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： 模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或 经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮 反应作准备； 模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃ 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 引物的延伸：DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反 应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多 的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循 环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期 (Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
分子克隆(clone,cloned,cloning) 在生物体外用重组技术将特定基因插入载体分子中.将DNA片段(或基因)与载体 DNA分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目 的可分为DNA和cDNA克隆两类。
Cloning vectors (克隆载体):在基因工程重组DNA技
育，形成DNA-蛋白质复合物，电泳后用放射性自显影技 术可以确定DNA条带的位置，从而确定它与蛋白质是否 结合。
A DNA bound with more than one protein to form a larger complex.
PCR技术的基本原理及应用 ppt课件
11、增效PCR（booster PCR）
当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到
两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩
增。消耗了引物和酶，而特异扩增产量降低。
对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低
浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形
成产物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列
的扩增，只是由于引物少产量不高。约经15~20
和检测病理切片中含量ppt课较件 少的靶序列。
42
操作步骤
1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适 于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入
2. PCR扩增细胞内目的片段
3. 原位杂交检测扩增产物
A.阳性对照
ppt课件
B.阴性对照
43
C.原位检测mRNA表达
8、逆转录PCR（RT-PCR）
Prize
ppt课件
2
精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
研究生课程
第五章 PCR技术及原理（4学时）
ppt课件
1
第一节 PCR的原理
Kary Mullis
research scientist in the 1980s at a California biotechnology company called Cetus
co-winner of 1993 Nobel
PCR技术的原理与应用ppt课件
2
1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热的DNA聚合酶。此 酶耐高温，并提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了 扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而 其灵敏性也大大提高。此酶的发现使PCR技术被广泛的应用。
13
锚定PCR ： 锚定PCR（Anchored PCR, A-PCR）主要用于分析具有可
变末端的DNA序列，Loh等用锚定PCR对人外周血淋巴细胞T 细胞受体α-链的mRNA的多变性进行了分析。先合成cDNA， 并用末端脱氧核苷酸转移酶在其3’-可变区末端加上一个 PolyG尾巴。Loh等在恒定区与可变区连接部位设一个引物， 另一个引物是一个具5’-polyG尾巴的引物。带有PolyG尾巴的 引物是一个固定点，它可以并与PolyG尾巴结合，无论其余部 分序列如何，只识别片段末端，利用此法可从前述mRNA中检 出至少20种不同序列，每一种都是独特的，表明锚定PCR不对 任何特殊序列有倾向性结果，可用于T细胞、肿瘤及其它部位 抗体基因的研究。
8
Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著 的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为 200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物 减少。
9
2.PCR技术的主要类型及其应用
14
锚定PCR原理示意图
15
标记PCR和彩色PCR：
