霍乱弧菌检验程序
传染病检测SOP工作手册-霍乱弧菌[2]
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霍乱弧菌实验室检测SOP手册1.标本的采集和送检1.1.标本的采集：采集标本的好坏，对检验工作的质量影响很大。
为尽快获得细检查结果，应在发病早期、在服用抗菌药物之前尽快采集标本和及时送到检验室。
标本以病人大便为主。
采便方法用灭菌的棉拭采集排出的新鲜大便，亦可用直肠棉拭或用采便管由肛门插入3㎝～5㎝采集。
一般要求水样便采集1ml～3ml，固形便采取蚕豆大小粪量。
有时病人的呕吐物、沾染大便的衣物和尸体的肠内容物亦可作为检材。
带菌者的大便可用棉拭或直肠棉拭采取。
1.2.标本的送检：采取的标本应立即接种培养基，典型病人的水样便含有大量病菌（106/ml～109/ml），可直接做分离培养并同时增菌培养。
不需做直接分离的均可接种碱性蛋白胨水增菌。
并立即送检验室。
1.3.标本运送途中较远，也可将标本放入文腊氏保存液或卡里—布莱尔运送培养基。
标本与保存液的比例为8ml～10ml保存液加1ml～3ml水样便或蚕豆大的固形便。
也可用厚吸墨纸条吸饱水样便放入小塑料袋内封好送检。
送检标本时，必须认真填写送检单，标本必须妥善包装，专人送检，并防止污染，注意安全，送检箱用后要严密消毒。
2.检验方法2.1.培养方法2.1.1.增菌培养：所有标本都应经过增菌，尤其是恢复期病人、带菌者或用过抗生素的病人标本，需增菌后再分离。
碱胨水接种后放37℃6～8小时，夏日可将运送时间计算在内。
保存液内的标本取1ml种入碱胨水中。
培养后慢慢地从碱胨水生长的菌膜下，取一接种环表层培养物接种于4号或庆大霉素琼脂平板。
标本含菌少时，可实行二次增菌。
取第一次碱胨水增菌后的表层液0.1～0.2ml，接种于另一碱胨水中，37℃6～8小时再做分离。
2.1.2.分离培养：急性典型病人标本在增菌的同时直接做分离培养，这样既可缩短检出的时间，还可避免标本中如有不凝集弧菌经增菌后大量繁殖，影响霍乱弧菌的分离。
其它标本均应增菌后再做分离培养。
当前的习惯多为碱性蛋白胨水增菌，再用强选择性培养基分离，37℃12～16小时长出的菌落，可供做玻片凝集用。
霍乱检测操作规程
霍乱检测操作规程霍乱是一种由霍乱弧菌引起的急性肠道传染病，其症状包括剧烈腹泻、呕吐和腹痛。
霍乱具有高度传染性，因此在进行霍乱检测时需要遵循一定的操作规程，以确保实验室工作人员和社会公众的安全。
下面是一份霍乱检测的操作规程，以供参考。
1. 实验室准备：- 确保实验室设备和试剂的完好和有效性。
- 准备好所需的培养基、试剂和仪器。
- 提前准备好相关实验记录和报告模板。
2. 实验室设备清洁和消毒：- 定期对实验室设备进行清洁和消毒，特别是接触到样本的仪器和工具。
- 使用合适的消毒剂对实验台面、试剂架和实验室周边进行消毒。
3. 样本采集和处理：- 使用适当的个人防护装备，包括手套、口罩和护目镜。
- 选择合适的采样方法，如直肠拭子、粪便样本或病人的呕吐物。
- 将采样好的样本放入严密密封的容器中，避免样本泄漏和污染其他样本。
- 将样本尽快送往实验室进行处理，以确保有效的检测结果。
4. 霍乱检测方法：- 使用合适的实验方法和试剂进行霍乱的检测，如PCR、免疫学检测或培养方法。
- 按照试剂和仪器的说明书进行实验操作，确保准确和可靠的结果。
- 对实验过程中的废液和废物进行正确处理，以防止污染和传播。
