PCR技术及其应用ppt课件
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PCR技术的基本原理及应用 ppt课件
11、增效PCR（booster PCR）
当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到
两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩
增。消耗了引物和酶，而特异扩增产量降低。
对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低
浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形
成产物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列
的扩增，只是由于引物少产量不高。约经15~20
和检测病理切片中含量ppt课较件 少的靶序列。
42
操作步骤
1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适 于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入
2. PCR扩增细胞内目的片段
3. 原位杂交检测扩增产物
A.阳性对照
ppt课件
B.阴性对照
43
C.原位检测mRNA表达
8、逆转录PCR（RT-PCR）
Prize
ppt课件
2
精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
研究生课程
第五章 PCR技术及原理（4学时）
ppt课件
1
第一节 PCR的原理
Kary Mullis
research scientist in the 1980s at a California biotechnology company called Cetus
co-winner of 1993 Nobel
pcr培训ppt课件
实验操作人员应接受专业培训，熟悉安全操作规程，避免在实验过程 中受伤或感染。
07
总结与展望
Pcr技术的总结
PCR技术的原理
PCR是一种在生物实验室中广泛应用的分子生物学技术，其基本原理是通过特定的DNA 聚合酶，在DNA双链之间进行热循环，从而实现DNA的快速扩增。
PCR技术的应用领域
PCR技术在许多领域都有广泛的应用，包括遗传学、医学、生物技术和农业等。通过PCR 技术，科学家们可以快速、准确地检测和鉴定DNA序列，这对于遗传疾病的诊断、生物 多样性的研究和基因工程等领域具有重要意义。
安全问题
生物安全
PCR实验涉及的生物材料可能具有传染性，因此需要采取适当的生物 安全措施，如穿戴个人防护装备、实验室内消毒等。
废物处理
实验产生的废物应按照相关规定进行妥善处理，避免对环境和人类健 康造成危害。
防止污染
PCR实验过程中应采取措施防止污染，如设置阴性对照、定期检测实 验室环境等。
人员安全
PCR技术的优缺点
PCR技术具有高灵敏度、高特异性和操作简便等优点，但也存在一些局限性，如对模板 DNA的纯度要求高、易受污染等。因此，在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的 PCR方法。
Pcr技术的发展趋势
要点一
提高灵敏度和特异性
随着基因组学和分子生物学研究的深 入，对PCR技术的灵敏度和特异性提 出了更高的要求。因此，未来的PCR 技术需要进一步提高其灵敏度和特异 性，以满足更广泛的研究和应用需求 。
05
Pcr技术的拓展应用
基因克隆与表达
基因克隆
通过PCR技术，科学家可以快速、准 确地获取特定基因片段，为基因克隆 提供基础。
基因表达
利用PCR技术，可以检测基因在不同 条件下的表达水平，有助于理解基因 功能和调控机制。
07
总结与展望
Pcr技术的总结
PCR技术的原理
PCR是一种在生物实验室中广泛应用的分子生物学技术，其基本原理是通过特定的DNA 聚合酶，在DNA双链之间进行热循环，从而实现DNA的快速扩增。
PCR技术的应用领域
PCR技术在许多领域都有广泛的应用，包括遗传学、医学、生物技术和农业等。通过PCR 技术，科学家们可以快速、准确地检测和鉴定DNA序列，这对于遗传疾病的诊断、生物 多样性的研究和基因工程等领域具有重要意义。
安全问题
生物安全
PCR实验涉及的生物材料可能具有传染性，因此需要采取适当的生物 安全措施，如穿戴个人防护装备、实验室内消毒等。
废物处理
实验产生的废物应按照相关规定进行妥善处理，避免对环境和人类健 康造成危害。
防止污染
PCR实验过程中应采取措施防止污染，如设置阴性对照、定期检测实 验室环境等。
