酶偶联法测定血清血管紧张素转换酶
血管紧张素转化酶
检验科
概述
血管紧张素转化酶（ACE）又称激肽酶Ⅱ或肽基-羧基肽酶，系统命名为肽基二肽水解酶。属血管内皮细胞膜结合酶，由肽的C端将氨基酸切为两段变换而
来，可使肽链C端二肽残基水解。ACE可催化血管紧张素Ⅰ（十肽）水解成八
肽的血管紧张素Ⅱ，使血管进一步收缩，血压升高。也可作用于肾上腺皮质，
（2）酶偶联法：
①当底物pH 8.0，GGCN 1.0mmol/L，GGT6.7ku/L时，ACE活性与吸光度值有良 好线性。线性范围大，即使ACE在1500U/L，不用稀释也可获得理想结果。 ②GGCN浓度选择：本反应体系中GGCN既是测定酶ACE的受体，又是指示酶GGT 的供体。以1.0mmol/L的GGCN最理想，在此浓度下GGCN与吸光度保持良好的线 性。 ③GGT对测定的影响：本反应利用GGT将双甘肽与GGCN偶联，生成黄色的3-羧 基-4-硝基苯胺，其加入量可直接影响测定结果。GGT高浓度可使底物过度消 耗，使吸光度偏离曲线；低浓度GGT又使吸光度偏低，灵敏度不高。每次加入 0.335 U GGT，可获得理想吸光度与线性。在此浓度下，酶基质液的空白管吸 光度＜0.1A。
（2）酶偶联法：
①50mmol/L HEPES缓冲液：称羟、乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）1.191g，加双蒸 馏水100ml溶解，用于配制GGT、CGCN和基质缓冲液。 ②20kU/L GGT贮存液：取HEPES缓冲液5ml，加入GGT 100U，混匀后分装小瓶， －20℃。保存。 ③6.7kU/L GGT应用液：将上述贮存液用二倍量的HEPES稀释配制。
⑦10mmol/L双甘肽标准液：称Gly-Gly 52.9mg加双蒸馏水溶解，并稀释至 100ml，此为贮存液（40mmol/L）。1份贮存液和3份双蒸馏水混合即为应用液。
血管紧张素转化酶2—血管紧张素(1—7)—Mas轴在心血管和神经系统的作用
血管紧张素转化酶2—血管紧张素（1—7）—Mas轴在心血管和神经系统的作用血管紧张素转化酶2-血管紧张素（1-7）-Mas[ACE2-Ang（1-7）-Mas]为肾素-血管紧张素系统的新成员，ACE2通过水解血管紧张素Ⅰ（AngⅠ）或血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）而产生Ang（1-7），Ang（1-7）可以通过缓激肽、一氧化氮合酶（NOS）及一些信号通路发挥扩张血管、抗心室重塑、抗心律失常、抗炎、抗增生等作用，达到保护心血管及神经系统的效果。
本文将对ACE2-Ang（1-7）-Mas 在心血管及神经系统中的分子机制展开综述。
肾素-血管紧张素系统（RAS），通过调节肾脏、心血管功能活动而维持体液平衡。
在RAS中，血管紧张素Ⅰ（AngⅠ）被血管紧张素转化酶（ACE）转化为血管紧张素Ⅱ（AngⅡ），其与血管紧张素1型受体（AT1R）结合后收缩血管使血压升高、并通过肾脏和中枢维持电解质和体液的平衡。
然而过度激活AT1R，则会增加机体炎症、细胞肥大、组织纤维化的发生，导致疾病发生病理生理学改变。
Ang（1-7）发挥着与AngⅡ拮抗的生物学效应，不断有研究者对Ang（1-7）的分子机制及其在心血管及神经系统疾病中的作用机制进行探究。
ACE2、Ang （1-7）和Mas组成了RAS的新的另一通路称为ACE2-Ang（1-7）-Mas轴[1-2]。
ACE2作为一种羧肽酶裂解缩血管物质，可以将血管紧张素Ⅰ（AngiotensinⅠ，AngⅠ）水解为血管紧张素1-9（Ang1-9），也可以使AngⅡ羧基末端的苯丙氨酸产生舒血管肽血管紧张素1-7（Ang（1-7））。
Ang（1-7）与其唯一的G蛋白偶联受体Mas结合，可发挥与AT1R激活产生的生物学效应相反的作用，在一些心脑血管疾病的病理变化过程中起到重要的调节作用。
迄今为止，陆续有研究证明Ang（1-7）与其受体结合后通过某些分子通路或抑制某些炎性介质的生成而发挥着心脑血管疾病的保护作用[3]。