标记PCR(Labelled Primers，LP-PCR)，LP-PCR是利 用同位素或荧光素对PCR引物的5‘端进行标记，用来检测 靶基因是否存在。彩色PCR(Color Complementation assay PCR，CCAPCR)，是LP-PCR的一种。它用不同颜色的荧 光染料标记引物的5’端，因而扩增后的靶基因序列分别带 有引物5‘的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可根据不 同荧光的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况，此法可 用来检测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微 生物的型别鉴定等。
1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热的DNA聚合酶。此 酶耐高温，并提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了 扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而 其灵敏性也大大提高。此酶的发现使PCR技术被广泛的应用。
13
锚定PCR ： 锚定PCR（Anchored PCR, A-PCR）主要用于分析具有可
变末端的DNA序列，Loh等用锚定PCR对人外周血淋巴细胞T 细胞受体α-链的mRNA的多变性进行了分析。先合成cDNA， 并用末端脱氧核苷酸转移酶在其3’-可变区末端加上一个 PolyG尾巴。Loh等在恒定区与可变区连接部位设一个引物， 另一个引物是一个具5’-polyG尾巴的引物。带有PolyG尾巴的 引物是一个固定点，它可以并与PolyG尾巴结合，无论其余部 分序列如何，只识别片段末端，利用此法可从前述mRNA中检 出至少20种不同序列，每一种都是独特的，表明锚定PCR不对 任何特殊序列有倾向性结果，可用于T细胞、肿瘤及其它部位 抗体基因的研究。
8
Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著 的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为 200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物 减少。
9
2.PCR技术的主要类型及其应用
14
锚定PCR原理示意图
15
标记PCR和彩色PCR：
标记PCR(Labelled Primers，LP-PCR)，LP-PCR是利 用同位素或荧光素对PCR引物的5‘端进行标记，用来检测 靶基因是否存在。彩色PCR(Color Complementation assay PCR，CCAPCR)，是LP-PCR的一种。它用不同颜色的荧 光染料标记引物的5’端，因而扩增后的靶基因序列分别带 有引物5‘的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可根据不 同荧光的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况，此法可 用来检测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微 生物的型别鉴定等。
生物检测技术-PCR技术PPT
引物
根据需要扩增的序列长度和特异性要 求，确定引物的浓度和种类。
PCR扩增及产物分析
扩增
在PCR仪中进行扩增反应，设置适当的温度和循环次数，使DNA片 段得以扩增。
电泳分析
将扩增产物进行电泳分离，通过染色或荧光标记等技术对产物进行 分析和检测。
结果判断
根据电泳结果判断PCR扩增是否成功，并对产物进行定性或定量分析。
3
引物合成
将设计好的引物交由专业的引物合成公司进行合 成，得到可用于PCR反应的引物。
反应体系的组成
DNA聚合酶
选择高活性、高保真度的DNA聚合 酶，确保PCR扩增的准确性和特异性。
dNTPs
提供PCR所需的四种脱氧核苷酸，即 dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
缓冲液
提供适宜的酸碱度和离子浓度，维持 DNA聚合酶的活性。
基因突变和突变的检测
基因突变检测
PCR技术可以用于检测基因突变，通过设计特定的引物，可以扩增特定的DNA片段，通过比较正常和异常序列的 扩增产物，可以检测出基因突变的位置和类型。
突变筛选
利用PCR技术可以对大量样本进行突变筛选，通过设计针对特定突变的引物，可以对大量样本进行高通量的突变 检测，有助于疾病的早期发现和治疗。
快速高效
PCR技术能够在短时间内完成DNA的大规模扩增，大大提高了检测效 率。
操作简便
PCR技术流程相对简单，易于操作，使得它在实验室中得到了广泛应 用。
缺点
成本较高
PCR技术所需的仪器、试剂等成本较高， 对于一些经费有限的实验室来说可能是
一个负担。
对样品质量要求高
PCR技术的灵敏度使得其对样品质量 要求较高，样品中微小的杂质或污染
PCR技术及其应用PPT精品课程课件讲义
40 50 60 70 80 90 100
(%)
温度(℃)
Saiki将耐热DNA聚合酶引入PCR，使利用热变性解链DNA模板可行。
此酶具有以下特点： ①耐高温；
②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶，
便于自动化； ③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度
(2.0Kb)。
酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的 发现使PCR得以广泛应用。
Semi-conservative replication
Old new
DNA的复制 以DNA的两条链为模板，以4×dNTP为原料，按照碱基互补配对的原则， 合成子代DNA的过程。
5’ 3’
解旋酶类
dNTP
DNA聚合酶 引物
体内DNA的复制
体系组成
模板DNA、DDDP、dNTP、SSB
引物酶、连接酶、拓扑异构酶、解链酶
子链延长
3’
5’
PCR技术简史
DNA 解旋解链
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