5. 结果判读和报告：- 对检测结果进行仔细的观察和判断，根据标准判定结果的阴阳性。
- 将结果记录在实验记录中，并及时生成报告。
- 如有需要，将结果报告给相应的卫生部门和相关人员。
6. 实验室安全和废物处理：- 在实验室操作过程中，严格遵守实验室安全规定，确保操作人员的安全。
- 对实验室产生的废液和废物进行正确的处置和处理，以降低污染和传播的风险。
- 使用合适的方法和设备对操作台面和工具进行清洁和消毒。
7. 实验室记录和质量控制：- 对实验室操作进行详细的记录，包括样本信息、实验步骤和结果等。
- 定期进行质量控制实验，以确保实验的准确性和可靠性。
- 定期进行实验室内部和外部的质量评估，及时发现和纠正实验中的问题。
总结：霍乱检测的操作规程至关重要，它能确保实验室工作人员和社会公众的安全。
[医药卫生]霍乱弧菌实验室检验技术
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三、霍乱弧菌常规检验
样本采集、送检和保存 霍乱的病原学检查 病原分离技术要点
2019/5/21
样本采集、送检和保存
粪便：标本的采集以病人粪便为主，水样便采 取1～3mL，成形便采取指甲大小的粪量，亦 可用直肠棉拭或采便管由肛门插入直肠内3～ 5cm处采取。急性期病人取水样便标本在增菌 培养的同时可取其粘液絮片或用棉拭子直接接 种于碱性琼脂、TCBS琼脂培养基。带菌者粪 便都应接种碱性蛋白胨水培养基，放37℃增菌 6～8h后，从菌膜下表层取一接种环培养物， 划线接种于碱性琼脂、TCBS琼脂培养基。不 能立即检查的，要放入碱性蛋白胨水或文腊二 氏保存液或插入Cary-Blair二氏半固体保存培养 基中。标本与保存液比例约为1∶5。
2019/5/21
两者不同点：
O139群所致病中有44.3%可发生腹部痉 挛，也有引起严重粘液性腹泻的，进入 外周血液可引起发热，出现菌血症或败 血症。印度出现20例病人中有17例发热、 白细胞增多。而O1群引起的病人未曾见 过。
鉴别两者，必须通过血清学诊断来区分。 O22群与O139群血清有交叉汇集反应，必
– 不典型01群霍乱弧菌：可被多价01群血清所 凝集，但该群菌不产生肠毒素，因此无此病 性
2019/5/21
霍乱病原体分类
O1群
古典生物型 埃尔托生物型
小川型 稻叶型 颜岛型
霍乱弧菌
霍乱病原菌
O139群（Bengal） 非O1群
O2-O200群
腹泻病原菌
2019/5/21
O1群和O139群抗原构造与血清分型
须用O22群弧菌吸收，去除交叉汇集现象。
2019/5/21
总之，O139群霍乱弧菌和O1群弧菌二 者生物型既有区别又有联系。最大区别 是荚膜和O1群生物合成基因的有无这些 提示，O139群霍乱弧菌不是O1群EItor生 物型简单的点突变。可能存在更复杂的 突变机制。
霍乱弧菌的微生物学诊断检查方法
霍乱弧菌的微生物学诊断检查方法微生物学诊断由于霍乱流行迅速，且在流行期间发病率及死亡率均高，危害极大，因此早期迅速和正确的诊断，对治疗和预防本病的蔓延有重大意义。
直接镜检采取病人“米泔水样”大便或呕吐物。
镜检（涂片染色及悬滴法检查）观察细菌形态，动力特征。
细菌分离培养可将材料接种至碱性蛋白胨水37℃培养6～8小时后，取生长物作形态观察，并转种于碱性平板作分离培养，取可疑菌落作玻片凝集，阳性者再作生化反应及生物型别鉴定试验。
特异性制动试验取检材或新鲜碱性蛋白胨水培养物一滴，置于载玻片上，再加霍乱弧菌多价诊断血清，加盖玻片，用暗视野镜观察，3分钟内运动被抑制的即为阳性，此法优点是快速而特异操作简便，但必须有数量较多的弧菌才检出。
