液相色谱培训
高效液相色谱法基本知识培训-化验员入门培训
改变α是改变后一组分相对于前一组分的保 留时间。α的改变可以选择不同的固定相或
流动相来实现。但改变固定相在液相色谱 中比较麻烦。如在一个色谱系统中,用二根 不同固定的柱子,则又必须考虑到流动相的
适应性。比较行之有效的办法是改变流动 相的极性,如采用连续改变流动相极性的梯
度洗脱或温度程序等方法来提高分离选择 性。
k’= tR/tM-1= tR’/tM 可见,容量因子就是调整保留时间与死时间的 比值。在液相色谱中，k’只与固定相、流动相性 质及柱温有关,而与流速和柱尺寸无关。
理论塔板数n和塔板高度H
理论塔板数n是反映物质在固定相和流动相 中动力学特性的重要色谱参数,它是代表色 谱柱分离效能的指标。
计算公式为:
n=16(tR/W)2=5.54(tR/Wh/2)2 tR为保留时间, W为峰宽， Wh/2为半高峰宽 塔板高度H计算公式为： H=L/n L为色谱柱长度。
分离因子(α)及分离度（R）
1.分离因子(α) α= k2’/k1’=tR2’/tR1’ α代表了二个物质在相同的色谱条件下的分 离选择性。物质的化学性质或结构上的差 异,反映在与固定相和流动相之间作用力也 有所差异上。这就是色谱分离的基础。
中保留程度的参数,并作为色谱定性的指标。 其表示方法有保留时间、保留体积、调整 保留时间和调整保留体积。
保留时间和保留体积
一般认为,当进样量很小 时,样品从柱中流出呈高斯曲 线分布。从进样开始到峰极 大值所需时间时间称为保留 时间,以tR表示。由于流出时 间与流动相流速成反比,因此 又可用保留体积作为保留值 参数,以VR表示。VR=tR・FC 式中, tR为保留时间(min), FC 为流动相流速（ml/min)。
分类
化学键合相的分类可以有不同的依据。按 键合相的表面结构为单分子键合和聚合键 合；按性质分为Si-O-C,Si-O-Si-N,Si-O-S-C； 按键合有机硅烷的功能团分为极性键合相、 非极性键合相和离子性键合相三种。
液相培训试题
高效液相色谱仪培训检测一、选择题1、以下属于光学性质检测器的就是( )A、紫外-可见光检测器B、荧光检测器C、电导检测D、光声检测器2、HPLC流动相对溶剂的要求有( )A、纯度高、化学稳定性好B、对待检测样品具有合适的极性与选择性C、用于紫外检测时,溶剂在检测器的工作波长下不能有紫外吸收D、分析纯级别即可以被用来作为流动相3、高效液相色谱的流动相常见的脱气方法有( )A、超声波脱气B、抽真空脱气C、在线真空脱气D、加热脱气4、液相使用过程中若发现有盐析出导致压力较高,应该选择用哪种流动相进行冲洗( )A、水B、甲醇C、乙腈D、缓冲盐5、不可以用来对泵头进行冲洗的试剂就是( )A、异丙醇B、甲醇C、水D、缓冲盐6、在高效液相色谱流程中,试样混合物在( )中被分离。
A、检测器B、记录器C、色谱柱D、进样器7、液相色谱流动相过滤必须使用何种粒径的过滤膜( )A、0、5μmB、0、45μmC、0、6μmD、0、55μm8、在液相色谱法中,提高柱效最有效的途径就是( )A、提高柱温B、降低板高C、降低流动相流速D、减小填料粒度9、在液相色谱中,不会显著影响分离效果的就是( )A、改变固定相种类B、改变流动相流速C、改变流动相配比D、改变流动相种类10、在高效液相色谱仪中保证流动相以稳定的速度流过色谱柱的部件就是( )A、贮液器B、输液泵C、检测器D、温控装置二、判断题11、液相色谱柱没有方向区别,所以接色谱柱时无需根据流路方向来接。
( )12、液相色谱仪使用完后,如果管路中有缓冲盐,需要用水冲洗。
( )13、不建议使用乙醇代替甲醇作为常用的流动相,但可以作为低含量改性剂使用。
( )14、脱气后的溶剂放置时间长了,又会溶解新的气体,使用时需要重新处理。
( )15、乙腈作为流动相时,其体积浓度比例最好不超过75%。
( )16、液相使用人超过申请使用时间后,若后续无其她人使用,可以不用申请,继续使用。
( )17、流动相必须贴有配制标签,用水做流动相时需要每天进行更换。
液相色谱培训讲义(good)
