产纤维素酶菌株鉴定

一株产纤维素酶益生芽孢杆菌的筛选与鉴定

一
株产纤维素酶益生芽孢杆菌的筛选与鉴定
但言陈元坤朱杰马跃刚
（重庆市水产科学研究所，重庆４０１１２１）
摘
要：从健康大鳍鲮（
）肠道菌群分离得到的２５株细菌，通过平板筛
选、发酵液酶活力测定和菌株安全性检测，筛选出一株具有较高产纤维素酶能力的益生芽孢杆菌ＤＱＨＹ一７菌株。通过对ＤＱＨＹ一７菌株形态观察、生理生化试验，对ＤＱＨＹ一７菌株进行了分类鉴定。结果显示：ＤＱＨＹ一７菌株具有较强的分泌纤维素酶能力，水解圈／菌落直径比为ｌ２．７７，２０ｈ发
３０ｍｉｎ。
１．２．４安全性试验取１００ｃｍ ×５０ｃｍ×６０ｃｍ的水族缸５只，充入曝气自来水，每缸￣．／Ｎ．２０只健康大鳍鲮（２０ ±
１．２方法
０．５）ｇ，取４只缸进行动物毒性试验：将最符合益生菌条件菌株接种在营养肉汤，２８ ℃培养２４ｈ后，用０．８５％无菌生理盐水稀释菌悬液至浓度
度接种３个平板，最后将平板置于２８ ℃恒温培
ＣＦＵ／Ｅ。将不同稀释度的菌悬液用无菌注射ｍ器对每尾大鳍鲮注射０．３ｍＬ作为试验组。对照
组则注射同体积的无菌生理盐水。注射后放回
水族箱中继续饲养，每日记录死亡情况，连续
观察７ｄ。

高产纤维素酶菌的筛选、鉴定及应用概述

农家参谋科技研究-220-NONG JIA CAN MOU高产纤维素酶菌的筛选、鉴定及应用概述王琪（河南师范大学生命科学学院，河南新乡，453007）【摘要】纤维素作为自然界最丰富的可再生资源之一，具有易获得、廉价等优点。

近年来，随着全球经济的迅速发展，能源消耗巨大，地球环境遭到严重破坏；因此，寻找可再生的清洁能源迫在眉睫，所以高产纤维素酶菌的筛选、鉴定及应用得到了人们广泛的关注，也是当今微生物学、农业科学、生态学的研究热点。

本文对之前高产纤维素酶菌的筛选、鉴定及应用的研究进行进行整合归总，展望今后的研究方向。

【关键词】高产纤维素；酶菌；筛选；鉴定1 高产纤维素酶自然界中纤维素广泛存在，但是降解过程生产成本高、环境污染问题，效果不理想。

经大量研究发现，纤维素酶是酶的一种，能够有效降解纤维素。

纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中。

细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶，所以近年来各界学者致力于筛选及鉴定高产的纤维素酶菌的研究。

2 高产纤维素酶的筛选与鉴定经查阅资料与分析，从一定地区取样如：土样、常年堆积干枯腐败植物茎秆、东亚飞蝗肠道内等；取一定量样品在三角瓶中富集培养；先梯度稀释，然后通过常规的稀释法或划线法接种涂布于马铃薯平板与牛肉膏蛋白胨分离培养基之上，37℃恒温培养24d,菌落计数,然后挑选菌落形态差异比较明显的菌落,重复划线接种于相应的琼脂平板上,直至纯化得到单菌落。

根据菌落形态观察，保存不同种的菌落，利用牙签蘸取菌落，放入离心管进一步富集；之后取富集液滴在圆形滤纸片上然后分别接种与刚果红培养基，保持对应关系，进行培养；继而用游标卡尺测量菌落周围水解透明圈的直径,并以其大小作为初步判断分解能力的指标；接下来把筛选出的菌株用单染色法、复染色法和指纹代谢法进行初步确定菌株类别；最后用16SrDNA 鉴定，通过PCR 电泳比对后送公司进行测序；确定菌株后进行酶活测定以及优化其酶活力的条件探究。