免疫荧光试验除一般免疫荧光法外，还可用荧光菌球法检查。
1.标本采集和运送:霍乱是烈性传染病,凡在流行季节和地区有腹泻症状的患者均应快速准确作出病原学诊断.在发病早期,尽量在使用抗菌药物之前采集标本.可取患者”米泔水”样便,也可采取呕吐物或尸体肠内容物,或采取肛门试子.标本应避免接触消毒液,采取的标本最好就地接种碱性胨水增菌,不能及时接种者可用棉签挑取标本或将肛门试子直接插入卡-布运送培养基中.送检标本装在密封,不易破碎的容器中,置室温由专人输送.甘油盐水保存液不适合于弧菌的运送.2．标本直接检查:荚膜肿胀试验：特异性抗血清与相应细菌的荚膜抗原特异性结合形成复合物时，可使细菌荚膜显著增大出现肿胀的试验常用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等的检测革兰染色：革兰染色过程所用四种不同溶液和作用：1、碱性染料这在简单染色中已讨论过，此处用结晶紫。
2、媒染剂其作用是增强染料与细菌的亲和力，更好地加强染料与细胞的结合。
常用的媒染剂是碘液。
3、脱色剂帮助染料从被染色的细胞中脱色。
利用细菌对染料脱色的难易程度不同，而将细菌加以区分。
革兰阳性细菌不易被脱色剂脱色，而革兰阴性细菌则易被脱色。
常用的脱色剂是丙酮或乙醇，这里所用的是95%的乙醇。
霍乱弧菌实验室检验技术20060409
三、霍乱弧菌的形态学
（一）形态与染色
（二）菌细胞结构 1、细胞壁 ：特异性多糖（O抗原） 2、细胞膜 3、细胞浆：质粒 4、核质：双股一环状DNA 5、荚膜 6、鞭毛：长而粗（H抗原），起运动作用。
四.微生物学特性:
（ 一）. 形态、染色:
自病人新分离的霍乱弧菌为革兰氏阴 性短小稍弯曲的杆菌，无芽胞，菌体两端钝 圆或稍平，菌体单端有一根鞭毛，长可达菌 体长度的4～5倍，运动极为活泼。
五、霍乱弧菌的主要抗原和血清分型
（一）鞭毛抗原（H抗原）：特异性低，不耐热， 100℃ 2h 即被破坏。 （二）菌体抗原（O抗原） ：特异性强，耐热， 具有群和型特异性。 根据O抗原的不同霍乱弧菌已有200个以上 的O血清群 1. O1群 （1）根据O抗原成分的不同分群特异性抗原因子 （A抗原因子）和型特异性抗原因子（B和C抗 原因子）
二.霍乱弧菌在弧菌科的分类地位
弧菌科包括5个属
﹙一﹚ 弧菌属 1.霍乱弧菌﹙V.cholerae﹚：与O1群霍乱弧菌具有共 同鞭毛抗原、生化性状类似，仅菌体抗原不同的弧菌 。目 前有O200以上血清群，其中O1和O139群含有相同的毒素基因， 可引 起 霍 乱流行。
2.其它弧菌：副溶血弧菌﹙V. parahaemolyticus﹚、 河弧菌、拟态弧菌、溶藻弧菌等。
不与022群、0155群及01群粗糙型交叉 凝集。
六.霍乱弧菌的抵抗力
（一）对温度的耐受力
1. 无芽胞，对热耐受力不强。零度以下可活14 天左右。 2. 实验室保存菌种时放室温，不放冰箱 （二） 对干燥的耐受力敏感，干燥的玻片上3小 时左右死亡。 （三）对各种常用消毒剂如含氯制剂、碘制剂 均为敏感。
（2）根据型特异性抗原因子的不同可把O1 霍乱弧菌的两个生物型分为三个血清型： 小川 型霍乱弧菌（ A，B， 少量C） 稻叶型霍乱弧菌（ A， C ）
微生物检验危急值报告程序
微生物检验危急值报告程序
1 目的
对于在血、骨髓、脑脊液等标本中（涂片或培养）发现细菌或真菌，以及发现疑似高致病性病原微生物或国家规定立即上报的法定传染病，第一时间报告给临床医生及医院相关部门，为诊断治疗或隔离防疫赢得时间。