TAGCGCTATCGCATCGACGCT
3’
GGAUCG DNA
3’
DNA
聚合酶 5‘
合成引物
5‘ AUCGCG 聚合酶 ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG
1989 年，Science 将PCR中的Taq DNA多聚酶命名为当年
的风云分子 (Molecule of the year)
94℃
55℃
72℃
PCR循环
“I do my best thinking while driving”
(%)
温度(℃)
Saiki将耐热DNA聚合酶引入PCR，使利用热变性解链DNA模板可行。
此酶具有以下特点： ①耐高温；
②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶，
便于自动化； ③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度
(2.0Kb)。
酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的 发现使PCR得以广泛应用。
Semi-conservative replication
Old new
DNA的复制 以DNA的两条链为模板，以4×dNTP为原料，按照碱基互补配对的原则， 合成子代DNA的过程。
5’ 3’
解旋酶类
dNTP
DNA聚合酶 引物
体内DNA的复制
体系组成
模板DNA、DDDP、dNTP、SSB
引物酶、连接酶、拓扑异构酶、解链酶
子链延长
3’
5’
PCR技术简史
DNA 解旋解链
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
TAGCGCTATCGCATCGACGCT
3’
GGAUCG DNA
3’
DNA
聚合酶 5‘
合成引物
5‘ AUCGCG 聚合酶 ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG
1989 年，Science 将PCR中的Taq DNA多聚酶命名为当年
的风云分子 (Molecule of the year)
94℃
55℃
72℃
PCR循环
“I do my best thinking while driving”
PCR技术及其延伸与应用PPT课件
HCl(pH8.4,20℃)150mmol/L MgCl2,1mg/ml明胶。
• dNTP贮备液 • DNA模板
最新课件
11
操作程序
• 试剂混合 • PCR仪程序设计：94℃变性30s，55℃退火20s，然后
在72℃延伸30s，共循环30-35次。最后一次循环结束后， 再将反应管置72℃温育5min，以确保充分延伸。
• Kary Mullis因发明了“聚合酶链式反应” 而获得1993年度诺贝尔化学奖。(一名加拿大籍英
国科学家Michael Smith因开创了“寡核苷酸基因定点诱变”的方法 而与Mullis同享此荣)
最新课件
4
PCR技术检测细菌
• 鸭疫里默氏杆菌 • 霍乱弧菌 • 食源性病原细菌 • 结核杆菌
最新课件
5
PCR与病毒类疾病应用
• 杂交法检测植物病毒和类病毒 • 利用RT-PCR对黄瓜病毒源种类进行检测 • 诊断人类乳头状病毒HPV感染
最新课件
6
诊断遗传疾病
最新课件
7
PCR的特点
• 特异性高-聚合酶 • 首次报导用大肠杆菌的DNAPolymerase I的
Klenow大片段。90℃会变性失活，需每次 PCR循环都要重新加入；同时引物是在37℃ 延伸
鼠酶－莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus)
最新课件
25
Touch down PCR
• 一般PCR的体系 • 一般PCR的设计原理 • 不同的PCR过程 • 目的：在不知道理想退火温度的条件下保
证扩出产物
最新课件
26
梯度PCR
• 在特殊PCR仪上进行的一般PCR • 目的：寻找最佳的退火温度 • 与TouchDown PCR的区别
• dNTP贮备液 • DNA模板
最新课件
11
操作程序
• 试剂混合 • PCR仪程序设计：94℃变性30s，55℃退火20s，然后
在72℃延伸30s，共循环30-35次。最后一次循环结束后， 再将反应管置72℃温育5min，以确保充分延伸。
• Kary Mullis因发明了“聚合酶链式反应” 而获得1993年度诺贝尔化学奖。(一名加拿大籍英
国科学家Michael Smith因开创了“寡核苷酸基因定点诱变”的方法 而与Mullis同享此荣)
最新课件
4
PCR技术检测细菌
• 鸭疫里默氏杆菌 • 霍乱弧菌 • 食源性病原细菌 • 结核杆菌
最新课件
5
PCR与病毒类疾病应用
• 杂交法检测植物病毒和类病毒 • 利用RT-PCR对黄瓜病毒源种类进行检测 • 诊断人类乳头状病毒HPV感染
最新课件
6
诊断遗传疾病
最新课件
7
PCR的特点
• 特异性高-聚合酶 • 首次报导用大肠杆菌的DNAPolymerase I的
Klenow大片段。90℃会变性失活，需每次 PCR循环都要重新加入；同时引物是在37℃ 延伸
鼠酶－莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus)
最新课件
25
Touch down PCR
• 一般PCR的体系 • 一般PCR的设计原理 • 不同的PCR过程 • 目的：在不知道理想退火温度的条件下保
证扩出产物
最新课件
26
梯度PCR
• 在特殊PCR仪上进行的一般PCR • 目的：寻找最佳的退火温度 • 与TouchDown PCR的区别
PCR技术及其应用ppt课件
体内DNA的复制体系
5’ 3’
拓扑异构酶 解旋酶类 SSB
DNA聚合酶（I II III）
引物 dNTP Mg2+
Mullis的PCR构思
引物 DNA聚合酶 DNA聚合酶 引物
特定DNA片段
耐热DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
