PCR技术的原理及应用ppt
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PCR技术的基本原理及应用 ppt课件
11、增效PCR（booster PCR）
当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到
两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩
增。消耗了引物和酶，而特异扩增产量降低。
对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低
浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形
成产物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列
的扩增，只是由于引物少产量不高。约经15~20
和检测病理切片中含量ppt课较件 少的靶序列。
42
操作步骤
1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适 于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入
2. PCR扩增细胞内目的片段
3. 原位杂交检测扩增产物
A.阳性对照
ppt课件
B.阴性对照
43
C.原位检测mRNA表达
8、逆转录PCR（RT-PCR）
Prize
ppt课件
2
精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
研究生课程
第五章 PCR技术及原理（4学时）
ppt课件
1
第一节 PCR的原理
Kary Mullis
research scientist in the 1980s at a California biotechnology company called Cetus
co-winner of 1993 Nobel
pcr培训ppt课件
实验操作人员应接受专业培训，熟悉安全操作规程，避免在实验过程 中受伤或感染。
07
总结与展望
Pcr技术的总结
PCR技术的原理
PCR是一种在生物实验室中广泛应用的分子生物学技术，其基本原理是通过特定的DNA 聚合酶，在DNA双链之间进行热循环，从而实现DNA的快速扩增。
PCR技术的应用领域
PCR技术在许多领域都有广泛的应用，包括遗传学、医学、生物技术和农业等。通过PCR 技术，科学家们可以快速、准确地检测和鉴定DNA序列，这对于遗传疾病的诊断、生物 多样性的研究和基因工程等领域具有重要意义。
安全问题
生物安全
PCR实验涉及的生物材料可能具有传染性，因此需要采取适当的生物 安全措施，如穿戴个人防护装备、实验室内消毒等。
废物处理
实验产生的废物应按照相关规定进行妥善处理，避免对环境和人类健 康造成危害。
防止污染
PCR实验过程中应采取措施防止污染，如设置阴性对照、定期检测实 验室环境等。
人员安全
PCR技术的优缺点
PCR技术具有高灵敏度、高特异性和操作简便等优点，但也存在一些局限性，如对模板 DNA的纯度要求高、易受污染等。因此，在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的 PCR方法。
Pcr技术的发展趋势
要点一
提高灵敏度和特异性
随着基因组学和分子生物学研究的深 入，对PCR技术的灵敏度和特异性提 出了更高的要求。因此，未来的PCR 技术需要进一步提高其灵敏度和特异 性，以满足更广泛的研究和应用需求 。
05
Pcr技术的拓展应用
基因克隆与表达
基因克隆
通过PCR技术，科学家可以快速、准 确地获取特定基因片段，为基因克隆 提供基础。
基因表达
利用PCR技术，可以检测基因在不同 条件下的表达水平，有助于理解基因 功能和调控机制。
07
总结与展望
Pcr技术的总结
PCR技术的原理
PCR是一种在生物实验室中广泛应用的分子生物学技术，其基本原理是通过特定的DNA 聚合酶，在DNA双链之间进行热循环，从而实现DNA的快速扩增。
PCR技术的应用领域
PCR技术在许多领域都有广泛的应用，包括遗传学、医学、生物技术和农业等。通过PCR 技术，科学家们可以快速、准确地检测和鉴定DNA序列，这对于遗传疾病的诊断、生物 多样性的研究和基因工程等领域具有重要意义。
安全问题
生物安全
PCR实验涉及的生物材料可能具有传染性，因此需要采取适当的生物 安全措施，如穿戴个人防护装备、实验室内消毒等。
废物处理
实验产生的废物应按照相关规定进行妥善处理，避免对环境和人类健 康造成危害。
防止污染
PCR实验过程中应采取措施防止污染，如设置阴性对照、定期检测实 验室环境等。
人员安全
PCR技术的优缺点
PCR技术具有高灵敏度、高特异性和操作简便等优点，但也存在一些局限性，如对模板 DNA的纯度要求高、易受污染等。因此，在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的 PCR方法。
Pcr技术的发展趋势
要点一
提高灵敏度和特异性
随着基因组学和分子生物学研究的深 入，对PCR技术的灵敏度和特异性提 出了更高的要求。因此，未来的PCR 技术需要进一步提高其灵敏度和特异 性，以满足更广泛的研究和应用需求 。
05
Pcr技术的拓展应用
基因克隆与表达
基因克隆
通过PCR技术，科学家可以快速、准 确地获取特定基因片段，为基因克隆 提供基础。
基因表达
利用PCR技术，可以检测基因在不同 条件下的表达水平，有助于理解基因 功能和调控机制。
PCR技术的原理与应用ppt课件
2