2 适用范围
适用于临床微生物检验的所有血培养、骨髓培养、脑脊液涂片或培养标本，以及可能发现疑似高致病性病原微生物或国家规定立即上报的法定传染病病原体的所有标本。
3 职责
实验室所有经授权工作人员均应执行本程序。
4 程序内容
4.1 微生物检验危急值：
4.1.1 血液、骨髓或脑脊液检出（涂片或培养）病原微生物。
4.1.2 O1群霍乱弧菌、O139群霍乱弧菌、鼠疫杆菌、炭疽杆菌、肠出血大肠埃希菌 O157：H7、伤寒沙门菌、痢疾志贺菌、猪链球菌、结核杆菌（或抗酸染色阳性）、生殖道淋病奈瑟菌、布鲁菌、脑膜炎奈瑟菌等传染性较强的微生物及其他国家规定立即上报的法定传染病病原体。
4.2 微生物危急值报告方式和处理。
4.2.1 血培养、骨髓培养、脑脊液培养的危急值报告方式按《微生物检验结果》中的分级报告程序进行，电话通知相应临床科室并及时填写《检验科危急值报告登记表》。
4.2.2 脑脊液涂片发现细菌或真菌，应立即审发涂片结果，电话通知临床并及时填写《检验科危急值报告登记表》。
4.2.3 检出 O1 群霍乱弧菌、O139 群霍乱弧菌、鼠疫杆菌、炭疽杆菌、肠出血大肠埃希菌 O157：H7、伤寒沙门菌、痢疾志贺菌、猪链球菌、结核杆菌（或抗酸染色阳性）、生殖道淋病奈瑟菌、布鲁菌、脑膜炎奈瑟菌等传染性较强的微生
物或国家规定立即上报的法定传染病病原体，按《疑似高致病性病原微生物标本管理程序》处理。
霍乱弧菌采样及快速检测操作注意事项
霍乱弧菌采样注意事项
一．尽早采样，最好在用药前。
二．采样量要足够，固体粪便1-2g，液体粪便1-2ml放入10ml 碱性胨水中。
三．采样时要填写送检单，内容包括患者姓名、性别、年龄、采样日期、送样单位、送样人。
四．采样后专人及时送检，防治污染。
霍乱弧菌快速检测操作及注意事项
一、操作步骤：
1、待检试纸条置于洁净干燥的工作台上
2、用干净的吸管或加样器吸取样品或增菌样品2-3滴，滴加到检测条样品加入端（白色端），开始计时。
3、2-15分钟内观查结果。
15分钟后结果不计。
二、结果判断：
阴性：一条红线出现，即质控线
阳性：两条红线出现，即检测线（中间）和质控线
无效：无红线出现
三、样品处理
1、直接检测：水样便
2、增菌检测：1-2ml接种至10ml碱性胨水中。
37℃6-8
小时或过夜。
3、水样、食品标本略。
四、注意事项
1、检测试纸条4-30℃阴凉避光干燥处保存，注意防潮，有效期一年。
2、用新鲜标本，不得使用陈旧标本。
3、加样时用干净吸管或干净加样器加样，若将检测条直接浸入样品中不得超过0.5cm。
4、实验后彻底消毒污染区及具有传染可能的污染物。
霍乱弧菌的检验程序
霍乱弧菌的检验程序临床细菌实验室接到高度疑似患者标本，应尽快地进行检验。
具体处理方法如下。
1.临床标本（患者排泄物、呕吐物、肛拭、肛管内容物及残留、剩余食物等）直接涂片，观察动力，再做制动试验以及革兰染色，镜检发现革兰阴性、细小、直的、微弯、逗号状的杆菌。
疑似者即予电话报告2.标本直接接种：①血琼脂平板；②弧菌鉴别性平板（4号琼脂平板、碱性琼脂平板）；③接种碱性胨水3.保留原始标本（不可置于冰箱冷藏）4.35℃孵育上述所有平板及胨水5.6~8h后：①取碱性胨水培养物涂片（直接观察动力、做制动试验）染色镜检；②移种鉴别性琼脂平板和血琼脂平板；③霍乱红试验；④观察血琼脂平板，见有微小菌落生长。
立即涂片染色，霍乱多价血清凝集，氧化酶试验。
如符合霍乱弧菌的推断性鉴定，可作出早期初步报告。