酶偶联测定法
酶偶联测定法一、引言酶偶联测定法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种高灵敏度、高特异性的生物分析技术，广泛应用于医学、生物学、环境监测等领域。
本文将从原理、步骤、优点和应用等方面介绍ELISA的相关知识。
二、原理ELISA的基本原理是利用抗原与抗体之间的特异性结合来检测样品中特定的蛋白质分子。
具体而言，ELISA包括以下几个步骤：1. 固定抗原：将含有抗原的溶液加入到微孔板中，使其吸附在孔底上。
2. 阻断非特异性结合：加入一些无关蛋白质（如牛血清蛋白）来防止非特异性结合。
3. 加入待测样品：将待测样品加入到微孔板中与固定抗原结合。
4. 加入检测抗体：加入与待测蛋白质特异性结合的检测抗体，该抗体通常标记有酶（如辣根过氧化物酶HRP）或荧光染料。
5. 加入底物：加入与酶标记结合的底物，使其发生化学反应，产生荧光或颜色变化。
6. 读取结果：利用光度计或荧光计测量颜色或荧光强度，从而确定待测样品中特定蛋白质的浓度。
三、步骤ELISA的步骤可以分为以下几个方面：1. 准备样品和试剂：包括制备抗原、检测抗体和底物等试剂，以及样品的收集和处理。
2. 固定抗原：将含有抗原的溶液加入到微孔板中，并在恰当条件下使其吸附在孔底上。
3. 阻断非特异性结合：加入一些无关蛋白质（如牛血清蛋白）来防止非特异性结合。
4. 加入待测样品：将待测样品加入到微孔板中与固定抗原结合。
5. 加入检测抗体：加入与待测蛋白质特异性结合的检测抗体，该抗体通常标记有酶（如辣根过氧化物酶HRP）或荧光染料。
6. 加入底物：加入与酶标记结合的底物，使其发生化学反应，产生荧光或颜色变化。
7. 读取结果：利用光度计或荧光计测量颜色或荧光强度，从而确定待测样品中特定蛋白质的浓度。
四、优点ELISA具有以下几个优点：1. 高灵敏度：ELISA可以检测非常低浓度的分子，通常可以检测到纳克级别的抗原或抗体。
2. 高特异性：ELISA可以通过特异性结合来检测待测样品中特定的蛋白质分子，避免了其他成分的干扰。
血管紧张素Ⅱ检测标准操作规程
血管紧张素Ⅱ检测标准操作规程一、目的：规范血管紧张素Ⅱ测定的标准操作程序，确保血管紧张素Ⅱ测定的结果准确有效。
二、适用范围：在AutoLumo A2000化学发光检测仪上定量测定人血清中的血管紧张素Ⅱ。
三、临床意义血管紧张素是一种能够收缩血管升高血压的多肽。
它是肾素-血管紧张素-醛固酮系统的一部分。
许多降血压药物以血管紧张素Ⅱ为靶分子。
血管紧张素Ⅱ也能够刺激肾上腺皮质分泌醛固酮。
醛固酮促进远端肾单位的钠潴留，同时也能够升高血压。
血管紧张素Ⅰ来自于它的前体分子—血管紧张素原，由肝脏产生[1]。
血管紧张素Ⅰ被血管紧张素转化酶(ACE)切除C端的两个氨基酸残基后，转化为血管紧张素Ⅱ，ACE主要存在于肺的毛细血管。
血管紧张素Ⅱ可以发挥内分泌、旁分泌和胞分泌的作用[2]。
血管紧张素Ⅱ能够被血管紧张素酶转化为血管紧张素Ⅲ。
在外周血中，血管紧张素Ⅱ的半衰期通常为30秒左右，在组织中，它的半衰期通常为15-30分钟。
血管紧张素Ⅰ是一个10肽，能够被各种酶切割为4种多肽片段，分别为血管紧张素Ⅱ(Ang 1-8), 血管紧张素Ⅲ(Ang 2-8), 血管紧张素4(Ang 3-8)和血管紧张素1-7(Ang 1-7)。
Ang1-7能够被进一步降解为一个无活性的5肽片段Ang 1-5。
血管紧张素Ⅱ是肾素-血管紧张素-醛固酮系统调节血压的一个直接作用物质。
同时，血管紧张素Ⅱ也能够作为促生长因子直接促进血管内皮细胞的增生[3]。
最近的研究发现，血管紧张素Ⅱ直接和血管内皮细胞增生，血管狭窄和动脉血管阻力增加有直接关系。
因此，血管紧张素Ⅱ的检测被越来越重视，临床上可用于高血压的辅助诊断。
四、方法原理本产品采用竞争法原理进行检测。
用血管紧张素II抗体包被磁微粒，生物素标记血管紧张素II抗原，辣根过氧化物酶标记亲和素。
通过免疫反应，竞争性形成HRP-抗原-抗体复合物，该复合物催化发光底物发出光子，发光强度与血管紧张素II的含量成反比。