1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热的DNA聚合酶。此 酶耐高温，并提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了 扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而 其灵敏性也大大提高。此酶的发现使PCR技术被广泛的应用。
13
锚定PCR ： 锚定PCR（Anchored PCR, A-PCR）主要用于分析具有可
变末端的DNA序列，Loh等用锚定PCR对人外周血淋巴细胞T 细胞受体α-链的mRNA的多变性进行了分析。先合成cDNA， 并用末端脱氧核苷酸转移酶在其3’-可变区末端加上一个 PolyG尾巴。Loh等在恒定区与可变区连接部位设一个引物， 另一个引物是一个具5’-polyG尾巴的引物。带有PolyG尾巴的 引物是一个固定点，它可以并与PolyG尾巴结合，无论其余部 分序列如何，只识别片段末端，利用此法可从前述mRNA中检 出至少20种不同序列，每一种都是独特的，表明锚定PCR不对 任何特殊序列有倾向性结果，可用于T细胞、肿瘤及其它部位 抗体基因的研究。
8
Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著 的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为 200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物 减少。
9
2.PCR技术的主要类型及其应用
14
锚定PCR原理示意图
15
标记PCR和彩色PCR：
标记PCR(Labelled Primers，LP-PCR)，LP-PCR是利 用同位素或荧光素对PCR引物的5‘端进行标记，用来检测 靶基因是否存在。彩色PCR(Color Complementation assay PCR，CCAPCR)，是LP-PCR的一种。它用不同颜色的荧 光染料标记引物的5’端，因而扩增后的靶基因序列分别带 有引物5‘的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可根据不 同荧光的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况，此法可 用来检测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微 生物的型别鉴定等。
1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热的DNA聚合酶。此 酶耐高温，并提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了 扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而 其灵敏性也大大提高。此酶的发现使PCR技术被广泛的应用。
13
锚定PCR ： 锚定PCR（Anchored PCR, A-PCR）主要用于分析具有可
变末端的DNA序列，Loh等用锚定PCR对人外周血淋巴细胞T 细胞受体α-链的mRNA的多变性进行了分析。先合成cDNA， 并用末端脱氧核苷酸转移酶在其3’-可变区末端加上一个 PolyG尾巴。Loh等在恒定区与可变区连接部位设一个引物， 另一个引物是一个具5’-polyG尾巴的引物。带有PolyG尾巴的 引物是一个固定点，它可以并与PolyG尾巴结合，无论其余部 分序列如何，只识别片段末端，利用此法可从前述mRNA中检 出至少20种不同序列，每一种都是独特的，表明锚定PCR不对 任何特殊序列有倾向性结果，可用于T细胞、肿瘤及其它部位 抗体基因的研究。
8
Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著 的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为 200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物 减少。
9
2.PCR技术的主要类型及其应用
14
锚定PCR原理示意图
15
标记PCR和彩色PCR：
标记PCR(Labelled Primers，LP-PCR)，LP-PCR是利 用同位素或荧光素对PCR引物的5‘端进行标记，用来检测 靶基因是否存在。彩色PCR(Color Complementation assay PCR，CCAPCR)，是LP-PCR的一种。它用不同颜色的荧 光染料标记引物的5’端，因而扩增后的靶基因序列分别带 有引物5‘的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可根据不 同荧光的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况，此法可 用来检测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微 生物的型别鉴定等。
pcr技术PPT课件
课题2
多聚酶链式反应（PCR)扩增 DNA片段
温故知新1
• 组成DNA分子的基本单位是什么? • 这些基本单位是如何连接成DNA分子的? • DNA分子结构有什么特点？
脱 氧 磷酸
脱氧
核 苷
核糖 脱氧核苷
腺嘌呤（A） 嘌呤
酸
含氮
鸟嘌呤（G）
碱基 嘧啶 胞嘧啶（C）
胸腺嘧啶（T）
5 4
3
1 2
OH HO P O
弹体
三种炸药：
普通炸药
小 型
普通炸药
爆炸
铀235 外壳
原
子 Ｕ235 裂变
弹
氘、氚、重 氢化钾等
氘、氚 聚变
引爆装置
2 1
H
3 1
H
4 2
He
01 n
氢弹爆炸形成的磨姑云
三、受控热核反应——核聚变的利用
可控热核反应将为人类提供巨大的能源,和平利用聚变产生的 核量是非常吸引人的重大课题，我国的可控核聚变装置“中国 环流器1号”已取得不少研究成果.