人员安全
PCR技术的优缺点
PCR技术具有高灵敏度、高特异性和操作简便等优点，但也存在一些局限性，如对模板 DNA的纯度要求高、易受污染等。因此，在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的 PCR方法。
Pcr技术的发展趋势
要点一
提高灵敏度和特异性
随着基因组学和分子生物学研究的深 入，对PCR技术的灵敏度和特异性提 出了更高的要求。因此，未来的PCR 技术需要进一步提高其灵敏度和特异 性，以满足更广泛的研究和应用需求 。
05
Pcr技术的拓展应用
基因克隆与表达
基因克隆
通过PCR技术，科学家可以快速、准 确地获取特定基因片段，为基因克隆 提供基础。
基因表达
利用PCR技术，可以检测基因在不同 条件下的表达水平，有助于理解基因 功能和调控机制。
pcr技术课件ppt简短
通量PCR检测。
pcr技术的应用范围
01
02
03
基础研究
基因克隆、基因表达、基 因组测序、单核苷酸多态 性(SNP)检测等。
医学诊断
感染性疾病、遗传性疾病 、肿瘤等疾病的诊断。
生物多样性研究
物种鉴定、种群遗传学分 析、生态学研究等。
02
CATALOGUE
pcr技术的基本步骤
样本准备
样本类型
选择合适的样本类型，如 血液、组织等，以便后续 实验操作。
根据目的基因序列，选择特异性好、扩增 效率高的引物。
确认模板DNA的质量
设置合理的反应体系
确保使用的模板DNA无降解、无污染，浓 度和纯度适中。
根据引物、模板和PCR仪的规格，设置合理 的反应体系。实验Βιβλιοθήκη 的注意事项控制好反应温度和时间
PCR反应中，每个温度点的反应时间和升温/降温速度应保持一致。
避免出现非特异性扩增
将DNA模板、引物、dNTPs、酶等 试剂加入PCR反应管中。
进行PCR扩增
将PCR反应管放入PCR仪中，按照设 定的程序进行扩增。
产物检测和分析
收集PCR扩增产物，进行电泳分析或 荧光定量PCR等检测方法，确定目标 基因序列是否被成功扩增。
实验后处理
数据分析和结论
对实验数据进行统计和分析，得出结论。
将用过的引物和模板妥善储存，以备后续实验使 用。
仪器的维护与保养
定期对PCR仪进行维护和保养，确保设备的正常 运行。
05
CATALOGUE
pcr技术的优缺点
优点
01
02
03
04
灵敏度高
PCR技术可以检测出微量的 DNA，灵敏度非常高。
pcr技术的应用范围
01
02
03
基础研究
基因克隆、基因表达、基 因组测序、单核苷酸多态 性(SNP)检测等。
医学诊断
感染性疾病、遗传性疾病 、肿瘤等疾病的诊断。
生物多样性研究
物种鉴定、种群遗传学分 析、生态学研究等。
02
CATALOGUE
pcr技术的基本步骤
样本准备
样本类型
选择合适的样本类型，如 血液、组织等，以便后续 实验操作。
根据目的基因序列，选择特异性好、扩增 效率高的引物。
确认模板DNA的质量
设置合理的反应体系
确保使用的模板DNA无降解、无污染，浓 度和纯度适中。
根据引物、模板和PCR仪的规格，设置合理 的反应体系。实验Βιβλιοθήκη 的注意事项控制好反应温度和时间
PCR反应中，每个温度点的反应时间和升温/降温速度应保持一致。
避免出现非特异性扩增
将DNA模板、引物、dNTPs、酶等 试剂加入PCR反应管中。
进行PCR扩增
将PCR反应管放入PCR仪中，按照设 定的程序进行扩增。
产物检测和分析
收集PCR扩增产物，进行电泳分析或 荧光定量PCR等检测方法，确定目标 基因序列是否被成功扩增。
实验后处理
数据分析和结论
对实验数据进行统计和分析，得出结论。
将用过的引物和模板妥善储存，以备后续实验使 用。
仪器的维护与保养
定期对PCR仪进行维护和保养，确保设备的正常 运行。
05
CATALOGUE
pcr技术的优缺点
优点
01
02
03
04
灵敏度高
PCR技术可以检测出微量的 DNA，灵敏度非常高。
PCR技术的原理与应用ppt课件
2
1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热的DNA聚合酶。此 酶耐高温，并提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了 扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而 其灵敏性也大大提高。此酶的发现使PCR技术被广泛的应用。
13
锚定PCR ： 锚定PCR（Anchored PCR, A-PCR）主要用于分析具有可
