013 霍乱弧菌检验标准操作规范
霍乱弧菌血清学检测标准操作规程
霍乱弧菌血清学检测标准操作规程
1．目的
规范霍乱弧菌的血清学检测标准操作规程。
2．原理
用已知的霍乱弧菌诊断血清在载玻片上直接与细菌培养物或菌悬液混合，若出现肉眼可见的特异性凝集块，表示该菌即为霍乱弧菌。
3．试剂
霍乱弧菌诊断血清，生理盐水。
4．质控
霍乱弧菌ATCC14035阳性；大肠埃希菌ATCC25922阴性。
5.操作步骤
5.1 先用接种环取1环生理盐水于玻片上，以接种针挑取少许菌落与盐水混匀，再取稀释血清1环与之混合，立即出现凝集者为阳性。
5.2 若有自凝现象改用生理盐水稀释的血清再做凝集。
与O1群霍乱弧菌血清凝集者即可定为霍乱弧菌，然后再进一步对霍乱弧菌分型。
6.结果判断
阴性：试验一侧及对照一侧均为混浊。
阳性：对照一侧均为混浊，试验一侧明显凝集。
自凝：试验一侧及对照一侧
凝集。
7.注意事项
试验时应同时用生理盐水作对照，以防止出现假阳性。
8.临床意义
主要用于霍乱弧菌的鉴定。
霍乱等感染性腹泻实验室检测技术
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3. 肠毒素性大肠杆菌 (ETEC):
ETEC 的生化反应与一般大肠杆菌相同。本 菌的特点是产生不耐热的肠毒素 (LT) 和耐热的 肠毒素(ST), 有些菌株两种肠毒素均产生,有些 菌株只产生其中的一种。最常见的0血清型有： 06、O8、O15、O20、O25、O27、O63、O78、O80、 O114、O115、O128ac、O148、O153和O167。
这是中国预防医学科学院的流行病学微生物 学研究所发现的一种新的致泻性大肠杆菌 。
其主要特点是 :即产生志贺样毒素又对上皮细 胞有侵袭力,与肠侵袭性大肠杆菌的 INV 探针、志 贺样毒素1或志贺样毒素2的探针杂交 ,它也属于产 VT毒素的大肠杆菌。
ESIEC 和0157:H7大肠杆菌的共同点都是产生 志贺样毒素(VT 毒素 ),不同的地方是0157:H7 大 肠杆菌的粘附性菌毛具有一定致病作用 ,而ESIEC 具有侵袭力。
霍乱弧菌与有关细菌的鉴别见手册P54-57。
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噬菌体分型：
根据5株国内分离的弧菌噬菌体（VP1-VP5） 将埃尔托型霍乱弧菌分成32个噬菌体型。对5株 噬菌体全敏感的噬菌体1型菌株是最常见的流行 株，但并非所有噬菌体1型菌株均为流行株。
2型主要是1型的粗糙型，3-6型也属流行株 范畴。7型以后属非流行株，对5株噬菌体全抵抗 的是32型。非流行株仅引起散发病例，是一些疫 区和非疫区自然水体中的主要菌型。
时间
省份
流行弧菌分型
70年代 83年以前
80年代 84年以后
山东
散发地区：非流行株 暴发点：小川1b和1d
稻叶1d
小川1b为主,稻叶1d次之
90年-92年
霍乱弧菌实验室检测
霍乱弧菌的实验室检测
目的:提高检出率,减少漏检以及误判的发生 手段:
检测人员是否有足够的责任心? 检测试剂准备是否齐全且符合要求? 是否严格按照检测流程进行操作?
霍乱概述
▪ 什么是霍乱?
