引物设计原则(含Realtime引物)
反转录引物的选择与Real-Time PCR引物设计的要求
反转录引物的选择与Real-Time PCR引物设计的要求1）随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。
用此种方法时，体系中所有RNA 分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。
通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。
2）Oligo(dT)：是一种仅对mRNA特异的方法。
因绝大多数真核细胞mRNA具有3'端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。
由于Poly(A+)RNA只占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。
特别适合检测多个基因的表达，这样可以节约反转录的试剂，cDNA可以多次使用，可用于检测稀有基因是否表达、从极少量细胞中定量检测特定mRNA的表达水平。
3）特异性引物：最特异的反转录方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA3’端最靠近的配对引物起始。
用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。
做Real Time PCR时，用于SYBR Green I/Eva Green 法时的一对引物与一般PCR的引物，在引物设计上所要求的参数是不同的。
引物设计的要求：①Tm=55-65℃②GC=30-80%③PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-300bp之间都可。
④引物的退火温度要高，一般要在60℃以上。
要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。
而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。
至于设计软件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMER EXPRESS都应该可以的。
引物的设计原则
引物的设计原则
引物是在PCR反应中起到扩增目标DNA序列作用的重要组成部分。
引物的设计质量直接影响PCR扩增的效率和准确性。
下面是引物设计的几个原则：
1. 引物长度：一般来说，引物长度应该在18-24bp之间。
过短的引物会导致特异性不足，容易出现非特异性扩增产物；过长的引物则会降低PCR反应的效率。
2. 引物Tm值：Tm值是指引物与模板DNA杂交时形成稳定双链结构所需要的温度。
合适的Tm值可以保证引物在PCR反应中充分杂交，从而提高扩增效率和特异性。
一般来说，引物Tm值应该在55-65℃之间。
3. 特异性：为了避免与非目标DNA序列发生杂交，引物设计时必须考虑其特异性。
可以通过比对目标DNA序列和非目标DNA序列来选择具有区别性的区域进行设计。
4. 末端修饰：在某些情况下，末端修饰可以提高PCR反应的效率和特异性。
例如，在5'端加上磷酸基团或者3'端加上羟基基团可以提高引物与模板DNA的亲和力，从而提高扩增效率。
5. 避免引物间的二聚体：引物之间的二聚体会影响PCR反应的特异性和效率。
因此，在设计引物时需要避免引物之间形成稳定的二聚体。
6. 引物浓度：在PCR反应中，引物浓度也会影响扩增效率和特异性。
一般来说，合适的引物浓度应该在0.1-1μM之间。
以上是引物设计的几个原则，通过合理地设计引物可以提高PCR反应的效率和特异性。
引物设计基本原则
引物设计基本原则引物设计是指在分子生物学研究中，用于扩增目标DNA序列的两个引物的设计。
好的引物设计是成功进行PCR反应的关键之一、下面是引物设计的基本原则：1.引物长度：引物长度一般在18-24个碱基对左右，太短容易引起非特异性扩增，太长则可能导致引物无法与目标序列完全匹配。
2.引物的GC含量：引物的GC含量一般在40-60%之间，太低则可能导致引物无法与目标序列形成稳定的双链结构，太高则可能导致引物与非特异性目标序列发生杂交。
3.引物的熔解温度(Tm)：引物的Tm是指引物与目标序列在溶液中解链的温度。
引物设计时应保证所设计的两个引物的Tm值相似，一般相差不超过2-3摄氏度。
这样可以保证引物在PCR反应中同时结合于目标序列。
4.引物的特异性：引物设计时必须确保引物与目标序列的特异性，即引物在基因组中只与目标序列互补匹配，不与其他非目标序列发生杂交。
为了提高引物的特异性，可以使用生物信息学工具如BLAST进行引物的序列比对和分析。
5.引物的结构：引物设计时应注意引物的序列结构。
首先要避免引物的自身二级结构，特别是避免引物的自身二聚体形成，可以使用在线工具进行预测和评估。
另外，引物的末端最好是链末端，避免引物形成环状结构。
6.引物的位点选择：在设计引物时，应选择位于目标序列上的独特位点作为引物扩增的位点。
这样可以确保引物扩增出的产物是目标序列，而不是其他类似的序列。
7.引物的序列设计：引物设计时应避免序列中出现连续的重复碱基序列，避免过多的GC或AT连续存在。
此外，引物设计时还可以考虑在引物的序列中加入特定的限制性内切酶位点，方便后续分子克隆和分析。
总结起来，引物设计的基本原则包括引物长度、GC含量、Tm值、特异性、结构、位点选择和序列设计。
良好的引物设计是成功进行PCR反应的前提之一，能够提高扩增效率和特异性，并且避免产生非特异性扩增产物。
realtimePCRTaqman探针设计、实时多重PCR探针的选择、引物的设计及评价
real-time-PCRTaqman探针设计、实时多重PCR探针的选择、引物的设计及评价————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：real time PCRTaqman探针设计、实时多重PCR探针的选择、引物的设计及评价一、实时荧光Taqman 探针设计总原则：探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。
即real-time PCR的扩增片段是50bp----150bp。
当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的片段是保守的。
在设计探针和引物时，要同时考虑在两条链上设计引物与探针。
但要注意的是：在那条链上设计探针时，就应靠近在同一条链上设计的引物(即上游引物)。
这样，可保证在将来扩增时，即便没有完全扩增，也有荧光信号报告出来。
两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基，但也可以重叠。
若在原序列中找不到合适的探针与引物(1主要是探针和上游引物的距离太远，而离下游引物的距离却较近时；2突变位点要求在探针的5’ 端也能检测到荧光信号，但却是在3’端)，可在互补的序列中设计引物与探针。
另real-time PCR中的探针和引物的Tm值，均要高于平常PCR的引物和杂交的探针的Tm值。
二、探针的设计探针设计的基本原则：1．保守：探针要绝对的保守，有时分型就单独依靠探针来决定。