目前经大量实验，从陕北花马盐湖分离得到一株黑曲霉Aspergillusniger6MA1，发酵条件优化后酶活可达到47.8U/mL；从常年堆积干枯腐败植物茎秆中筛选出一株肠杆菌属Enterobactersp，在未进行发酵条件优化的情况下酶活达到为0.44u/mL；从湿润木屑中分离和筛选获得１株高产纤维素酶目的菌株ＬＹＷ－１等。

产纤维素酶菌种的筛选与优化

产纤维素酶菌种的筛选与优化一、菌种筛选的原理与方法菌种筛选的原理是通过筛选产纤维素酶活性高、产量大的菌种。

常用的菌种筛选方法有以下几种：1.传统菌种筛选：分离环境中的纤维素降解菌株，通过纤维素酶活性测定筛选产纤维素酶能力较强的菌株，再通过多次温育和活性测定，逐步筛选出高活性的菌株。

2.显性菌种筛选：利用纤维素酶结构上保守的区域设计引物，在环境DNA中扩增出纤维素酶基因片段，使用这些基因片段进行克隆构建，然后在宿主中进行表达，通过纤维素酶活性测定筛选产纤维素酶能力较强的菌株。

3.基因工程菌种筛选：利用已知纤维素酶的基因进行基因工程，通过载体导入宿主细胞中，通过外源表达基因，从而获得产纤维素酶菌种。

二、菌种优化的原理与方法菌种优化的原理是通过改变菌株基因组或环境条件，提高纤维素酶产量和活力。

常用的菌种优化方法有以下几种：1.自然进化优化：通过长期培养，逐渐挑选出产酶能力强、极端环境适应能力强的突变菌株。

2.诱变优化：利用物理、化学或基因工程等方法对菌株进行诱变，通过筛选获得产纤维素酶能力强、菌株稳定的变种。

3.基因工程优化：利用已知纤维素酶的基因进行基因编程，通过基因工程技术对菌株基因组进行改造，以提高纤维素酶的产量和活力。

三、未来的研究方向1.菌种筛选方法的改进与创新：应综合运用传统筛选、显性筛选和基因工程筛选等方法，发展新的高效、快速的菌种筛选方法。

2.菌种优化技术的优化与提高产量、活性：要通过生理、代谢工程的方法改造纤维素酶产生菌，提高纤维素酶的产量和活力。

3.开发新型纤维素酶菌株：从不同环境中分离筛选出产酶能力强的菌株，进一步发现和研究产纤维素酶的新菌株。

4.提高纤维素酶产量与废弃物转化率的研究：将纤维素酶应用于废弃物转化过程，提高纤维素酶产量和转化率。

综上所述，产纤维素酶菌种筛选与优化的研究是促进纤维素酶应用的关键。

通过不断改进筛选和优化方法，进一步开发新的菌种，提高纤维素酶的产量和活力，将对纤维素酶的应用产生积极的推动作用。

一株产纤维素酶真菌的筛选、鉴定及降解效果

ｃｎｉｏｓｏ０ｒｒｎａ２ｅｒｅＣｈｅｐａａｅｏｄｇｃｎｓＥ／ｅ）ｅｏｌｃｎｅ（Ｂ／ｅ）ａｄＢｏｄｔｎｆ２ａ８ｄｇｓ．Ｔｅｋｌｓｆｎｏｌａａｅ（ＧＣｎ，ｘｇｕａａＣＨＣｘｎ．ｉ１／ｉｔｅｖｕｅｕｓ
基。１）全国优秀博士学位论文专项基金（０５４；２０４）黑龙江省杰出青
年基金（Ｃ０９９。Ｊ２００）第一作者简介：李保深，，９５年２月生，男１８东北林业大学林学院，硕士研究生。通信作者：高大文，东北林业大学林学院，授。Ｅｍｉｄｗｎ教 — ａ：ａｅ— ｌ
ｇｅｓａｅ（．ａｅｅ．５，．８ｎ．８／ｓｃｖｌｌｏｉｓＢＧｓ）ｗｒ３８６２６１ａｄ１４７ＩｍＬｒｐｔｅ．ｙｄｅＵｅｅｉｙ
ＫｅｗｏｄＳｒｅｅａａｉｎｙｒｓｃｎｓｐｔ：Ｐｅｉｉｉｍｅｕｅｓ；１Ｓｒｅｒｏｎｃｌｕｄｃｍｂｎｌ８ＤＮＡ；Ｃｌｌｅ；Ｓａｎｎｌｃｒｎｍｉｒｓｏｅｅｌａｕｓｃｎｉｇｅｅｔｏｃｏｃｐｓ
ｇｏｇｉ．ｏｏａ＠ｍａｌｅｍ
１材料与方法
收稿日：１期２０年ｌ２０２月９日。责任编辑：红。程
１２分析方法。将纯培养菌株接人发酵培养基中，２、０／ｉ摇床８℃ １ｍｎ２ｒ培养７ｄ用移液枪吸取１ｍ，Ｌ发酵液离心（０／ｉ，９００ｒｍｎ５ｍｉ）上清液即为粗酶液。ｎ，酶活力的测定：滤纸糖化力的测定。取粗酶液０５ ① ．ｍ，Ｌ加入醋酸一醋酸钠缓冲液（Ｈ值４８０１ｏＬ２ｍ，ｐ．，．ｍｌ）Ｌ／然后加入一张（ｘ）１ｍ６ｍ新华１ｃｃ号滤纸， ℃恒温水浴１５０ｈ