(%)
100
酶 80 活 60 性 40
（2）引物长度以15-40 bp为宜。
（3）碱基尽可能随机分布,G+C占40-60%。
（4）引物内部避免形成二级结构。
（5）两引物间避免有互补序列。
（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。
可编辑课件PPT
15
（3）延伸 70-75℃,一般为72℃ 延伸时间由扩增片段长度决定
（4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加
PCR的应用
1、特定DNA片段（基因、调控序列）的鉴定、分离 或制备。
A、DNA
B、cDNA
2、基因表达分析（原位、离体）
A、基因是否表达
B、基因表达水平高低
3、基因突变
基因克隆（ＲＴ－ＰＣＲ）
逆转录酶
mRNA 杂交双链
ＤＮＡ聚合酶
cDNA
PCR扩增
可编辑课件PPT
18
原位ＰＣＲ分析基因表达的组织特异性
浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反 应产量
dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA 聚合酶的活性。
（5） Mg2+
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。浓度为0.5-2.5mmol/L。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等 的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
PCR-技术及应用PPT课件
dNTP的质量与浓度：dNTP的质量与浓度和PCR 扩增效率有密切关系，一般将其PH调节到7.0～7.5， 小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP 降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L， 尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)， 如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏 低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物 的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓 度降低。
PCR反应的特点
②灵敏度高：过去酶联免疫吸附试验（ELISA）和放射 免疫分析（RIA）其灵敏度分别为ng和pg级，而PCR检 测灵敏度可达fg级，理论上可检出一个细菌或一个真 核细胞的单拷贝基因的存在；
PCR反应的特点
③简便快速：操作试剂盒时只需将样品简单处理和加 样后即可进行扩增，许多PCR检查项目在两小时左右即 可出报告；④对样品要求低：几乎所有的临床标本都 可用于PCR扩增。
PCR条件的选择
引物：PCR反应成功扩增的一个关键条件在于正确设计寡核苷酸引物，所 选择的引物序列决定了PCR产物的大小、位置、扩增区域的Tm值等。
引物设计的长度一般为15-30个碱基，引物长点，反应的特异性相对好， 引物太长，扩增退火时被引发的模板数相对越少，影响反应效率。引 物短点，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板 的速率越大，引物太短，则反应的特异性受到影响。
PCR技术的用途
科研使用 临床医学 法医学 农业 考古学 人类学 环境保护
个体识别与亲子鉴定 GMO
PCR应用类型
一、不对称PCR(asymmetric PCR)
不 对 称 PCR 的 目 的 是 扩 增 产 生 特 异 长 度 的 单 链 DNA。PCR反应中采用二种不同浓度的引物，PCR结 果产生大量单链DNA。因PCR反应中使用的二种引物 浓度不同一步法，因此称不对称PCR，此法产生的单 链DNA可用作杂交探针或DNA测序的模板。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2）循环参数
(1)变性 (2) 使双链DNA解链为单链
94℃， 30-60秒 (2) 退火
温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降 低温度可增加反应的灵敏性。
引物设计：
Tm =（G+C）x 4 + （A+T）x 2
（1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源
序列。
（2）引物浓度 0.1-0.5 mol/L
浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。
（3）Taq DNA聚合酶 0.5-2.5 U/50 l
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。
（4）dNTP（10mM or 2.5mM ）
含四种核苷酸dATP、dGTP、dCTP、dTTP
dNTP浓度取决于扩增片段的长度
1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理 后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入
2. PCR扩增细胞内目的片段
3. 原位杂交检测扩增产物
A.阳性对照
精品ppt
B.阴性对照
19
C.原位检测mRNA表达
荧光定量 PCR（real-time PCR)分析基因表达 水平
通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对 PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合 相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初 始模板量。