理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。
若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段。
且这个不同的碱基最好在探针的中间，对探针与目的片段的杂交影响不大，不相同的碱基最好不要在两端，因为两端不利于探针的杂交。
且最好为A或T，而不能为G或A，因为A、T为双键，而G、A为三键。
2．探针长度Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，最好为70℃，确保探针的Tm 值要比引物的Tm值高出10℃，这样可保证探针在煺火时先于引物与目的片段结合。
引物设计原则是什么？
引物设计原则是什么？
1、引物长度一般在15-30bp。
常用的为18-27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应；
2、引物GC含量一般为40%-60%， 45-55%为宜，GC含量过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；
3、引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右。
至少要在55-80℃之间。
4、引物3’端的碱基一般不用A。
A在错误引发位点的引发效率相对比较高。
引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，或者引物3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。
5、碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。
6、尽量在Exon junction上设计引物，限制基因组DNA扩增。
7、使用BLAST检索，确认引物特异性。
引物设计原则(必看)
mi引物设计原则1、引物得长度一般为15-30 bp,常用得就是18-27 bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA聚合酶进行反应。
2、引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其就是3’端相似性较高得序列,否则容易导致错配。
引物3’端出现3个以上得连续碱基,如GGG或CCC,也会使错误引发机率增加。
3、引物3’端得末位碱基对Taq酶得DNA合成效率有较大得影响。
不同得末位碱基在错配位置导致不同得扩增效率,末位碱基为A得错配效率明显高于其她3个碱基,因此应当避免在引物得3’端使用碱基A。
另外,引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。
5’端序列对PCR影响不太大,因此常用来引进修饰位点或标记物。
4、引物序列得GC含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物得GC含量不能相差太大。
5、引物所对应模板位置序列得Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。
Tm值得计算有多种方法,如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T),在Oligo软件中使用得就是最邻近法(the nearest neighbor method)。
6、ΔG值就是指DNA双链形成所需得自由能,该值反映了双链结构内部碱基对得相对稳定性。
应当选用3’端ΔG值较低(绝对值不超过9),而5’端与中间ΔG值相对较高得引物。
引物得3’端得ΔG值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。
7、引物二聚体及发夹结构得能值过高(超过4、5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
8、对引物得修饰一般就是在5’端增加酶切位点,应根据下一步实验中要插入PCR产物得载体得相应序列而确定。
引物序列应该都就是写成5-3方向得,Tm之间得差异最好控制在1度之内,另外我觉得扩增长度大一些比较好,500bp左右。
要设计引物首先要找到DNA序列得保守区。
同时应预测将要扩增得片段单链就是否形成二级结构。
引物的设计原则
引物的设计原则引言引物在分子生物学领域中扮演着重要角色，它们被广泛应用于聚合酶链反应（PCR）、DNA测序、基因克隆等实验中。
引物的设计是实验的关键步骤之一，它直接影响实验结果的准确性和可靠性。
因此，了解引物的设计原则对于科学家在实验设计中至关重要。
本文将全面、详细、完整地探讨引物的设计原则。
引物的基本概念引物是一段寡聚核苷酸序列，通常包含18-30个碱基对。
引物通过与待扩增的目标序列的互补配对，引导DNA的复制和扩增。
引物由两个部分组成，分别是引物的5’端和3’端。
引物的5’端包含可变区域，这一区域的序列决定了引物的特异性。
引物的3’端通常含有一定数目的腺嘌呤（A）碱基，以提供DNA聚合酶的模板。
引物的设计原则引物的设计需要遵循一些基本的原则，才能确保引物具有高度的特异性和扩增效率。
下面将详细介绍引物设计的原则和注意事项。
特异性引物的特异性是引物设计中最重要的考虑因素之一。
确保引物只与待扩增的目标序列互补配对，而不与其他非目标序列配对，可以通过以下几个方法实现：1.引物序列的序列比对：在设计引物之前，进行目标序列与数据库中已知序列的比对，确保引物序列不与其他非目标序列相似。
2.引物的GC含量：GC含量较高的引物通常具有更高的特异性。
然而，过高的GC含量可能导致引物的自身结合和非特异性扩增。
3.避免重复序列：引物中不应含有重复的序列，以避免非特异性扩增和产生假阳性结果。
避免二聚体形成引物在反应中可能会形成二聚体，即引物间的互相结合。
二聚体的形成会降低引物的扩增效率。
为了避免二聚体形成，需要注意以下几点：1.引物的相互作用力（Tm）：引物的Tm应该相似，通常在2°C的范围内。
这有助于避免引物之间的不稳定配对和二聚体形成。
2.引物的序列：引物设计时，需要避免引物序列中包含有重复序列、自身配对区和富含GC或AT的片段，因为这些序列容易形成二聚体。
引物长度引物的长度是影响扩增效率和特异性的重要因素之一。
real-time pcr引物设计原理
real-time pcr引物设计原理
实时聚合酶链式反应（Real-time PCR）引物设计原理主要包括以下几个方面：
1. 引物长度和碱基序列选择：
引物通常由20-25个碱基组成，并且应尽量避免区域内存在重复序列或剪切位点。
引物的碱基序列应根据靶标基因的DNA 序列进行设计，确保与目标DNA序列特异性结合。
2. GC含量和熔解温度选择：
引物的GC含量对于引物的特异性和熔解温度有重要影响。
通常，引物的GC含量应在40%-60%之间，熔解温度通常选择在55°C-65°C范围内。
3. 引物互补性检查：
引物设计时需要进行引物间以及引物与非特异位点之间的互补性检查，以确保引物之间不会形成二聚体或异聚体，以及与非特异性位点不会有结合。
4. 引物长度和位置：
引物长度的选择会直接影响PCR产物片段的大小，在设计引物时需要注意引物的长度不宜过长，以免影响PCR效果。