一株产纤维素酶枸杞内生菌的分离鉴定

摘
要：通过组织分离法从健康枸杞植株体内分离到ｌ０株内生茵，经反复筛选及刚果红染色鉴定，获得一株较高活力
纤维素酶内生茵ＧＱＰ一３。结合茵落形态、生理生化特性及菌株特异性序列分析等手段，确定其分类归属。结果表明ＧＱＰ
一
３为类芽孢杆菌属，该茵的发酵液在中性条件下的ＣＭＣ酶活力可达２０．０Ｕ／ｍＬ。关键词：枸杞；纤维素酶；内生茵中图分类号：Ｑ９３— ３３１文献标志码：Ａ文章编号：１００１ — ８５８１（２０１３）０４－００３８－０５
ｎｄａＣＭＣｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｂｒｏｔｈｏｆｔｈｅｓｔｒａｉｎｉｎｈｅｔｎｅｕｔｒｌａｃｏｎｄｉｔｉｏｎｃｏｕｌｄｒｅａｃｈ２０．０Ｕ／ｍＬ．
一
３ｗａｓｈｅｔｅｎｄｏｇｅｎｅｔｉｃｓｔｒａｉｎｐｒｏｄｕｃｉｎｇｃｅｌｌｕｌａｓｅｗｉｔｈｈｉｇｈｅｒｖｉｇｏｒ，ｎｄａｉｔｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｒｅｐｅａｔｅｄｓｃｒｅｅｎｉｎｇａｎｄＣｏｎｇｏｅｄｒｄｙｉｎｇ
ｍｅｔｈｏｄ．Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｃｌａｓｓｉｆｙｔｈｉｓｓｔｒａｉｎ，ｓｏｍｅｍｅａｎｓｗｅｒｅｕｓｅｄ，ｓｕｃｈａｓｃｏｌｏｎｉａｌｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃｌａａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃｌａｃｈａｒａｃ —

纤维素酶高产菌株的选育

纤维素酶高产菌株的选育
纤维素酶是一种能够分解纤维素的酶，对生物质的利用具有重要意义。

选育纤维素酶高产菌株是提高纤维素酶生产效率的关键。

以下是一些选育纤维素酶高产菌株的常用策略和方法：
1. 采用自然筛选法：从自然环境中采集植物残渣、堆肥等具有高纤维素含量的样品，通过培养和筛选获取纤维素酶高产菌株。