血管紧张素转化酶测定试剂盒(FAPGG底物法)产品技术要求lepu
血管紧张素转化酶测定试剂盒(FAPGG底物法)适用范围：用于体外定量测定人血清中血管紧张素转化酶的活性。
1.1规格试剂盒是由试剂组成的液体单试剂,校准品质控品均为冻干粉。
规格及装量见表1。
表1 规格及装量1.2主要组成成分试剂主要组分：校准品主要组分：质控品主要组分：2.1 净含量应不低于试剂瓶标示装量。
2.2 外观试剂为无色或淡黄色透明溶液。
校准品为白色至浅黄色冻干粉，复溶后为无色至浅黄色透明液体；质控品为白色至浅黄色冻干粉，复溶后为无色至浅黄色透明液体。
外包装完好、无破损，标签完好、字迹清晰。
2.3 试剂空白2.3.1 试剂空白吸光度在340nm处测定试剂空白吸光度，应≤1.8。
2.3.2 试剂空白吸光度变化率试剂空白吸光度变化率△A/min≤0.8。
2.4 分析灵敏度测试30U/L的被测物时，吸光度变化率（ΔA/min）应不低于0.0015。
2.5 准确度参照EP9-A2的方法，用比对试剂盒同时测试40例线性区间内的不同浓度的血清样本，其相关系数（r）不小于0.990；每个浓度点在[1，18）U/L区间内绝对偏差不超过±2.16U/L；[18，150]U/L区间内相对偏差不超过±12%。
2.6 重复性批内变异系数（CV）应不超过10％。
2.7 线性2.7.1在[1，150]U/L区间内，线性相关系数r应不低于0.990；2.7.2 [1，18）U/L区间内绝对偏差不超过±2.16U/L；[18，150]U/L区间内相对偏差不超过±12%。
2.8 批间差对同一份样品进行重复测定，相对极差不大于12％。
2.9校准品批内瓶间差变异系数（CV）应≤10%。
2.10质控品批内瓶间差变异系数（CV）应≤10%。
2.11溯源性根据GB/T 21415-2008的规定，本试剂盒内校准品溯源至企业工作校准品，与已上市公司试剂盒进行比对赋值。
2.12质控品赋值有效性质控品测值应在靶值范围内。
荧光分光光度法测定血管紧张素转换酶
荧光分光光度法测定血管紧张素转换酶潘 曦1 查 艳2(1贵阳医学院化学教研室 贵阳 550004 2贵阳医学院附院内科) 血管紧张素是影响血压的一个重要因素,而血管紧张素转换酶(ACE )对其形成起催化作用。
ACE 在体内具有水解血管紧张素Ⅰ和缓激肽的双重作用,因而国外许多研究人员建议对高血压病人进行常规的ACE 测定,对评定继发性高血压类型和预测抗高血压治疗的效果有价值[1]。
测定ACE 活性的方法有分光光度法、放射测定法[1、2]等,前者灵敏度、精确度差,干扰大,后者没有现成的标记底物,且具有放射应用的固有缺点。
Friedland 和Silverstein 提出了荧光分光光度法,ACE 水解产物的组氨酰部分在碱性条件下与邻-苯二甲醛反应生成荧光物。
1996年我们应用此法对血清ACE 活性测定进行了研究。
1 仪器与试剂1.1 仪器 荧光测定仪(Turner Model Ⅲ),37℃恒温水浴箱,10μl 、100μl 、250μl 微量注射器。
1.2 试剂 马尿酰-L -组氨酰-L -亮氨酸底物HHL (5m mol /L );邻-苯二甲醛;L -组氨酰-L -亮氨酸HL (0.516m mol /L ):准确称取13.9mg H L 溶解,于100ml 容量瓶定容;NaH 2BO 3-H 3BO 3-NaCl 缓冲液(pH8.3);标准血清。
2 方法于25ml 容量瓶中加入2.00ml 0.516mmol /L H L 储备液,5.0ml 硼酸缓冲盐水,蒸馏水稀释至刻度,摇匀。
取250μl 于10mm ×75m m 试管中,分别加入0.28mol /L NaOH 1.5ml ,无药混合血清10μl ,摇匀、蜡封,置于37℃恒温水浴。
30min 后,加入37℃恒温水浴过的邻-苯二甲醛100μl ,摇匀,离心1min 后存于暗处。
以试剂空白作参比,在荧光测定仪上测定荧光强度,进行条件实验和样品分析。