此外，引物的位置应选择在目标序列的保守区域内，以确保引物能够与多个目标DNA序列结合。
5. 引物配对：
在引物设计中，需要设计两个互补的引物分别结合目标序列的
两个互补的片段。
这两个引物的长度和熔解温度应尽量相近，以确保它们具有相同的扩增效率和特异性。
综上所述，实时PCR引物设计应综合考虑引物长度和碱基序列选择、GC含量和熔解温度选择、引物互补性检查、引物长度和位置选择以及引物配对等因素，以确保引物具有良好的特异性和扩增效率。
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1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。
在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。
2.引物长度一般在15~30碱基之间。
引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。
3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。
GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。
有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。
若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm 值最好接近72℃以使复性条件最佳。
4.引物3′端要避开密码子的第3位。
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
5.引物3′端不能选择A，最好选择T。
引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C 错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。
6. 碱基要随机分布。
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。
降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。
这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
引物自身不能有连续4个碱基的互补。
两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。
引物之间不能有连续4个碱基的互补。
引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。
否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。
8. 引物5′ 端和中间△G值应该相对较高，而3′ 端△G值较低。
△G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G 值越大，则双链越稳定。
应当选用5′ 端和中间△G值相对较高，而3′ 端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。
引物3′ 端的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。
（不同位置的△G值可以用Oligo 6软件进行分析）
9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。
引物的5′ 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。
因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。
引物5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。
引物的延伸是从3′ 端开始的，不能进行任何修饰。
3′ 端也不能有形成任何二级结构可能。
10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。
某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。
用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。
实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6l kJ/mol时，扩增往往不能成功。
若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
11. 引物应具有特异性。
引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。
如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。
值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。
有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。
在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。
做Real Time时,用于SYBR Green I法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。
引物设计的要求：
1) 避免重复碱基，尤其是G.
2) Tm=58-60度。
3）GC=30-80%.
4)3'端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.
5)正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。
6)PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150 bp 最为合适（可以延长至300 bp）。
7)引物的退火温度要高，一般要在60度以上；
要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。
而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。
至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMER EXPRESS都应该可以的。
做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。
对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不容易。
关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公开的不同物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。