霍乱是由01群和0139群霍乱弧菌（V．cholerae）
引起的急性肠道传染病，发病急、传播速度快、波 及范围广、危害严重的甲类传染病。
霍乱弧菌
O1群 非O1群
古典生物型 埃尔托生物型
小川型 Ogawa (AB) 稻叶型 Inaba (AC) 彦岛型 Hikojim (ABC)
霍乱病原菌
O139群（Bengal）
O2-O200群
腹泻病原菌
▪ 病原体
O1群，O139群霍乱弧菌
▪ 发病特征：
剧烈腹泻、呕吐、严重脱水时致酸中毒、循环衰竭而致死亡 不治疗或医疗很差的条件下病死率可达到20－50％（重症病人达70－ 100％）
菌落鉴定
▪ 染色镜检
革兰染色阴性的短杆菌
▪ 血清凝集试验：
➢分别使用O1群，O139群霍乱血清进行凝集试验，同时使用生理盐水进行 对照凝集，以排除与生理盐水发生凝集的自凝菌。 ➢生理盐水不凝集，O1群血清明显凝集的菌落，进一步使用稻叶型和小川型 血清进行凝集试验，判定型别：稻叶型血清凝集而小川型血清不凝集的菌落 为稻叶型，小川型血清凝集而稻叶型血清不凝集的菌落为小川型，如稻叶型 血清和小川型血清均出现凝集的时候，要注意鉴别是否为彦岛型，需进行试 管凝集试验且两者的凝集效价均超过一半以上才能判定为彦岛型，因为某些 小川型菌落自身会带有少量的C抗原而出现与稻叶型血清发生弱凝集，因此 如小川型血清凝集较稻叶型血清凝集有明显优势时应维持小川型的判定。 ➢生理盐水不凝集，O139群血清明显凝集的菌落，一般为O139群，但其与 O22群及O155群甚至一些非霍乱弧菌会出现交叉凝集，由上级实验室进行 进一步确认。
传染病检测SOP工作手册-霍乱弧菌[2]
![传染病检测SOP工作手册-霍乱弧菌[2]](https://img.taocdn.com/s3/m/eecf24f0f90f76c661371a18.png)
霍乱弧菌实验室检测SOP手册1.标本的采集和送检1.1.标本的采集：采集标本的好坏，对检验工作的质量影响很大。
为尽快获得细检查结果，应在发病早期、在服用抗菌药物之前尽快采集标本和及时送到检验室。
标本以病人大便为主。
采便方法用灭菌的棉拭采集排出的新鲜大便，亦可用直肠棉拭或用采便管由肛门插入3㎝～5㎝采集。
一般要求水样便采集1ml～3ml，固形便采取蚕豆大小粪量。
有时病人的呕吐物、沾染大便的衣物和尸体的肠内容物亦可作为检材。
带菌者的大便可用棉拭或直肠棉拭采取。
1.2.标本的送检：采取的标本应立即接种培养基，典型病人的水样便含有大量病菌（106/ml～109/ml），可直接做分离培养并同时增菌培养。
不需做直接分离的均可接种碱性蛋白胨水增菌。
并立即送检验室。
1.3.标本运送途中较远，也可将标本放入文腊氏保存液或卡里—布莱尔运送培养基。
标本与保存液的比例为8ml～10ml保存液加1ml～3ml水样便或蚕豆大的固形便。
也可用厚吸墨纸条吸饱水样便放入小塑料袋内封好送检。
送检标本时，必须认真填写送检单，标本必须妥善包装，专人送检，并防止污染，注意安全，送检箱用后要严密消毒。
2.检验方法2.1.培养方法2.1.1.增菌培养：所有标本都应经过增菌，尤其是恢复期病人、带菌者或用过抗生素的病人标本，需增菌后再分离。
碱胨水接种后放37℃6～8小时，夏日可将运送时间计算在内。
保存液内的标本取1ml种入碱胨水中。
培养后慢慢地从碱胨水生长的菌膜下，取一接种环表层培养物接种于4号或庆大霉素琼脂平板。
标本含菌少时，可实行二次增菌。
取第一次碱胨水增菌后的表层液0.1～0.2ml，接种于另一碱胨水中，37℃6～8小时再做分离。
2.1.2.分离培养：急性典型病人标本在增菌的同时直接做分离培养，这样既可缩短检出的时间，还可避免标本中如有不凝集弧菌经增菌后大量繁殖，影响霍乱弧菌的分离。