变末端的DNA序列，Loh等用锚定PCR对人外周血淋巴细胞T 细胞受体α-链的mRNA的多变性进行了分析。先合成cDNA， 并用末端脱氧核苷酸转移酶在其3’-可变区末端加上一个 PolyG尾巴。Loh等在恒定区与可变区连接部位设一个引物， 另一个引物是一个具5’-polyG尾巴的引物。带有PolyG尾巴的 引物是一个固定点，它可以并与PolyG尾巴结合，无论其余部 分序列如何，只识别片段末端，利用此法可从前述mRNA中检 出至少20种不同序列，每一种都是独特的，表明锚定PCR不对 任何特殊序列有倾向性结果，可用于T细胞、肿瘤及其它部位 抗体基因的研究。
8
Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著 的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为 200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物 减少。
9
2.PCR技术的主要类型及其应用
14
锚定PCR原理示意图
15
标记PCR和彩色PCR：
标记PCR(Labelled Primers，LP-PCR)，LP-PCR是利 用同位素或荧光素对PCR引物的5‘端进行标记，用来检测 靶基因是否存在。彩色PCR(Color Complementation assay PCR，CCAPCR)，是LP-PCR的一种。它用不同颜色的荧 光染料标记引物的5’端，因而扩增后的靶基因序列分别带 有引物5‘的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可根据不 同荧光的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况，此法可 用来检测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微 生物的型别鉴定等。
1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热的DNA聚合酶。此 酶耐高温，并提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了 扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而 其灵敏性也大大提高。此酶的发现使PCR技术被广泛的应用。
13
锚定PCR ： 锚定PCR（Anchored PCR, A-PCR）主要用于分析具有可
变末端的DNA序列，Loh等用锚定PCR对人外周血淋巴细胞T 细胞受体α-链的mRNA的多变性进行了分析。先合成cDNA， 并用末端脱氧核苷酸转移酶在其3’-可变区末端加上一个 PolyG尾巴。Loh等在恒定区与可变区连接部位设一个引物， 另一个引物是一个具5’-polyG尾巴的引物。带有PolyG尾巴的 引物是一个固定点，它可以并与PolyG尾巴结合，无论其余部 分序列如何，只识别片段末端，利用此法可从前述mRNA中检 出至少20种不同序列，每一种都是独特的，表明锚定PCR不对 任何特殊序列有倾向性结果，可用于T细胞、肿瘤及其它部位 抗体基因的研究。
8
Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著 的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为 200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物 减少。
9
2.PCR技术的主要类型及其应用
14
锚定PCR原理示意图
15
标记PCR和彩色PCR：
标记PCR(Labelled Primers，LP-PCR)，LP-PCR是利 用同位素或荧光素对PCR引物的5‘端进行标记，用来检测 靶基因是否存在。彩色PCR(Color Complementation assay PCR，CCAPCR)，是LP-PCR的一种。它用不同颜色的荧 光染料标记引物的5’端，因而扩增后的靶基因序列分别带 有引物5‘的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可根据不 同荧光的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况，此法可 用来检测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微 生物的型别鉴定等。
《PCR临床应用》课件
案例二：遗传疾病的pcr诊断
总结词
早期诊断、准确率高
详细描述
PCR技术在遗传性疾病的诊断中具有重要作用。通过对特定基因的扩增和检测，可以在早期发现遗传 性疾病的存在，提高诊断的准确率，为患者及早接受治疗提供依据。