2、铀核的裂变
（1）发现
1939年12月，德国物理学家哈恩和他的助手 斯特拉斯曼发现，用中子轰击铀核时，铀核发 生了裂变。
（2）裂变产物 多种多样
235 92
U+
1 0
n
→15464
Ba
+
89 36
Kr
+310
n
235 92
U+
1 0
n
→15461Ba
+
92 36
Kr
+310
n
请计算铀裂变时释放的能量 已知铀核裂变的反应：
热核反应和裂变反应相比较，具有许多优越性。
多聚酶链式反应（PCR)扩增 DNA片段
温故知新1
• 组成DNA分子的基本单位是什么? • 这些基本单位是如何连接成DNA分子的? • DNA分子结构有什么特点？
脱 氧 磷酸
脱氧
核 苷
核糖 脱氧核苷
腺嘌呤（A） 嘌呤
酸
含氮
鸟嘌呤（G）
碱基 嘧啶 胞嘧啶（C）
胸腺嘧啶（T）
5 4
3
1 2
OH HO P O
弹体
三种炸药：
普通炸药
小 型
普通炸药
爆炸
铀235 外壳
原
子 Ｕ235 裂变
弹
氘、氚、重 氢化钾等
氘、氚 聚变
引爆装置
2 1
H
3 1
H
4 2
He
01 n
氢弹爆炸形成的磨姑云
三、受控热核反应——核聚变的利用
可控热核反应将为人类提供巨大的能源,和平利用聚变产生的 核量是非常吸引人的重大课题，我国的可控核聚变装置“中国 环流器1号”已取得不少研究成果.
2、铀核的裂变
（1）发现
1939年12月，德国物理学家哈恩和他的助手 斯特拉斯曼发现，用中子轰击铀核时，铀核发 生了裂变。
（2）裂变产物 多种多样
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U+
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请计算铀裂变时释放的能量 已知铀核裂变的反应：
热核反应和裂变反应相比较，具有许多优越性。
定量PCR基本原理及方法-PPT精品文档
原理：根据扩增产物的量计数反应物中原始分子数，即： lnx=lnY-n×ln(1+Ev)=lnY - b (b为常数) 2. 实时检测法定量原理 前提：在最佳实验、相同Ev以、扩增产物量相同 原理：反应物中原始分子数（X）与其所需要的扩增循环次数（n）
成反比，由此计算出标本中靶分子的准确含量，即：
LgX=LgY–n×Lg(1+Ev)=b - n×a (a、b为常数)
Ampliflour Probe，LUX
定量分析
基因型分析
利用扩增信号的种类来分型 —— Taqman
根据熔解曲线的不同来分型 —— FRET, Molecular Beacon LC Green
利用扩增信号的种类来分型 双Taqman探针法检测野生型和突变型
在基因型分析中，可采用两种不同的Taqman探针（分别针对野生型和突变型)，即一个突 变型探针以一种荧光素（Flr）标记，而野生型探针则用不同的荧光物（Tet）标记。如果只有 一种信号被扩增出来，则样本为对应的基因型（野生型或突变型）的纯合子；如二者都被有效 地扩增出来，则样本为杂合型。
后来用与双链DNA有更强结合力的SYBR Green I取代EB
荧光定量PCR的定量原理
PCR的理论方程： Y=x×(1+ Ev)n Real-time Chemistries
Y：扩增物数量； X ：起始模板数量；Ev：扩增效率；n：扩增循环数
1. 终点法定量原理
前提：在最佳实验、循环次数n一定、Ev相同
定量PCR基本原理及方法
基因有限公司 黄妤
内 容
一． 荧光定量PCR基本原理 二． 荧光定量PCR标记方法 三． 荧光定量PCR不同方法学的应用
一．荧光定量PCR基本原理
成反比，由此计算出标本中靶分子的准确含量，即：
LgX=LgY–n×Lg(1+Ev)=b - n×a (a、b为常数)
Ampliflour Probe，LUX
定量分析
基因型分析
利用扩增信号的种类来分型 —— Taqman
根据熔解曲线的不同来分型 —— FRET, Molecular Beacon LC Green
利用扩增信号的种类来分型 双Taqman探针法检测野生型和突变型
在基因型分析中，可采用两种不同的Taqman探针（分别针对野生型和突变型)，即一个突 变型探针以一种荧光素（Flr）标记，而野生型探针则用不同的荧光物（Tet）标记。如果只有 一种信号被扩增出来，则样本为对应的基因型（野生型或突变型）的纯合子；如二者都被有效 地扩增出来，则样本为杂合型。
后来用与双链DNA有更强结合力的SYBR Green I取代EB
荧光定量PCR的定量原理
PCR的理论方程： Y=x×(1+ Ev)n Real-time Chemistries
Y：扩增物数量； X ：起始模板数量；Ev：扩增效率；n：扩增循环数
1. 终点法定量原理
前提：在最佳实验、循环次数n一定、Ev相同
定量PCR基本原理及方法
基因有限公司 黄妤
内 容
一． 荧光定量PCR基本原理 二． 荧光定量PCR标记方法 三． 荧光定量PCR不同方法学的应用
一．荧光定量PCR基本原理
PCR的原理与应用课件
加上EcoRI接头，磷酸化，cDNA分级
cDNA合成完毕，准备连接
第一链合成
cDNA合成过程示意图
.