这种方法的优势是能够发现具有适应性强、高纤维素酶产量的菌株。

2. 遗传工程法：通过对已知具有高纤维素酶产量的菌株进行基因工程改造，引入其他有利于纤维素酶产量提高的基因或突变体。

3. 诱变法：通过化学物质（如EMS、亚硝酸钠等）或辐射（如紫外光、X射线等）处理菌株，诱发基因突变，筛选出纤维素酶高产突变菌株。

4. 基因筛选法：通过分析纤维素酶基因的表达水平和调控机制，筛选具有高纤维素酶基因表达水平和调控机制的菌株。

5. 代谢工程法：通过改造代谢途径，优化产生纤维素酶所需的底物和能量供应等因素，提高纤维素酶产量。

以上方法可根据实验室条件和研究目的选择合适的方法进行选育纤维素酶高产菌株。

产纤维素酶霉菌的筛选及初步鉴定

低，以将其剔除掉。可１４可降解纤维素真菌的复筛．
种类繁多，来源也很广。大多数纤维素酶主要来自微生物体心。目前，们对各种微生物（括真菌］人包和细菌）的纤维素酶的关注较多，其是源于真菌尤的纤维素酶。所有能分解微晶纤维素的真菌，能均或多或少地分泌纤维素酶，以纤维素酶的真菌源所
本研究使用羧甲基纤维素液体培养基富集培养环境样品，分离得到３产纤维素酶的霉菌。使用４株刚果红染色初筛和ＤＳ法复筛，到２株纤维素酶Ｎ得活较高的霉菌菌株ｗ００、ｘ０５同时还使用苏ｘ５３ｗｌ０。
℃培养４ —５ｄ进行活化，后接种到３Ｌ（５之０ｍ２０
ｍＬ三角瓶）ＤＰＡ液体培养基中，２ ℃ 、８／ｉ于８１０ｒｒｎａ下摇床发酵，３ｄ后取样测定上清发酵液中的ＣＭＣ
酶活力。
１５ＤＮ．Ｓ法测ＣＭＣ酶活
—
ｆｕｅｈｌｓｏｒｃｌａｅ—ｐｏｕｉｇｆｎｉｓａｎｒｓｌｔｄｔｒｕｈｅｒｈｎｕｔｒｎｙＣＭＣ —Ｎａｌｕｄｍｅｉｍ．ｒｄｃｎｇｔｉｓｗｅｅｉｏａｅｈｏｇｎｃｍｅｔｃｌｉｇｂｕｒｉｕｉｉｄｕｑ
ＤＩ１．９９ｊｉｎ１０－８．０１０．０Ｏ：３６／．ｓ．０９８１２１．３０２０ｓ４