25
二、实验材料、仪器和试剂
1、材料：含0.3Kb插入片段的克PCR管
琼脂糖凝胶电泳设备
3、试剂：10XPCR 反应缓冲液
25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP
10μmol/L 引物1和引物2
精品ppt
26
三、操作步骤
1.反应体系（50µl体系）：
生物化学实验技术
目录
PCR的反应原理 PCR的类型和应用 PCR示例
多聚酶链式反应
（PCR：Polymerase Chain Reaction)
PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种 体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA 快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝 尔化学奖。
Kary B. Mullis
PCR的应用
1、特定DNA片段（基因、调控序列）的鉴定、分离 或制备。
A、DNA
B、cDNA
2、基因表达分析（原位、离体）
A、基因是否表达
B、基因表达水平高低
3、基因突变
基因克隆（ＲＴ－ＰＣＲ）
逆转录酶
mRNA 杂交双链
ＤＮＡ聚合酶
cDNA
PCR扩增
精品ppt
18
原位ＰＣＲ分析基因表达的组织特异性
浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低 反应产量
dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA 聚合酶的活性。
（5） Mg2+
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。浓度为0.5-2.5mmol/L。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等 的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
SG
精品ppt
21
反向PCR (reverse PCR) 扩增已知序列两侧的未知序 列
用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段， 对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。
未知序列
已知序列
未知序列
限制酶 未知序列
已知序列
限制酶 未知序列
连接酶
梯度PCR仪
实时荧光定量PCR仪
普通PCR仪
精品ppt
模板：DNA
引物：P1 +P2
DNA聚合酶：TaqE
原料：dNTP
反应缓冲液10xBuffer 辅助因子：Mg2+
Taq
Mg2+
P1
dATP dCTP
P2 dTTP dGTP
PCR反应条件
1）PCR反应成分
（1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA
结合蛋白类。 DNA模板一般100ng /100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
内掺式染料 SYBR Green I 序列特异性探针
Taqman
Molecular Beacons
Dual Probes(FRET) 引物特异性探针
Amplifluor (Intergen)
精品ppt
20
SYBR-Green I
Excitation
SG
5’ 3’
SG SG SG
Emission
3’ 5’
40
20
40 50 60 70 80 90 100
温度(℃)
Saiki（1988）将耐热DNA聚合酶引入PCR，使利用热变性解链DNA模板可行。
PCR反应循环
94℃
变性
55℃
退火
PCR循环
72℃
延伸
引物
5’
3’
3’
5’
变性、退火
延伸
变性、退火
延伸
变性、退火
延伸
PCR的指数扩增（2n）
PCR反应体系
10 X P1
2.5 μL 2.5 μL
25 μL
10 X P2 10X T
2.5 μL 2.5 μL
10 X E 水
2.5 μL 12.5 μL
精品ppt
28
3.PCR扩增程序：
94℃
5-10min（预变性）
94 ℃ 55 ℃ 72℃ 72℃ 4℃
30S 30S 30Cycles 30S 5-10min（后延伸） 保温
体内DNA的复制体系
5’ 3’
拓扑异构酶 解旋酶类 SSB
DNA聚合酶（I II III）
引物 dNTP Mg2+
Mullis的PCR构思
引物 DNA聚合酶 DNA聚合酶 引物
特定DNA片段
耐热DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
(%)
100
酶 80 活 性 60
（2）引物长度以15-40 bp为宜。
（3）碱基尽可能随机分布,G+C占40-60%。
（4）引物内部避免形成二级结构。
（5）两引物间避免有互补序列。
（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。
精品ppt
15
（3）延伸 70-75℃,一般为72℃ 延伸时间由扩增片段长度决定
（4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加
10 X PCR反应缓冲液
25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10μmol/L 引物1 10μmol/L引物2 模板DNA TaqE 补充水
10 X B
10 X P1 P2 10 X T 10 X E
精品ppt
27
三、操作步骤
2.按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试
剂
并混匀： 10 X Buffer