案例三：肿瘤标志物的pcr检测
总结词
灵敏度极高、有助于肿瘤早期发现
详细描述
PCR技术可以用于检测肿瘤标志物，如癌胚抗原、甲胎蛋白 等。通过对肿瘤标志物的扩增和检测，可以灵敏地发现肿瘤 的存在，有助于肿瘤的早期发现和治疗。
对样品质量要求高
对于某些降解严重或质量差的 样品，PCR可能无法获得理想
的结果。
PCR技术的前景展望
新技术的发展
个性化医疗
随着新技术如数字PCR、实时荧光定量PCR 等的出现，PCR技术的应用将更加广泛和精 确。
随着基因组学的发展，PCR技术有望在个性 化医疗领域发挥重要作用，为患者提供更 加精准的治疗方案。
特点
高灵敏度、高特异性、高扩增效率。
PCR技术原理
双链DNA在高温下解旋为单链，引物与单链DNA模板结合，在DNA聚合酶的作 用下，按照碱基互补配对原则合成新的DNA链。
通过多次循环，使目的DNA片段在短时间内获得极大程度的扩增。
PCR技术的发展历程
1971年
1985年
1988年
1993年
Kary Mullis发现Taq酶 。
PCR技术具有很好的可重复性 ，实验结果稳定可靠。
PCR技术的局限性
成本高
PCR技术需要特定的仪器和试 剂，成本较高，对于一些资源
有限的地方可能难以普及。
易污染
PCR技术对实验操作要求高， 如果操作不慎，容易造成交叉 污染，影响实验结果。
生物检测技术-PCR技术PPT
引物
根据需要扩增的序列长度和特异性要 求，确定引物的浓度和种类。
PCR扩增及产物分析
扩增
在PCR仪中进行扩增反应，设置适当的温度和循环次数，使DNA片 段得以扩增。
电泳分析
将扩增产物进行电泳分离，通过染色或荧光标记等技术对产物进行 分析和检测。
结果判断
根据电泳结果判断PCR扩增是否成功，并对产物进行定性或定量分析。
3
引物合成
将设计好的引物交由专业的引物合成公司进行合 成，得到可用于PCR反应的引物。
反应体系的组成
DNA聚合酶
选择高活性、高保真度的DNA聚合 酶，确保PCR扩增的准确性和特异性。
dNTPs
提供PCR所需的四种脱氧核苷酸，即 dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
缓冲液
提供适宜的酸碱度和离子浓度，维持 DNA聚合酶的活性。
基因突变和突变的检测
基因突变检测
PCR技术可以用于检测基因突变，通过设计特定的引物，可以扩增特定的DNA片段，通过比较正常和异常序列的 扩增产物，可以检测出基因突变的位置和类型。
突变筛选
利用PCR技术可以对大量样本进行突变筛选，通过设计针对特定突变的引物，可以对大量样本进行高通量的突变 检测，有助于疾病的早期发现和治疗。
快速高效
PCR技术能够在短时间内完成DNA的大规模扩增，大大提高了检测效 率。
操作简便
PCR技术流程相对简单，易于操作，使得它在实验室中得到了广泛应 用。
缺点
成本较高
PCR技术所需的仪器、试剂等成本较高， 对于一些经费有限的实验室来说可能是
一个负担。
对样品质量要求高
PCR技术的灵敏度使得其对样品质量 要求较高，样品中微小的杂质或污染
PCR的原理与应用课件
加上EcoRI接头，磷酸化，cDNA分级
cDNA合成完毕，准备连接
第一链合成
cDNA合成过程示意图
.
*
cDNA序列的克隆
.
*
（二）PCR的种类 2.Nested PCR: 巢式PCR 原理: 利用两套PCR引物（巢式引物）对进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。 优点: 由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性；增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5'RACE）的特异性。 应用: 一般应用于动物方面。如: 病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等。
•高灵敏度
•适用于在单个样品中检测几个mRNA
•适用于大量样品分析
一步法和两步法RT-PCR的比较
.
*
EcoRI
寡聚(dT)随机6碱基引物R
寡聚(dT)
随机6碱基引物R
mRNA
(A)n (T)
(A)n
(A)n (T)
R
R
R
R
R
R
第二链合成
(A)n (T)
(A)n
R
R
R
R
R
R
(A)n (T)
EcoRI
很少有在公司工作的科研人员得 诺贝尔奖, Mullis是其中之一
.
*
Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链, 自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶, 面对面地合成着DNA, ……
.