*
cDNA序列的克隆
.
*
（二）PCR的种类 2.Nested PCR: 巢式PCR 原理: 利用两套PCR引物（巢式引物）对进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。 优点: 由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性；增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5'RACE）的特异性。 应用: 一般应用于动物方面。如: 病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等。
•高灵敏度
•适用于在单个样品中检测几个mRNA
•适用于大量样品分析
一步法和两步法RT-PCR的比较
.
*
EcoRI
寡聚(dT)随机6碱基引物R
寡聚(dT)
随机6碱基引物R
mRNA
(A)n (T)
(A)n
(A)n (T)
R
R
R
R
R
R
第二链合成
(A)n (T)
(A)n
R
R
R
R
R
R
(A)n (T)
EcoRI
很少有在公司工作的科研人员得 诺贝尔奖, Mullis是其中之一
.
*
Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链, 自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶, 面对面地合成着DNA, ……
.
*
cDNA合成完毕，准备连接
第一链合成
cDNA合成过程示意图
.
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cDNA序列的克隆
.
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（二）PCR的种类 2.Nested PCR: 巢式PCR 原理: 利用两套PCR引物（巢式引物）对进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。 优点: 由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性；增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5'RACE）的特异性。 应用: 一般应用于动物方面。如: 病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等。
•高灵敏度
•适用于在单个样品中检测几个mRNA
•适用于大量样品分析
一步法和两步法RT-PCR的比较
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EcoRI
寡聚(dT)随机6碱基引物R
寡聚(dT)
随机6碱基引物R
mRNA
(A)n (T)
(A)n
(A)n (T)
R
R
R
R
R
R
第二链合成
(A)n (T)
(A)n
R
R
R
R
R
R
(A)n (T)
EcoRI
很少有在公司工作的科研人员得 诺贝尔奖, Mullis是其中之一
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Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链, 自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶, 面对面地合成着DNA, ……
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PCR检测技术ppt课件
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变性
延伸
退火
上述3步为一个循环，每经过一个循环，样本 中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为 新一轮循环的模板，经过25~40个循环后DNA可
.
三、PCR的基本操作 PCR技术路线/流程
反应体系的配制
标本的制备
反应条件的选择与优化
扩增产物的分析
.
PCR实验室
505 试剂配制室； 506 标本处理室； 507 扩增室； 508 扩增产物分析室。
AT
GC AT
亲代DNA
AT
CG
TA
TA
AT
AT
GC
GC
AT AT
子代DNA
AT AT
CG
CG
TA
TA
TA
TA
.
半保留复制
.
2、三个基本的步骤循环
①变性 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成
两条单链。 ② 退火
突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原 则互补结合，也存在两条模板链之间的结合， 但由于引物的高浓度，结构简单的特点，主要 的结合发生在模板与引物之间。 ③ 延伸
开离心管时动作要轻，以防管内液体 溅出。
感谢亲观看此幻灯片，此课件部分内容来源于网络， 如有侵权请及时联系我们删除，谢谢配合！
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1、在本区的实验操作，必须戴手套并经常更换。 2、为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。 3、对具有潜在传染危险性的材料，必须有明确的样本处理和灭活程序。 4、样本处理对核酸扩增有很大影响，必须使用有效的核酸提取方法。
.