血管紧张素受体拮抗剂、转换酶抑制剂及心房颤动与心房重构的研究进展
进行性缩 短， Ｆ诱发率增 加。Ｗｉ ｅ 根据这些 研 Ａ ｊｌ ｆｓ
究 结果 ， 首次 提 出 了心房 电重 构 概念 ， 并认 为即使 没 有心脏 器 质性 病变 ， Ａ 仅 Ｆ引 起 的 电重 构 也 能 使 Ａ Ｆ
发作并持续。随后许多学者通过快速心房起搏 的方 法建 立房 颤 的 动 物 模 型 ， 乎 所 有 的研 究 表 明 Ａ 几 Ｆ 能降低 Ａ Ｒ ， Ｅ Ｐ的缩短导致 Ａ Ｅ ＰＡ Ｒ Ｆ的发作频率增 加， 发作持续时间延长 。Ｔ ｅ ｏｎｃａ ［通过动物 ａ－ ｏ ｈ 等 ２ ｊ 实验发现随着心力衰竭的恢复 ， Ｆ的电重构可完全 Ａ
管紧张素 Ⅱ １ 一 型受体 （ Ｔ ） Ａ １ 减少 ， ２型受体 （ Ｔ ） Ａ ２ 增加刺激 Ａ １ Ｔ 受体会导致心 房问质纤维化 和心肌
的肥 大 ， 随着 ＡＦ病 程 的延 长 ， 者左 心 房 逐 渐 发 生 患 了结 构重 构 。 心房 肌 成纤 维 细胞 合 成 、 泌 Ｉ型 和 Ⅲ型 胶原 分 主要 受 Ｒ Ｓ调 节 ， Ｆ患 者 心 房 肌 Ｉ型 和 Ⅲ型 胶 原 Ａ Ａ 含量显著增 加 ， Ａ 与 Ｆ持 续 时 间 和 复 发 率 呈 正 相
Ａ Ｆ时心 房 肌 激 活 可 能 通 过 促 进 钙 超 载 使 ｃｌ ａ— ｐｉｓ激 活 ， 起 心 房 肌 肌 原 纤 维 溶 解 和 破 坏 。 ａ ｎ 引
房的解剖重构有利 于 Ａ Ｆ的诱发 和维持发作 ， 使心
房 电重 构继 续维 持 。
作者简 介： 方昱 （９ ２一） 男 ， １７ ， 安徽 合肥人 ， 科 ， 本 主治医师。
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中国临床保健杂志 ２ ０ 年 ｌ 第 ！ ０７ ２ 鲞箜 塑
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血管紧张素转化酶2—血管紧张素(1—7)—Mas轴在心血管和神经系统的作用
血管紧张素转化酶2—血管紧张素（1—7）—Mas轴在心血管和神经系统的作用作者：王晶晶梁广彬邓凡卢悦张良清来源：《中国医学创新》2015年第36期【摘要】血管紧张素转化酶2-血管紧张素（1-7）-Mas[ACE2-Ang（1-7）-Mas]为肾素-血管紧张素系统的新成员，ACE2通过水解血管紧张素Ⅰ（AngⅠ）或血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）而产生Ang（1-7），Ang（1-7）可以通过缓激肽、一氧化氮合酶（NOS）及一些信号通路发挥扩张血管、抗心室重塑、抗心律失常、抗炎、抗增生等作用，达到保护心血管及神经系统的效果。
本文将对ACE2-Ang（1-7）-Mas在心血管及神经系统中的分子机制展开综述。
【关键词】血管紧张素转化酶2；血管紧张素（1-7）；肾素血管紧张素系统；神经系统；心血管系统Effects of Angiotensin Converting Enzyme 2-Angiotensin（1-7）-Mas Axis on Cardiovascular System and Nervous System/WANG Jing-jing，LIANG Guang-bin，DENG Fan，et al.//Medical Innovation of China，2015，12（36）：143-146【Abstract】 Angiotensin converting enzyme 2-Angiotensin（1-7）-Mas[ACE2-Ang（1-7）-Mas] is the new components of renin-angiotensin system.ACE2 generates Ang（1-7） through hydrolyzing angiotensin Ⅰ or angiotensin Ⅱ.Ang（1-7） can dilate blood vessels，inhibit