6.继续孵育过夜后，做玻片凝集试验。
自分离平板上挑取可疑菌落与霍乱多价诊断血清做玻片凝集试验，所用血清的效价应在1：80～1：160，如过浓，则稀释后再做凝集。
将稀释血清滴加在洁净的载玻片上，挑取可疑菌落混悬于血清内，即刻（一般不超过10s）出现肉眼可见的明显凝集者为阳性。
菌落应以生理盐水作对照，不发生凝集。
为了提高阳性检出率，应多挑可疑菌落进行玻片凝集。
将O1群霍乱多价血清凝集阳性菌落再做氧化酶、涂片染色镜检，初步推断性鉴定，将此高度疑似菌株，报告当地疾病控制中心做最后鉴定。
霍乱弧菌的检测1.涂片检查：取新鲜送检标本涂片2张，干燥后，用乙醇或甲醇固定，分别用革兰染色剂1：10稀释的石碳酸复红染色，用油镜检查，观察有无革兰阴性呈鱼群排列的弧菌。
悬滴检查：取患者粪便，制成悬滴标本或圧滴标本，检查细菌的动力，霍乱弧菌古典型和EL-Tor型常呈穿梭状及活泼的活动，在悬滴涂片中加O1群霍乱弧菌诊断血清后，在显微镜下观察，若原运动活泼的现象停止，为制动试验阳性。
2.培养：取疑似患者粪便直接接种于碱性蛋白胨水中，进行增菌，同时划线接种于碱性琼脂平板或TCBS平板及血液琼脂平板，孵育于35℃。
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霍乱弧菌检验程序
一、检查对象
一天内腹泻三次或三次以上的病人。
二、标本采集及处理
1、采集时间：在未服用抗生素前采样。
2、采集方式：用棉拭子或采便管从肛门插入直肠3—5厘
米取样，必须看到有粪便黏附才可：对于自然排出的水样便、呕吐物及保存液保存的标本可直接接种分离或吸取
0.5ML、成形大便取黄豆左右大小。
3、标本送检：标本采集后应立即送检。
若不能立即送检，
可保存于碱性蛋白胨水中尽快送检验。
24小时以上才能送检的标本，应使用文一腊二氏保存液保存。
4、标本处理：将标本直接分离接种于4号琼脂及放入
8—10ML碱性蛋白胨水中增菌。
“两管三板”：
送检标本马上接种一个4号琼脂平板、同时碱性蛋白胨水培养管增菌；—8小时后接种增菌管内标本于第二块4号琼脂平板，同时转种第二管碱性蛋白胨水；6—8小时后继续接种第二管碱性蛋白胨水的标本于第三块4号琼脂平板上。
三、检验程序：
1、弧菌形态：
弧菌生长快、菌落大、培养4—5小时，原划线处有菌苔生长，8—10小时可长出小菌落，16小时菌落直径可达2毫米。
菌落略带灰色、半透明、扁平、稍隆起、光滑湿润，培养时间延长或室温放置后，菌落略带黄色，中心厚而周围透明，培养基含亚碲酸钾使得菌落成灰色，中心形成黑色金属碲沉淀。
在平皿上挑取典型菌落做玻片凝集试验。
2、玻片凝集试验：
首先要注意抗原抗体比例和保证抗原（菌株）的纯洁性，使用O1群和O139群两种诊断血清。
如未获单个菌落，可挑取可疑菌苔边缘透明部分做玻片凝集。
注意，凝集的菌落应以生理盐水作对照，检查有无自然凝集；然后用此玻片显微镜下看动力（动力活泼如流星样）；再将此玻片革兰氏染色看弧菌形态。
3、弧菌分型：
稻叶型和小川型诊断血清做玻片凝集试验进一步分型。
四、报疫程序：
一旦发现阳性可疑标本立即用铁罐保存，通知送检科室，确认病人资料；上报医院总值班2460或2560，派车送海珠区防疫站确证。
五、标本处理：
发现Ⅱ号菌阳性可疑标本，即送标本往防疫站确认。
余下的碱性胨水管、直划板等放置于专用铁盒内，留待防疫反馈讯息后，浸5%戊二醛消毒水30分钟后交工人煮沸1小时再清洗或弃置。
同时要登记于烈性传染病登记本和强毒菌株及污染物品处理登记本。