核酸提取方法
PCR技术原理与操作PPT
PCR步骤
PCR技术进行时的实验步骤及关键点。
1 准备反应体系
准确配制反应体系，对反应结果有决定性的 影响。
2 初始变性
94℃高温变性DNA，断与模板DNA结合，为复制DNA段提供模板。
中温度下，聚合酶按照引物模板，从5' 到 3' 延长新DNA链。
PCR反应体系与条件
PCR反应体系和条件对PCR反应质量的影响及优化方法。
反应体系
PCR反应液的主要成分是DNA模 板、引物、酶和缓冲剂等。
反应条件
包括温度、时间、酶的用量，不 同反应条件对反应结果有着明显 的影响。
优化方法
PCR后期的处理包括电泳分析、 测序等，也是PCR发现和应用的 重要方面。
PCR应用领域
PCR技术最新的应用案例及特点和优势。
1
鉴定GMO
利用PCR技术提供检测和确定转基因技术应用在食品中的程度和情况。
2
疫情监测
PCR技术在病原体检测、疫情监测等方面有广泛应用。
3
医学诊断
PCR技术已成为临床医学检测中最敏感的检测技术之一，成为诸多疾病的确诊手段。
PCR技术发展和创新
PCR技术的发展历程及当今应用的新技术和新方法。
蓝光PCR技术
利用DNA和RNA在紫外光和 蓝光照射下的发光原理进行 检测。
实时荧光定量PCR技术
将定量PCR与荧光检测技术 相结合，能够准确快速地检 测样本中的目标序列。
数字PCR技术
将PCR反应分隔为大量微小 空间进行，可有效减少标准 曲线算法的误差和PCR非特 异性增长的影响。
PCR技术的优缺点和局限性
无处不在
在病毒、遗传疾病的诊断和育种等领域都有广泛应用。
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在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧 光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过 标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
实时荧光定量PCR 原理
常 规 PCR技术：
对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分 析。无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实 时检测。
实时定量PCR技术：
利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反 应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标 准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
DNA 5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
3’
解旋解链
GGAUC引G 物酶5‘
合成引物
RNA引物
RNA引物
5引‘ A物UC酶GCG
子链延长 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
5’
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
DNA 5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
3’
解旋解链
3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCT
DNA GGAUCG
聚合酶
5‘
合成引物
5‘AUCGCG A聚DT合NAA酶GCGTAGCTGCGAGGATCG
3’
子链延长 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚 合酶链反应（PCR） 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐 热，使这一过程耗时，费力，且易出错 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随 后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖
形 成
条变
单性
链
DNA单链
子链延伸 DNA加倍
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
PCR的基本原理
DNA引物
• •
PPCCRR反过应程条件9550℃
• PCR的特点
引物1
引物2
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件5702℃
实时荧光定量PCR 原理
如何对起始模板定量？
通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析
三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct
值
实时荧光定量PCR 原理 -------- 扩增 曲线
荧光基团
荧光检测元件 扩增曲线图：
横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集
基 基 基 法人 因 因 因 医类 诊 治 工 学学 断 疗 程 检研
产 测究 品
……
基因组DNA
获取特定DNA片段 扩 增 特 定 片 段
DNA
DNA聚合酶
引物
引物
引物 DNA聚合酶
Sanger的
测序技术
M13噬菌体
Mullis 的构思
引物 DNA聚合酶 DNA聚合酶 引物
特定DNA片段
94℃变性
条变
单性
链
DNA单链
子链延伸 DNA加倍
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件95℃
• PCR的特点
1 2 模板D3NA
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
DNA 2
50-65℃退火
XX℃延伸
94℃
55℃
37℃
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
(%)
100
酶 80 活 性 60
40
20
40 50 60 70 80 90
100
温度(℃)
94℃
55℃
72℃
PCR循环
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
标准的PCR反应体系
Kary B. Mullis <<The Unusual Origin
of the Polymerase Chain Reaction>>
1989年美国《Science》杂志列PCR 为十
余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸
年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。
生物样品 DNA片段
PCR技术的原理及应用
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
DNA 解旋解链
5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 合成引物 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
子链延长
3’ 解旋酶解链酶
5’
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
• PCR的特点
Taq酶 引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件7925℃
• PCR的特点
第1轮结束 第2轮开始
PCR的基本原理 • Ta•q
PPCCRR反过应程条件957502℃
• PCR的特点
Taq
Taq
Taq
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件72℃
• PCR的特点
第2轮结束
模板DNA
第1轮扩增 第2轮扩增
• PCR反应条件
• 第PC3R轮过程扩增
• PCR的特点
PCR的基本原理
第4轮扩增 第5轮扩增
第6轮扩增
提纲
实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR在医学和科研中的应用
实时荧光定量PCR定义