cardiac remodeling，suppress arrhythmia， control inflammation， inhibit proliferation and generate other funtions through bradykinin，nitric oxide synthase（NOS）and some signal pathways.These effects can create cardiovascular and nervous protective effects.This article examines the mechanical of ACE2-Ang（1-7）-Mas in cardiovascular system and nervous system.【Key words】 Angiotensin-converting eazyme 2； Angiotensin（1-7）； Renin-angiotensin system（RAS）；Nervous system； Cardiovascular systemFirst-author’s address：Guangdong Medical College，Zhanjiang 524000，Chinadoi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.36.047肾素-血管紧张素系统（RAS），通过调节肾脏、心血管功能活动而维持体液平衡。
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中华医学检验杂志CHINESE JOURNAL OF MEDICAL LABORATORYSCIENCES1998年 第6期 No.6 November 科技期刊酶偶联法测定血清血管紧张素转换酶金化民 张茨 陈葳 陈谦 【摘要】 目的 建立一种测定血管紧张素转换酶(ACE)的酶偶联法。
方法 血清与底物马尿酸双甘肽(Hip-Gly-Gly)混合温育30分钟，生成马尿酸(Hip)与双甘肽(Gly-Gly)，再加入L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺(GGCN)和γ-谷氨酰基转移酶(GGT)，催化GGCN与Gly-Gly偶联，产生的3-羧基-4-硝基苯胺于410 nm波长测定其吸收度。
结果 当底物pH8.0，GGCN1.0 mmol/L，GGT 6.7 kU/L时，ACE活性与吸收度值有良好线性。
55份健康人血清ACE(±s)289±83 U/L，CV：批内4.6%；批间4.8%。
10份肉样瘤患者血清ACE(±s)748±34.9 U/L，批内CV3.9%，回收率96%～103%。
结论 酶偶联法测定ACE活性具有操作简便、迅速、重复性好，适用于手工操作或自动化分析，可用于诊断早期肺损伤和人类免疫缺陷病毒感染。
【关键词】 酶偶联法 γ-谷氨酰基转移酶 血管紧张素转换酶 活性Determination of serum angiotensin-converting enzyme by enzyme coupling spectrophotometry Jin huamin Zhang Ci, Chen Wei, et al. First Affiliated Hospital ， Hubei Medical University, Wuhan 430060 【Abstract 】 Objective To establish a new method to measure ACE activity using the coupled reaction which is catalyzed by γ-glutamyl-transferase (GGT). Methods GGT was added as catalyts after the mixture of serum and substrate