其它标本均应增菌后再做分离培养。
当前的习惯多为碱性蛋白胨水增菌，再用强选择性培养基分离，37℃12～16小时长出的菌落，可供做玻片凝集用。
霍乱诊断标准及处理原则
传染病相关知识培训—————霍乱诊断标准及处理原则主讲人：参会人员：会议地址：会议时间：会议内容：霍乱诊断标准及处理原则霍乱是由01群和0139群霍乱弧菌引起的急性肠道传染病，是发病急、传播快、波及面广、危害严重的甲类传染病，也是当今三种国际检疫传染病中最严重的一种。
根据《中华人民共和国传染病防治法》和《中华人民共和国传染病防治法实施办法》的规定，制定本病的诊断标准及处理原则。
1 主题内容与适用范围：本标准规定了霍乱的诊断标准，对病人、疫点、疫区的处理原则等，并推荐了对霍乱的病原学检查、血清免疫学检查、霍乱弧菌的鉴定和分型方法以及对病人的补液疗法等。
本标准适用于全国各级卫生防疫、医疗保健机构对由01群和0139群霍乱弧菌引起的霍乱的诊断和处理。
2 诊断原则：根据夏秋季节霍乱流行期间的疫区内，凡有腹泻，伴有呕吐，从粪便或吐泻物检出01群或0139群霍乱弧菌或血清检查对01群或0139群霍乱弧菌的抗体有明显升高者予以诊断。
病人的临床症状可由轻度到重度不等。
3 诊断标准：3.1 疑似霍乱诊断标准：a.凡有典型临床症状，如剧烈腹泻，水样便（黄水样、清水样、米泔样或血水样），伴有呕吐，迅速出现严重脱水，循环衰竭及肌肉痉挛（特别是腓肠肌）的首发病例，在病原学检查尚未肯定前。
b.霍乱流行期间有明确接触史（如同餐、同住或护理者等），并发生泻吐症状，而无其他原因可查者。
具有上述项目之一者诊断为疑似霍乱。
3.2 确定诊断标准：a. 凡有腹泻症状，粪便培养01群或0139群霍乱弧菌阳性；b. 霍乱流行期间的疫区内，凡有霍乱典型症状（见3.1a），粪便培养01群和0139群霍乱弧菌阴性，但无其他原因可查者；c. 在流行期间的疫区内有腹泻症状，作双份血清抗体效价测定，如血清凝集试验呈4倍以上或杀弧菌抗体测定呈8倍以上增长者；d. 在疫源检查中，首次粪便培养检出01群或0139群霍乱弧菌前后各5天内有腹泻症状者。
临床诊断：具备b.确诊病例：具备a或c或d。
霍乱诊断标准及处理原则
霍乱诊断标准及防疫措施霍乱就是由01群与0139群霍乱弧菌引起得急性肠道传染病就是发病急、传播快、波及面广、危害严重得甲类传染病。
１诊断原则根据夏秋季节霍乱流行期间得疫区内凡有腹泻伴有呕吐从粪便或吐泻物检出0１群或０13９群霍乱弧菌或血清检查对0１群或0139群霍乱弧菌得抗体有明显升高者予以诊断。
病人得临床症状可由轻度到重度不等。
2诊断标准2。
1疑似霍乱诊断标准a。
凡有典型临床症状如剧烈腹泻水样便(黄水样、清水样、米泔样或血水样)伴有呕吐迅速出现严重脱水循环衰竭及肌肉痉挛(特别就是腓肠肌)得首发病例在病原学检查尚未肯定前。
b.霍乱流行期间有明确接触史(如同餐、同住或护理者等)并发生泻吐症状而无其她原因可查者。
具有上述项目之一者诊断为疑似霍乱。
2。
2确定诊断标准ａ.凡有腹泻症状粪便培养01群或0１3９群霍乱弧菌阳性b。
霍乱流行期间得疫区内凡有霍乱典型症状(见3。
1a)粪便培养０１群与0139群霍乱弧菌阴性但无其她原因可查者ｃ.在流行期间得疫区内有腹泻症状作双份血清抗体效价测定如血清凝集试验呈4倍以上或杀弧菌抗体测定呈8倍以上增长者d.在疫源检查中首次粪便培养检出01群或0139群霍乱弧菌前后各5天内有腹泻症状者。
临床诊断具备b、确诊病例具备a或ｃ或d。
3临床分型标准３、1轻型仅有腹泻症状极少伴呕吐大便一天少于1０次大便性状为软便、稀便或黄水样便个别患者粪便带粘液或血皮肤弹性正常或略差大多数患者能照常进食及起床活动脉搏、血压、尿量均正常。