4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+
Hale Waihona Puke 各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug 2.5u
1.5mmol/L
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
DNA 2
形 成
3’
5’
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
1971 年 ， Khorana 提 出 ： 经 过 DNA 变 性 ， 与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引 物 ， 并 不 断 重 复 该 过 程 便 可 克 隆 tRNA 基因。 但由于测序和引物合成的困难，以及 70年代基因工程技术的发明使克隆基 因成为可能，所以，Khorana的设想被 人们遗忘了……
实时荧光定量PCR 原理
常 规 PCR技术：
对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分 析。无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实 时检测。
实时定量PCR技术：
利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反 应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标 准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
DNA 5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
3’
解旋解链
GGAUC引G 物酶5‘
合成引物
RNA引物
RNA引物
5引‘ A物UC酶GCG
子链延长 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
5’
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
DNA 5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
3’
解旋解链
3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCT
DNA GGAUCG
聚合酶
5‘
合成引物
5‘AUCGCG A聚DT合NAA酶GCGTAGCTGCGAGGATCG
3’
子链延长 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚 合酶链反应（PCR） 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐 热，使这一过程耗时，费力，且易出错 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随 后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖
形 成
条变
单性
链
DNA单链
子链延伸 DNA加倍
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
PCR的基本原理
DNA引物
• •
PPCCRR反过应程条件9550℃
• PCR的特点
引物1
引物2
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件5702℃
实时荧光定量PCR 原理
如何对起始模板定量？
通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析
三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct
值
实时荧光定量PCR 原理 -------- 扩增 曲线
荧光基团
荧光检测元件 扩增曲线图：
横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集
基 基 基 法人 因 因 因 医类 诊 治 工 学学 断 疗 程 检研
产 测究 品
……
基因组DNA
获取特定DNA片段 扩 增 特 定 片 段
DNA
DNA聚合酶
引物
引物
引物 DNA聚合酶
Sanger的
测序技术
M13噬菌体
Mullis 的构思
引物 DNA聚合酶 DNA聚合酶 引物
特定DNA片段
94℃变性
条变
单性
链
DNA单链
子链延伸 DNA加倍
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件95℃
• PCR的特点
1 2 模板D3NA
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
DNA 2
50-65℃退火
XX℃延伸
94℃
55℃
37℃
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
(%)
100
酶 80 活 性 60
40
20
40 50 60 70 80 90
100
温度(℃)
94℃
55℃
72℃
PCR循环
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
标准的PCR反应体系
Kary B. Mullis <<The Unusual Origin
of the Polymerase Chain Reaction>>
1989年美国《Science》杂志列PCR 为十
余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸
年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。
生物样品 DNA片段
PCR技术的原理及应用
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
DNA 解旋解链
5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 合成引物 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
子链延长
3’ 解旋酶解链酶
5’
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
• PCR的特点
Taq酶 引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件7925℃
• PCR的特点
第1轮结束 第2轮开始
PCR的基本原理 • Ta•q
PPCCRR反过应程条件957502℃
• PCR的特点
Taq
Taq
Taq
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件72℃
• PCR的特点
第2轮结束
模板DNA
第1轮扩增 第2轮扩增
• PCR反应条件
• 第PC3R轮过程扩增
• PCR的特点
PCR的基本原理
第4轮扩增 第5轮扩增
第6轮扩增
提纲
实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR在医学和科研中的应用
实时荧光定量PCR定义
4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+
Hale Waihona Puke 各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug 2.5u
1.5mmol/L
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
DNA 2
形 成
3’
5’
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
1971 年 ， Khorana 提 出 ： 经 过 DNA 变 性 ， 与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引 物 ， 并 不 断 重 复 该 过 程 便 可 克 隆 tRNA 基因。 但由于测序和引物合成的困难，以及 70年代基因工程技术的发明使克隆基 因成为可能，所以，Khorana的设想被 人们遗忘了……