*
cDNA合成完毕，准备连接
第一链合成
cDNA合成过程示意图
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cDNA序列的克隆
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（二）PCR的种类 2.Nested PCR: 巢式PCR 原理: 利用两套PCR引物（巢式引物）对进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。 优点: 由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性；增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5'RACE）的特异性。 应用: 一般应用于动物方面。如: 病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等。
•高灵敏度
•适用于在单个样品中检测几个mRNA
•适用于大量样品分析
一步法和两步法RT-PCR的比较
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EcoRI
寡聚(dT)随机6碱基引物R
寡聚(dT)
随机6碱基引物R
mRNA
(A)n (T)
(A)n
(A)n (T)
R
R
R
R
R
R
第二链合成
(A)n (T)
(A)n
R
R
R
R
R
R
(A)n (T)
EcoRI
很少有在公司工作的科研人员得 诺贝尔奖, Mullis是其中之一
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Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链, 自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶, 面对面地合成着DNA, ……
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PCR技术及其延伸与应用PPT课件
HCl(pH8.4,20℃)150mmol/L MgCl2,1mg/ml明胶。
• dNTP贮备液 • DNA模板
最新课件
11
操作程序
• 试剂混合 • PCR仪程序设计：94℃变性30s，55℃退火20s，然后
在72℃延伸30s，共循环30-35次。最后一次循环结束后， 再将反应管置72℃温育5min，以确保充分延伸。
• Kary Mullis因发明了“聚合酶链式反应” 而获得1993年度诺贝尔化学奖。(一名加拿大籍英
国科学家Michael Smith因开创了“寡核苷酸基因定点诱变”的方法 而与Mullis同享此荣)
最新课件
4
PCR技术检测细菌
• 鸭疫里默氏杆菌 • 霍乱弧菌 • 食源性病原细菌 • 结核杆菌
最新课件
5
PCR与病毒类疾病应用
• 杂交法检测植物病毒和类病毒 • 利用RT-PCR对黄瓜病毒源种类进行检测 • 诊断人类乳头状病毒HPV感染
最新课件
6
诊断遗传疾病
最新课件
7
PCR的特点
• 特异性高-聚合酶 • 首次报导用大肠杆菌的DNAPolymerase I的
Klenow大片段。90℃会变性失活，需每次 PCR循环都要重新加入；同时引物是在37℃ 延伸
鼠酶－莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus)
最新课件
25
Touch down PCR
• 一般PCR的体系 • 一般PCR的设计原理 • 不同的PCR过程 • 目的：在不知道理想退火温度的条件下保
证扩出产物
最新课件
26
梯度PCR
• 在特殊PCR仪上进行的一般PCR • 目的：寻找最佳的退火温度 • 与TouchDown PCR的区别
• dNTP贮备液 • DNA模板
最新课件
11
操作程序
• 试剂混合 • PCR仪程序设计：94℃变性30s，55℃退火20s，然后
在72℃延伸30s，共循环30-35次。最后一次循环结束后， 再将反应管置72℃温育5min，以确保充分延伸。
• Kary Mullis因发明了“聚合酶链式反应” 而获得1993年度诺贝尔化学奖。(一名加拿大籍英
国科学家Michael Smith因开创了“寡核苷酸基因定点诱变”的方法 而与Mullis同享此荣)
最新课件
4
PCR技术检测细菌
• 鸭疫里默氏杆菌 • 霍乱弧菌 • 食源性病原细菌 • 结核杆菌
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5
PCR与病毒类疾病应用
• 杂交法检测植物病毒和类病毒 • 利用RT-PCR对黄瓜病毒源种类进行检测 • 诊断人类乳头状病毒HPV感染
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6
诊断遗传疾病
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7
PCR的特点
• 特异性高-聚合酶 • 首次报导用大肠杆菌的DNAPolymerase I的
Klenow大片段。90℃会变性失活，需每次 PCR循环都要重新加入；同时引物是在37℃ 延伸
鼠酶－莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus)
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25
Touch down PCR
• 一般PCR的体系 • 一般PCR的设计原理 • 不同的PCR过程 • 目的：在不知道理想退火温度的条件下保
证扩出产物
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26
梯度PCR
• 在特殊PCR仪上进行的一般PCR • 目的：寻找最佳的退火温度 • 与TouchDown PCR的区别
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每完成一 个循环需 2～4分钟， 2～3小时 就能将待 扩目的基 因扩增放 大几百万 倍。
ppt课件.