hippurylglycyl-glycine had been incubated for 30 minutes at 37℃, it participated from as receptor substratefor a γ-glutamyl group transfered from a donor substrate, L-γ-glutamyl-3-carboxy-4-nitroanilide was measured at 410 nm. Results The ACE activity and absorptance was linearly related when pH was 8.0, GGCN was 1.0 mmol/L, and GGT was 6.7 U/L. The mean value (±s) of serum ACE in 55 normal and 10 sarcoid specimens was 289±83 U/L, and 748±34.9 U/L respectively, and the within-run and between-run CV was 4.6% and 4.8% respectively. The later within-run CV was 3.9%, and the recovery rate was 96%～103%. Conclusion ECS is a simple, quick, and reliable method, and it can be used for early detection of the infection of HIV and the damage of the lung. 【Key words 】 Enzyme coupling spectrophotometry Gamma-glutamyltranspeptidase Angiotensin-converting enzyme Activity 血管紧张素转换酶(Angiotensin-Converting Enzyme, ACE∶EC为3.4∶15.1)，又名激肽酶Ⅱ，按系统命名法为肽酰二肽水解酶，属于羧基外肽酶。
它的生理功能是催化血管紧张素Ⅰ(ATⅠ)水解成为血管紧张素Ⅱ(ATⅡ)，释放出组-亮二肽；也可水解缓激肽，释放出苯丙-精二肽。
ACE是一种血管内膜细胞核膜糖蛋白，在体内分布很广，几乎遍布人体各个脏器，归纳起来分为血管内和血管外两类。
血管内ACE主要分布在肺血管床；血管外ACE主要分布在肾近曲小管和小肠绒毛的刷状缘。
在某些疾病，一些由单核细胞分化而来的细胞可产生大量的ACE并释放入血，引起血清ACE活性升高，在临床上具有诊断意义。
国外已将ACE测定列为结节病上皮样肉芽肿，高雪病的诊断和预后估计的常规项目［1］。
血清ACE活性变化在诊断急性肺损伤及人类免疫缺陷病毒(HIV)感染方面已受到极大重视。
相继建立了荧光光度法、放射性同位素法、高效液相色谱法和分光光度法。
这些方法都是基于ACE水解基质马尿酸-组氨酰-亮氨酸或马尿酸双甘肽(Hip-Gly-Gly)，产生马尿酸(Hip)和组氨酰亮氨酸或双甘肽(Gly-Gly)，然而这些方法有的要用有机溶剂提取［2］，有的需要衍化或去除血清蛋白，还有的需要特殊设备或接触放射性试剂［3］，因而推广应用受到限制。
近年来，Groff等［4］报告一种由γ-谷氨酰基转移酶(GGT)作指示酶的酶偶联法测定血清ACE，认为是目前测定ACE的理想方法。
该法操作简单，重复性好，既可用于手工操作，又可用于自动化分析。
我们根据国内条件作了一些改进和探讨，报告如下。
材料与方法 一、试剂 1.HEPES缓冲液(50 mmol/L)：取HEPES(Sigma产品)1.191 g加双蒸水100 ml溶解，用于配制GGT、GGCN和基质缓冲液。
2.GGT贮存液(20 kU/L)：取HEPES缓冲液5 ml加入GGT(批号Lot 112H9620)100 U，混匀后分装小瓶-20℃存放。
