PCR设计引物时酶切位点的保护
酶切位点保护碱基
0
0
0
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0
50
75
>90
Pst I
GCTGCAGC
0
0
TGCACTGCAGTGCA
10
10
AACTGCAGAACCAATGCATTGG
>90
>90
AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA
>90
>90
CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT
0
0
Pvu I
CCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA
10
>90
10
>90
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50
0
50
Sph I
GGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT
0
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Stu I
AAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT
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>90
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Xba I
CTCTAGAG GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA CTAGTCTAGACTAG
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>90 >90 >90
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0 >90 >90
0 0 >90
10
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0 0 >90 50
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>90 >90 >90
Hind III
引物设计原则及酶切位点选择和设计
引物设计原则及酶切位点选择和设计：最初的时候，由于害怕设计酶切位点最后且不开，所以经常采用最通用的方法，用[整理]载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载体来T连入质粒中的重要目的酶切，所以感到还是直接扩增好一点。
但这就需要你仔细设计引物。
扩增出靶基因的时候在核就是进行酶切和连接，当然首先就是在想要合成或者是进行PCR可以在质粒的图谱说明书上酸的两端接入酶切位点，酶切位点是与你的质粒的特点相关的，找取相应的位点，进行设计。
（一）设计引物前应做的准备工作：准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用（二）设计引物所要考虑的问题往往导致两个，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，两个位点应是载体上的，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。
只能切一个，酶都切不好。
因此，紧挨在一起，还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如promega的说明书上说，最好隔四个。
我看AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。
两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。
最好使用酶切效率高的。
的酶。
最好使用双酶切有共同buffer最好使用自己实验室有的酶，这样可，ecor1等），最好使用较常用的酶（如hind3，bamh1以省钱。
的问题，很多的战友都有疑惑。
其实园子里有很多的解释了。
的计算，关于TmTm大家可以理解，双链溶解所需的温度。
即是DNA叫溶解温度（melting temperature, Tm），Tm因此，的溶解是没有作用的。
而不互补的区域对DNA 这个温度是由互补的DNA区域决定的，（除时，只计算互补的区域Tm才有贡献。
计算Tm只有和模板互补的区域对对于引物的Tm，过低，是因为他们误把保护碱。
不少战友设计的引物都Tm 非你的酶切位点也与模板互补）反应的诸多困难。
酶切位点保护碱基
25
90
AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA
25
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Nsi I
TGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT
10
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>90
>90
Pac I
TTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG
0
0
0
25
0
>90
Pme I
GTTTAAAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG
CATCGATG GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG
GGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG
GGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA
CAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG
切割率%
2 hr
20 hr
0
0
10
25
0
10
Sac I Sac II
CGAGCTCG
GCCGCGGC TCCCCGCGGGGA
10
10
0
0
50
>90
Sal I
GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC
0
0
GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG
10
50
ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCG
10
75
GAA
Sca I Sma I Spe I Sph I Stu I Xba I Xho I Xma I
酶切位点保护性碱基的添加原则
PCR 设计引物时酶切位点的保护
寡核苷酸序列
GGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG
CACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG
0
0
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>90
>90
>90
Mlu I
GACGCGTC CGACGCGTCG
0
0
25
50
Nco I
CCCATGGG CATGCCATGGCATG
0
0
50
75
Nde I
CCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC
GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA
CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA
CGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG
CAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC
GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA
上相应的碱基（黑色），相同如果要在 3‘端加保护碱基，就在酶切位点识 别碱基序列（红色）的 3’端加上相应的碱基（黑色）。 2．切割率：正确识别并酶切的效率 3。加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基。
>90
10
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0
50
0
50
Sph I
酶切位点保护碱基
10
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10
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0
50
Sph I
GGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT
0
0
0
25
10
50
Stu I
AAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT
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>90
>90
>90
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Xba I Xho I Xma I
CTCTAGAG GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA CTAGTCTAGACTAG
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EcoR I
GGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG
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0
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75
设计引物如何设计酶切位点
经常有战友对一些常见问题在丁香园反复问答了很多遍，所以希望园子中一些战友，特别是低分与0分战友，能将好的帖子归纳总结了一下，并结合自己的经验整理，一方面这是个学习提高的过程，另一方面也能帮助大家解决这方面的问题。
同时如有不当或不完善的地方，希望各位战友不断补充，争取有朝一日我们能把园子里战友的经验系统整理，给大家以帮助。
我先把设计引物如何设计酶切位点这方面的帖子整理一下，因为昨天一下子看到三个相似问题。
原帖如下：我想向你求教一个问题,假如说我想把胰岛素基因和腺病毒载体连接起来,如何确定设计目的基因PCR时的引物呢?和相应的限制性核酸内切酶呢?谢谢老师能给予讲解,谢谢[整理]：最初的时候，由于害怕设计酶切位点最后切不开，所以经常采用最通用的方法，用T载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载体来酶切，所以感到还是直接扩增好一点。
但这就需要你仔细设计引物。
连入质粒中的重要目的就是进行酶切和连接，当然首先就是在想要合成或者是进行PCR扩增出靶基因的时候在核酸的两端接入酶切位点，酶切位点是与你的质粒的特点相关的，可以在质粒的图谱说明书上找取相应的位点，进行设计。
（一）设计引物前应做的准备工作：准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用（二）设计引物所要考虑的问题两个位点应是载体上的，，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，往往导致两个酶都切不好。
因此，紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。
我看promega的说明书上说，最好隔四个。
还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。
两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。
最好使用酶切效率高的。
最好使用双酶切有共同buffer的酶。
酶切位点保护碱基
CCTCGAGG CCCTCGAGGG CCGCTCGAGCGG
。3
0
0
10
10
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>90
>90
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酶 Acc I Afl III Asc I Ava I BamH I Bgl II BssH II BstE II BstX I Cla I
EcoR I
。
PCR 设计引物时酶切位点的保护
寡核苷酸序列
GGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG
CACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG
。5
25
>90
10
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>90
>90
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。2
Pst I
Pvu I Sac I Sac II Sal I Sca I Sma I
Spe I
Sph I Stu I Xba I
Xho I
。
GCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT
酶切位点保护碱基
TGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT
TTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG
GAGTACTC AAAAGTACTTTT
CCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA
GACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG
GGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT
AAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT
10
25
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25
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10
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Pst I
Pvu I Sac I Sac II Sal I Sca I Sma I
Spe I
Sph I Stu I Xba I
Xho I
酵母培养实验
GCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT
酶 Acc I Afl III Asc I Ava I BamH I Bgl II BssH II BstE II BstX I Cla I
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注释：
1．如果要加在序列的5‘端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的5’端加上相应的碱基（黑色），相同如果要在3‘端加保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的3’端加上相应的碱基（黑色）。
2．切割率：正确识别并酶切的效率
3。
加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基。
为什么要添加保护碱基？
在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。
该如何添加保护碱基？
添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。
如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠
近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。
取1?g已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mMDTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE（7M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。
若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。