15
模板DNA
第1轮扩增 第PC2R反轮应扩条增件
PCR过程
第PC3R的轮特扩点增
PCR的基本原理
理想拷贝数=2n
重n 循复环次数30轮后
第4轮扩增第5轮2扩3增0=1,0第763轮,扩增741,824 实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数
DNA 2
形 成
条变 单性 链
DNA单链
子链延伸 DNA加倍
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
ppt课件.
18
二、PCR反应体系
缓冲液 dNTP 引物 模版 DNA聚合酶
ppt课件.
19
1. 缓冲液
标准的缓冲液含 10mM Tris·HCl
7 cycle = 128 Amplicon
ppt课件.
No. of Cycles
1
No. Amplicon Copies of Target
2
2
4
3
8
4
16
5
32
6
64
20
1,048,576
30
1,073,741,824
17
PCR反应
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
ppt课件.
20
Mg2+
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。
Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量 下降； Mg2+过高影响反应特异性。
Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、 EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
一般以 MgCl2 的形式提供，标准浓度为 1.5mM 。 Mg2+ 浓度的高低会影响扩增的特异 性和产率
这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循 环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断 重复。
ppt课件.
10
ppt课件.
11
PCR原理示意图
PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95oC)
Target Sequence
第八章 PCR技术及其应用
ppt课件.
1
PCR技术的建立
①Khorana(1971)等提出在体外经
DNA变性,与适当引物杂交,再用 DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设 想—“修复复制”
但由于测序和引物合成的困难，以 及70年代基因工程技术的发明使克 隆基因成为可能，所以，Khorana的 设想被人们遗忘了……
ppt课件.
2
② 1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现
Mullis的构思
引物 DNA聚合酶
DNA聚合酶 引物
特定DNA片段
ppt课件.
3
94℃变性
50-65℃退火
XX℃延伸Байду номын сангаас
ppt课件.
4
94℃
55℃
37℃
ppt课件.
5
③ 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术
pH 为 8.3-9.0（室温），而在延伸温度（72 ℃）下， pH 值接近 7.2
缓冲液中含有一种二价阳离子，用于激活 DNA 聚合酶的活性中心，一般使用 Mg2+ ，有 时使用 Mn2+
缓冲液中还含有 50mM 的钾离子
有些缓冲液中还加入一些添加剂和共溶剂可降 低错配率，提高富含 G+C 模板的扩增效率。
ppt课件.
16
Target Amplification
1 cycle = 2 Amplicon
2 cycle = 4 Amplicon
3 cycle = 8 Amplicon
4 cycle = 16 Amplicon
5 cycle = 32 Amplicon
6 cycle = 64 Amplicon
sequences
②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后， 温度降至55℃左右，引物与模板DNppAt课单件. 链的互补序列配对结合1；3
PCR Cycle - Step 3 -
At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated
Target Sequence
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后， 使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成 为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
ppt课件.
12
PCR Cycle - Step 2 – Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
(%)
100
酶 80 活 性 60
40
20
40 50 60 70 80 90 100
温度p(pt℃课件).
6
94℃
55℃
72℃
PCR循环
ppt课件.
7
Kary B. Mullis
<<The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction>>
与发展》杂志(R&D)记者说的一番ppt课话件.
8
第八章 PCR技术及其应用
第一节 PCR技术原理和 工作方式
ppt课件.
9
一、PCR的基本原理
类似于DNA的体内复制
首先待扩增DNA•模板加热变性解链，随之将 反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引 物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退 火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸
1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科 学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年 Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。
“我不大喜欢动手,我宁肯不动手,我不喜欢做费力的事。作为
一个发明家,重要的一点是为解决某些问题而尽力设计一个简
捷的动手方案。”这是PCR的发明者Mullis在1991年对《研究
ppt课件.