3.GGT应用液(6.7 kU/L)：将上述贮存液用二倍量的HEPES稀释配制。
4.GGCN(1.0 mmol/L)：取L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺(GGCN，Sigma产品，批号Lot73HO7290)20 mg加入50 mmol/L HEPES 60 ml，混匀溶解后4℃保存。
5.基质缓冲液：HEPES 1.191 g，NaCl 1.755 g，Na2SO4 5.68 g用双蒸水溶解后，以NaOH调pH到8.0，再补充双蒸水到100 ml，置4℃备用。
6.基质液：由Hip-Gly-Gly(Sigma产品，批号Lot 88F5805)89.5 mg加基质缓冲液10 ml溶解混合而成。
此液各试剂终浓度为HEPES 50 mmol/L，NaCl 30 mmol/L，Na2SO4 400 mmol/L，Hip-Gly-Gly 30 mmol/L。
7.双甘肽标准液(10 mmol/L)：称取甘氨酰甘氨酸(Gly-Gly, Sigma产品)52.9 mg加双蒸水溶解，定溶至100 ml。
此液双甘肽浓度为40 mmol/L，应用液由1份贮存液和3份双蒸水混合而成。
二、测定方法 1.原理：血清中的ACE作用于底物马尿酸双甘肽，生成马尿酸和双甘肽，再由加入的GGT催化L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺(GGCN)与双甘肽偶联，生成3-羧基-4-硝基苯胺，在410 nm处测定其吸光度，ACE活性与生成物量呈正比。
偶联反应如下：马尿酸双甘肽ACE马尿酸+双甘肽双甘肽+GGCNGGTγ-谷氨酰双甘肽+3-羧基-4-硝基苯胺 2.测定方法：取4只小试管，分别标明测定管(T)、标准管(S)、血清空白管(SB)、试剂空白管(RB)。
按附表操作。
附表 测定操作步骤加入物加入量(μl)T S SB RB血清 10- 10-ACE基质液100---基质缓冲液-100100100HEPES液--- 10双甘肽标准液-10--混合，37℃30分钟GGCN(1.0 mmol/L)850850850850混合，37℃ 10分钟GGT应用液50505050 以双蒸水调零点，410 nm比色，记录各管2分钟吸收度ΔA，按下式计算： 单位定义：血清与底物在37℃条件下每升血清每分钟释放1 μmol/L双甘肽所需要的酶量为一个ACE单位。
结果 1.GGCN浓度选择：本反应体系中GGCN既是测定酶ACE的受体，又是指示酶GGT的供体。
我们比较了0.5、1.0、1.5 mmol/L的GGCN与吸光度A的关系(图1)。
结果以1.0 mmol/L的GGCN最理想，在此浓度下GGCN与吸光度保持良好线性。
图1 GGCN浓度选择 2.GGT对测定的影响：本反应利用GGT将双甘肽与GGCN偶联，生成黄色的3-羧基-4-硝基苯胺，GGT加入量对测定有一定的影响，高GGT浓度会导致底物过度消耗，吸光度偏离线性，低浓度GGT又使吸光度偏低，灵敏度不高(图2)。
我们采用每次加入0.335UGGT，能获得理想吸光度与线性，在此浓度下，酶基质液的空白吸光度＜0.1A。
图2 GGT浓度对测定的影响 3.线性：取不同量10 mmol/L双甘肽标准液按操作方法测定，记录2分钟的ΔA，图3表示反应速率与双甘肽含量之间的关系，表明当ACE在1 500 U/L以下时，本法具有良好线性，即使高ACE活性的样本，不用稀释也可获得理想的结果。
图3 双甘肽与吸收度的线性关系 4.精密度试验：我们测定了10份正常人和10份肉样瘤患者血清ACE活性，每份标本平行测定3次，取均值。
批内正常人(±s)308±16.8 U/L，CV4.6%；肉样瘤(±s)748±34.9 U/L，CV3.9%；批间CV是用一份正常人血清每日测定一次，连续10天来计算，结果(±s)323±20.4 U/L，CV4.8%。
5.回收试验：采用ACE活性302 U/L和627 U/L各一份血清分别加入10 mmol/L双甘肽标准液，重复测定3次，回收率96%～103%。