液相色谱培训讲义(五)作者：转载自：发布日期：2007-5-22第五章输液泵第一节概述高压输液泵是液相色谱仪的关键部件，其作用是将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。
对于带在线脱气装置的色谱仪，流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。
输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。
1、对输液泵的基本要求流量准确可调。
对于一般的分析工作而言，流动相的流速在0.5～2mL/min，输液泵的最大流量一般为5～10mL/min。
输液泵的流量控制精度通常要求小于±0.5%。
输液泵必须能精确地调节流动相流量，这可以通过电子线路调节电机转速或冲程长短来实现。
流量的测定通常采用热脉冲流量计。
耐高压。
高效液相色谱柱是将很细颗粒（3～10μm粒径）的填料，在高压下填充到柱管中的，为了保证流动相以足够大的流速通过色谱柱，需要足够高的柱前压。
通常要求泵的输出压力达到30～60MPa的高压。
液流稳定。
输液泵输出的液流应无脉动，或配套脉冲抑制器。
泵的死体积小。
为了快速更换溶剂和适于梯度洗脱，泵的死体积通常要求小于0.5mL。
泵的结构材料应耐化学腐蚀。
2、输液泵分类输液泵按输出液恒定的因素分恒压泵和恒流泵。
对液相色谱分析来说，输液泵的流量稳定性更为重要，这是因为流速的变化会引起溶质的保留值的变化，而保留值是色谱定性的主要依据之一。
因此，恒流泵的应用更广泛。
输液泵按工作方式分为气动泵和机械泵两大类。
机械泵中又有螺旋传动注射泵、单活塞往复泵、双活塞往复泵和往复式隔膜泵。
几种输液泵的基本性能总结于表5-1。
表5-1几种高压输液泵的性能比较第二节各种泵一、活塞型往复泵活塞型往复泵是液相色谱仪中使用最广泛的一种恒流泵。
单活塞往复泵：如图5-1所示，在活塞柱的一端有一偏心轮，偏心轮连在电动机上，电动机带动偏心轮转动时，活塞柱则随之左右移动。
在活塞的另一端有上下两个单向阀（图5-3），各有1～2个蓝宝石或陶瓷球，由其起阀门的作用。
液相色谱培训计划
液相色谱培训计划一、培训目标：通过此培训，学员将掌握液相色谱原理、仪器操作、方法开发及数据分析等技能，提高实验室分析的水平，为工作和科研提供支持。
二、培训内容：1、液相色谱原理：介绍液相色谱的定义、分类、原理及应用领域。
2、色谱仪器操作：学习液相色谱仪器的结构、功能、操作流程、故障排除等内容。
3、色谱方法开发：了解液相色谱方法的优化、参数选择、条件调整及稳定性验证等技术。
4、色谱数据处理：掌握液相色谱数据的采集、处理、分析及结果解释的方法和技巧。
三、培训方式：1、理论讲解：由专业老师讲解液相色谱的原理、仪器操作、方法开发及数据处理等知识。
2、实验操作：安排学员进行实验操作，熟悉液相色谱仪器的使用，掌握方法开发和数据处理的技能。
3、案例分析：以真实案例为例，进行液相色谱方法开发及数据处理的案例分析，帮助学员理解和掌握实际操作技能。
4、讨论交流：组织学员进行讨论和交流，分享经验和问题解决方法，促进学习效果。
四、培训安排：1、时间安排：本次培训为期5天，每天8小时，按照理论讲解、实验操作、案例分析和讨论交流的方式进行。
2、地点安排：培训地点设在实验室或培训教室，根据实际情况确定。
3、培训人员：培训对象为实验室相关人员，包括初学者和有一定经验者，希望提高自己技能的人员均可报名。
4、培训费用：由公司承担培训费用，包括培训材料、实验用品及讲师费用等。
五、培训评估：1、考核方式：通过培训前的测试和培训结束后的考核，评估学员对液相色谱的理论知识和实际操作技能的掌握情况。
2、成绩评定：根据考核结果和培训表现，对学员进行成绩评定，并颁发结业证书。
3、培训总结：针对培训过程中的问题及建议，组织学员及时总结，并对下次培训做出改进和调整。
六、培训成果：1、学员将掌握液相色谱的基本原理、仪器操作、方法开发和数据分析技能。
2、学员能够熟练运用液相色谱仪器进行实验操作，提高实验分析的准确性及效率。
3、学员能够根据实际需要制定和优化液相色谱方法，提高实验室分析技术水平。
液相培训试题