③引物的延伸： DNA模板--引物 结合物在 TaqDNA聚合酶 的作用下，以 dNTP为反应原 料，靶序列为模 板，按碱基配对 与半保留复制原 理，合成一条新 的与模板DNA 链。
14
End of the 1st PCR Cycle –
Results in two copies of target sequence
ppt课件.
15
模板DNA
第1轮扩增 第PC2R反轮应扩条增件
PCR过程
第PC3R的轮特扩点增
PCR的基本原理
理想拷贝数=2n
重n 循复环次数30轮后
第4轮扩增第5轮2扩3增0=1,0第763轮,扩增741,824 实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数
DNA 2
形 成
条变 单性 链
DNA单链
子链延伸 DNA加倍
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
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18
二、PCR反应体系
缓冲液 dNTP 引物 模版 DNA聚合酶
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19
1. 缓冲液
标准的缓冲液含 10mM Tris·HCl
7 cycle = 128 Amplicon
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No. of Cycles
1
No. Amplicon Copies of Target
2
2
4
3
8
4
16
5
32
6
64
20
1,048,576
30
1,073,741,824
17
PCR反应
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
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20
Mg2+
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。
Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量 下降； Mg2+过高影响反应特异性。
Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、 EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
一般以 MgCl2 的形式提供，标准浓度为 1.5mM 。 Mg2+ 浓度的高低会影响扩增的特异 性和产率
这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循 环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断 重复。
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10
ppt课件.
11
PCR原理示意图
PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95oC)
Target Sequence
第八章 PCR技术及其应用
ppt课件.
1
PCR技术的建立
①Khorana(1971)等提出在体外经
DNA变性,与适当引物杂交,再用 DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设 想—“修复复制”
但由于测序和引物合成的困难，以 及70年代基因工程技术的发明使克 隆基因成为可能，所以，Khorana的 设想被人们遗忘了……
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2
② 1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现
Mullis的构思
引物 DNA聚合酶
DNA聚合酶 引物
特定DNA片段
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3
94℃变性
50-65℃退火
XX℃延伸Байду номын сангаас
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4
94℃
55℃
37℃
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5
③ 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术
pH 为 8.3-9.0（室温），而在延伸温度（72 ℃）下， pH 值接近 7.2
缓冲液中含有一种二价阳离子，用于激活 DNA 聚合酶的活性中心，一般使用 Mg2+ ，有 时使用 Mn2+
缓冲液中还含有 50mM 的钾离子
有些缓冲液中还加入一些添加剂和共溶剂可降 低错配率，提高富含 G+C 模板的扩增效率。
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16
Target Amplification
1 cycle = 2 Amplicon
2 cycle = 4 Amplicon
3 cycle = 8 Amplicon
4 cycle = 16 Amplicon
5 cycle = 32 Amplicon
6 cycle = 64 Amplicon
sequences
②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后， 温度降至55℃左右，引物与模板DNppAt课单件. 链的互补序列配对结合1；3
PCR Cycle - Step 3 -
At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated
Target Sequence
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后， 使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成 为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
ppt课件.
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PCR Cycle - Step 2 – Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
(%)
100
酶 80 活 性 60
40
20
40 50 60 70 80 90 100
温度p(pt℃课件).
6
94℃
55℃
72℃
PCR循环
ppt课件.
7
Kary B. Mullis
<<The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction>>
与发展》杂志(R&D)记者说的一番ppt课话件.
8
第八章 PCR技术及其应用
第一节 PCR技术原理和 工作方式
ppt课件.
9
一、PCR的基本原理
类似于DNA的体内复制
首先待扩增DNA•模板加热变性解链，随之将 反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引 物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退 火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸
1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科 学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年 Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。
“我不大喜欢动手,我宁肯不动手,我不喜欢做费力的事。作为
一个发明家,重要的一点是为解决某些问题而尽力设计一个简
捷的动手方案。”这是PCR的发明者Mullis在1991年对《研究
ppt课件.
③引物的延伸： DNA模板--引物 结合物在 TaqDNA聚合酶 的作用下，以 dNTP为反应原 料，靶序列为模 板，按碱基配对 与半保留复制原 理，合成一条新 的与模板DNA 链。
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End of the 1st PCR Cycle –
Results in two copies of target sequence