３.2中型腹泻次数一日1020次精神表现淡漠有音哑皮肤干而缺乏弹性眼窝下陷有肌肉痉挛,脉搏细速、血压(收缩压)儿童9、33kPa(７0ｍmHg)成人1２—9.33ｋPａ(90-70mmＨg)尿量每日400mL。
3。
3重型腹泻次数一日２0次以上极度烦躁甚至昏迷皮肤弹性消失眼窝深凹明显发绀严重肌肉痉挛脉搏微弱而速甚或无脉血压(收缩压)儿童６.67kPa(５０ｍmHg)成人9.33kＰａ(７0mmＨｇ)或测不到等循环衰竭得表现尿量每日5０mL或无尿,脱水程度儿童相当于体重1０以上成人8以上。
霍乱弧菌实验室检验技术
一、霍乱概述 二、霍乱病原学 三、霍乱弧菌常规检验 四、霍乱弧菌的快速诊断 五、霍乱弧菌的噬菌体-生物分型 六、霍乱菌株的管理、保存与上送
2024/1/3
一、霍乱概述
霍乱是由01群和0139群霍乱弧菌 （V．cholerae）引起的急性肠道传染 病，发病急、传播速度快、波及范 围广、危害严重的甲类传染病。
2024/1/3
必须注意同一样品中O1、O139群霍乱弧 菌可能同时存在，有必要对所有选出的 菌落都进行凝集试验。
提倡所选菌落先经纯培养后再作相关鉴 定，除非情况特殊，一般不提倡直接使 用疑似菌落作玻片凝集。尤其对于TCBS.
如从分离培养基上直接挑取单个菌落进 行血清凝集试验，可能会有假阴性或假 阳性的出现，应谨慎判断结果，特别是 外环境样品。
挑取可疑菌落作玻片凝集
– 与O1群多价和单价血清作玻片凝集反应 – 与O139群抗血清做凝集反应
2024/1/3
血清鉴定：自分离培养基上挑取可疑菌 落与01群霍乱弧菌多价/单价诊断血清及 0139群霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集试 验。玻片凝集用血清的效价一般应为 1∶40～1∶50。如可疑菌落在血清中很 快(一般在10s内)出现肉眼可见的明显凝 集，在生理盐水中不凝集者判为阳性。 可疑菌落较多时，应挑选5个以上的菌落 逐个进行玻片凝集检查，必要时，取原 划线菌落边缘透明部分再做玻片凝集， 均为阴性时方可报告未检出01群及0139 群霍乱弧菌。对首发病例菌株需送上一 级实验室做进一步鉴定或复查。
强调在选择培养上发现疑似菌后，首先 考虑进行01/0139群霍乱弧菌的玻片凝集 试验。必须从平板上各挑取5个以上的 （少于5个的全部挑取）疑似菌落进行 01/0139群霍乱弧菌玻片凝集试验。
不同类型的平板上，菌落形态有不同的 特征-----选择你最有把握的。
霍乱弧菌检测方法 文档
霍乱弧菌的检测霍乱弧菌相关知识：稻叶型（A、C）古典型小川型（A、B、C少量）O1群霍乱弧菌：彦岛型（A、B、C）稻叶型（A、C）艾尔托型小川型（A、B、C少量）彦岛型（A、B、C）实验室准备：1.培养基：碱性蛋白胨水、TCBS、4号或庆大霉素琼脂、营养平板、半固体菌种保存管。
2.试剂：拉丝实验用试剂（0.5%去氧胆酸钠水溶液）、氧化酶试剂（1%盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸对氨基四甲基苯胺水溶液。
3.诊断血清：O1群霍乱诊断血清、稻叶型霍乱血清、小川型霍乱血清、O139群霍乱血清。
4.快诊试剂：O1群霍乱胶体金标记快诊卡、O139群霍乱胶体金标记快诊卡。
霍乱弧菌检验流程图：标本37度6-8小时TCBS、4号或庆大霉素琼脂小时胶体金快诊卡/制动等试验血清学凝集试验氧化酶实验拉丝实验O/129敏感试验初步报告、菌种保存一、采样（一）水样便采取1-2毫升，成形便采取指甲大小的粪量。
病人呕吐物、沾染粪便的衣物、尸体的肠腔和口腔内容物亦可做为检材；（二）外坏境样本可采取病人的污染衣物、剩饭菜、可疑食品、抹布、污水、坑塘水、井水、公厕粪便、苍蝇等；（三）按1：10比例置入碱性蛋白胨水增菌液中，迅速送往实验室。