从土壤里筛选产纤维素酶细菌的步骤

从土壤中分离产几丁质酶的真菌作者：王春学号:11101680摘要：几丁质是自然界中储量仅次于纤维素的生物多聚体,它广泛存在于真菌、硅藻、节肢动物和原生动物等生物体中,是绝大多数真菌细胞壁的结构物质,同时还是昆虫中肠围食膜的主要成分[1].几丁质酶(Chitinase,EC3.4.1.14)[2]可催化水解几丁质的β21,4糖苷键生成N2乙酰2D2氨基葡萄糖(NAG),它在植物病虫害,尤其是对真菌病的防治方面,以及在几丁质废物的转化和利用等方面都具有重要作用,其研究受到人们的广泛重视.通过几丁质作为碳源,从土壤中筛选产几丁质酶菌株.1 材料与方法1.1 培养基1.1.1 平板培养基 (1)细菌几丁质培养基(分离用):蛋白胨10g,K2HPO40.7g,MgSO40.5g,KH2PO40.3g,胶体几丁质5.0g,琼脂15～20g,蒸馏水1L,pH值为7.2.(2)纯几丁质培养基:胶体几丁质 5.0g,KNO31.0g,NaCl0.5g,K2HPO40.5g,MgSO40.5g,FeSO40.01g,琼脂20g,蒸馏水1L,pH值为7.2.1.1.2 摇瓶培养基 (1)种子培养基(LB培养基):蛋白胨10g,酵母膏5g,NaCl10g,蒸馏水1L,pH值为7.0.(2)发酵培养基:用细菌几丁质培养基(分离用),但不加琼脂1.2 菌株的分离1.2.1 菌株初步分离从生产几丁质的工厂排污沟附近土壤采集土样,经过烘干及风化干燥,置于60目分样筛过筛,备用.称取1g土样放入加有9mL无菌水的离心管,分别稀释制成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6不同稀释倍数的土壤溶液.从10-3,10-4,10-5,10-6不同稀度倍数的4管土壤稀释液中各吸取0.1mL,接种在纯几丁质培养基和细菌几丁质培养基的平板上,用涂布棒涂布均匀,在30℃下培养72h.1.2.2 菌种的二次筛选从第1次稀释涂布的平板中挑取可以产生透明圈的菌落,再一次通过稀释涂布的方法,将其接种于纯几丁质平板和细菌几丁质平板上,培养72h,以取得纯菌落平板.从第2次筛选的纯菌平板上选取水解圈直径与菌落直径比最大的菌种,将其接种于50mL的LB种子培养基上,12h后以2%的接种量接于100mL的细菌几丁质发酵培养基中,在30℃下进行扩大培养.1.3 菌种的鉴定1.3.1 细菌染色体DNA提取从新培养产几个质酶活性高的革兰氏阴性细菌平板上,挑取一环菌落至加有500μLTE缓冲液的1.5mL微量离心管中,混匀后沸水浴1.5min,迅速低温离心(12000r・min-1)10min,取上层清液分装后,置4℃下保存备用.1.3.2 16SrDNA引物根据16SrDNA的结构,应用B2/B3做引物,该引物扩增片段包含V8和V9两个高变区,扩增产物大小为1050bp(basepair,碱基对)左右.这两个引物序列为B2:5’2ACGGGCGGTGTGTAC23’;B3:5’2CCTACGGGAGGCAGCAG23’.1.3.3 聚合酶链反应(PCR)检测 PCR反应体系为20μL,二次蒸馏水12.6μL,10倍扩增缓冲液2.0μL,25mmol・L-1Mg2+1.6μL,各2.5mmol・L-1的脱氧核苷三磷酸(dNTP)0.4μL,20μmol・L-1引物各1.0μL,DNA模板1.0μL,5GU・L-1Taq酶0.4μL.PCR循环:94℃预变性5min,94℃变性60s,50℃退火60s,72℃延伸90s,循环30次,并在72℃后延伸15min.1.3.4 扩增产物的电泳分析用1倍的TAE缓冲液配制质量分数为1%琼脂糖凝胶.取PCR 扩增产物10μL,加2μL溴酚蓝指示剂,混匀后加样,于100V下电泳1.5h,紫外灯下观察电泳结果.1.3.5 序列测定与分析将观察到的PCR产物切胶,用胶回收试剂盒回收后,连接到pMD182T上,送北京奥科生物公司进行测序.然后,将测序结果通过GeneBank进行BLAST序列比对,得出结果参考文献[1] BROGLIEKE.Chitinaseandplantprotection[J].RevPlantPathol,1993,2:4112421.[2] 李力,黄胜元,关雄.产几丁质酶的苏云金杆菌菌株筛选及酶合成条件研究[J].中国病毒学,2000,15(51):94297.[3] CHANGYu2cheng,YANGChiyea,LIChin,etal.IdentificationofBacillussp,Escherichiacoli,Salmonellasp,StaphylococcusspandVibriospwith16SribosomalDNA2basedoligonucleotidearrayhybridization[J].Internation2 alJournalofFoodMicrobiology,2006,107:1312137.[4] 张龙翔,张庭芳,李令媛.生化实验技术[M].北京:高教出版社,1997:1112116.[5] MOOREER,KRUGERAS,HAUBENL,etal.16SrRNAgenesequenceanalysesandinter2andintragenericre2lationshipsofXanthomonasspeciesandStenotrophomonasmaltophilia[J].FEMSMicrobiolLett,1997,151(2):1452 153.[6] MIYAJIT,OTTAY,SHIBATAT,etal.PurificationandcharacterizationofextracellularalkalineserineproteasefromStenotrophomonasmaltophiliastrainS21[J].LettApplMicrobiol,2005,41(3):2532257.[7] MADHA VAPNK,BAIJUTV,SANDHYAC,etal.ProcessoptimizationforantifungalchitinaseproductionbyTrichodermaharzianum[J].ProcessBiochem,2004,39:158321590.[8] NAWANINN,KAPADNISBP.Optimizationofchitinaseproductionusingstatisticsbasedexperimentaldesigns[J].ProcessBiochem,2005,40:6512660。