二、增菌、培养（一）所有粪便标本都应经过增菌，尤其是恢复期病人、带菌者或用过抗菌药物的病人标本含菌量少，单靠直接分离不易检出。
需经碱胨水37度增菌6-8小时后分离(夏日可将运送时间计算在内)；（二）标本含菌量少时，为提高检出率可实行2次增菌，取第一次碱胨水增菌后的培养物表层液0.1-0.2毫升，接种于8-10毫升的碱胨水中，37度培养6-8小时后再做分离。
（三）霍乱弧菌好氧，易形成菌膜，故在取出增菌管时动作要轻，接种环于菌膜下取一满环，划线接种于TCBS或4号琼脂平板37℃10~14h孵育培养。
三、快速诊断（一）、直接镜检：为争取最快速度作出诊断，采取病人“米泔水样”大便或呕吐物，悬滴法镜检（最好用暗视野），可见具有流星状动力的细菌。
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邻单胞菌属
S
R
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编写者：
审核者：
批准者：
时 间：2017/6/9
时 间：2017/12/30
时 间：2017/1/1
霍乱弧菌检验标准操作规范
1.概述
霍乱弧菌可分为古典生物型和El - Tor生物型；根据菌体抗原（即O抗原）又可分为155个血清群，其中O1血清群和O139血清群能引起霍乱的发病和流行，是霍乱的病原菌。
2.标本类型
粪便标本。
3.鉴定
3.1形态与染色：革兰阴性，菌体弯曲呈弧形或逗点状。
3.2培养特性：在TCBS琼脂平板上呈黄色的菌落。在双氢链霉素洗衣粉琼脂平板上形成
3.4.2与气单胞芮属、邻单胞菌属的鉴别见表9 - 29。
3.4.3确诊O1群霍乱弧菌必须具备的条件：涂片为革兰阴性弧菌或杆菌；TCBS等选择培
养基上典型的菌落特征；动力试验阳性，符合生化特性；()1群霍乱弧菌诊断血清凝集试验阳性。
3.5操作步骡
3.5.1在碱性蛋白胨水(pH 8.6)中，37℃培养6～8 h后转种于TCBS平板。
5．质量控制
见《质量管理》。
6.结果解释
初次分离时，采用pH为8.6的碱性蛋白胨水增菌6--8 h，液体呈均匀混浊，表面形成菌膜。
根据O1群菌其O抗原中的A个血清型；还可根据其产毒基因的有无和对人的侵袭力，划分为流行株和非流行株，流行株才是霍乱真正的病原菌。部分菌株不被O1群霍乱弧菌多价血清所凝集，称之为非O1群霍乱弧菌，以往也称不凝集弧菌或不凝集霍乱弧菌。
7.临床意义
霍乱弧菌是烈性肠道传染病霍乱的病原菌，该菌能产生霍乱肠毒素，作用于小肠黏膜，引起
液大量分泌．表现为严重腹泻（米泔水样便）、呕吐、脱水和酸中毒，病死率很高。
8．鉴定流程
试验
( )1129敏感试验(15¨t/g)
氨’声西林(10 t/g)
黏丝试验
肌醇
精氨酸
霍乱弧菌拟态弧菌
S
S
+
气单胞菌属
R
R
3.5.2玻片凝集试验：从TCBS琼脂平板或双氢链霉素洗衣粉琼脂平板上挑取可疑菌落，与
霍乱多价诊断血清做玻片凝集试验，以生理盐水为阴性对照，诊断血清凝集、生理盐水不凝者为阳性。做初步鉴定试验后，将此高度怀疑菌送疾病预防控制中心(CDC)做最后鉴定。
4.药敏
参见《抗菌药物敏感试验标准操作规程》及CLSI MlOO - S24最新版本文件。
中心晕灰褐色的菌落。
3.3生化反应：氧化酶试验阳性；发酵葡萄糖、蔗糖、甘露醇，不发酵乳糖和L-阿拉伯糖；动力、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、霍乱红、硝酸盐还原和黏丝试验均阳性；精氨酸双水解酶试验阴性。
3.4鉴别要点
3.4.1本菌特征：革兰阴性弧菌或杆菌，动力试验阳性，()1群霍乱弧菌诊断血清凝集试验
阳性。