高效液相色谱仪理论培训考试姓名：得分：选择题：（每题3分，共30分）1、在液相色谱法中，提高柱效最有效的途径是（）A.提高柱温B.降低板高C.降低流动相流速D.减小填料粒度2、在液相色谱中, 为了提高分离效率, 缩短分析时间, 应采用的装置是( )A. 高压泵B. 梯度淋洗C. 贮液器D. 加温3、在液相色谱中, 某组分的保留值大小实际反映了哪些部分的分子间作用力？（）A. 组分与流动相B. 组分与固定相C. 组分与流动相和固定相D. 组分与组分4、在液相色谱中, 通用型检测器是 ( )A.示差折光检测器B.极谱检测器C.荧光检测器D.电化学检测器5、液相色谱流动相过滤必须使用何种粒径的过滤膜？（）A.0.5μmB.0.45μmC.0.6μmD.0.55μm6、下列用于高效液相色谱的检测器，（）检测器不能使用梯度洗脱。
A. 紫外检测器B. 荧光检测器C. 蒸发光散射检测器D. 示差折光检测器7、高效液相色谱仪与气相色谱仪比较增加了（）A.恒温箱B.进样装置C.程序升温D.梯度淋洗装置8. 在液相色谱法中，按分离原理分类，液固色谱法属于（）。
A、分配色谱法B、排阻色谱法C、离子交换色谱法D、吸附色谱法9、液相色谱适宜的分析对象是（）A 低沸点小分子有机化合物B 高沸点大分子有机化合物C 所以有机化合物D 所有化合物10、如果样品比较复杂，相邻两峰间距离太近或操作条件不易控制稳定，要准确测定保留值是有一定的困难时，可选择一下方法（）定性。
A 利用相对保留值数据定性B 加入已知物增加峰高的办法定性C 利用文献保留值数据定性D 与化学方法配合进行定性填空题（每空2分，共30分）1、在反相色谱中（）组分先出峰。
2、高效液相色谱仪基本由( )，（），（），（）和（）组成。
3、无论是定性鉴别还是定量分析，均要求待测峰与其他峰、内标峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。
除另有规定外，定量分析时分离度应大于（）。
高效液相色谱法培训课件
进样操作不当
转动进样阀时应一次转到位，不能过慢或 停顿，否则易造成裂峰。
样品溶剂与流动相成分不匹配
样品溶剂与流动相成分不匹配，造成前沿 峰或倒峰。如样品用纯甲醇作溶剂，而流 动相中甲醇比例很低，这样易出现前沿峰， 改变样品溶剂成分或比例，使醇-水比例接 近于流动相。
计
色谱柱
色谱柱有柱管和固定相组成，柱管用不 锈钢制成，柱长10～30cm，内径2～ 6mm，以4.6mm的内径最常用。
根据键合基团极性不同，化学键合相可 分为非极性、中等极性和极性三类。
常用色谱柱有：
ODS柱、氰基柱、氨基柱等
非极性键合相
表面基团为非极性烃基，如C18 、C8等， 主要用于RP色谱。 C18是最常用的非极 性键合相，将十八烷基氯硅烷与硅胶表 面的硅醇基经多步反应而成。
样品纯度差——有微小的颗粒堵塞管路。 可用滤膜过滤样品后再进样。
样品浓度高——连续进样，造成过载。
如果样品吸收度不是太低，使样品浓度在 1mg/ml以下较适宜。
流动相中缓冲液浓度过高，有机相比例大—— 在色谱过程中堵塞管路，析出的盐结晶还磨损 泵、进样阀密封圈造成漏液。
缓冲液浓度一般控制在20mmol以下较适宜， 测定完毕后必须及时用水充分冲洗。
倒
前沿峰
峰
结果不能重现
表现为同一样品溶液连续进样所得峰面积 相差大，引起这种情况时，可从以下几 方面来查找原因：
泵、进样阀、管路漏液——造成峰面 积变化。
检测器灵敏度改变——如果同一样品 两次进样峰面积相差10倍或更大倍数， 则最可能的原因是检测器的灵敏度被 无意中改变，软件的灵敏度改变不会 影响峰面积的积分数值。
离子色谱是由经典的离子交换色谱发 展起来的一种液相色谱技术，利用物 质在离子交换柱上迁移的差异而达到 分离，用于亲水性阴阳离子的测定。 根据是否采用抑制柱，可分为抑制型 离子色谱和非抑制型离子色谱。
高效液相色谱法培训考核试卷.
考核及格标准：80分,且带*的必须正确。
精密仪器组培训考核试题集部门：姓名：成绩：一、填空题（66分，每题6分）1、流动相的pH值应控制在之间，当色谱系统中需使用pH值大于8的流动相时，应选用；当色谱系统中需使用pH值小于2的流动相时，应选用。
2、剩余检品按月存放，暂存期至少为个月。
3、HPLC法中，除另有规定外，流速一般为。
4、对照品或标准品自冰箱中取出后，必须放置至，然后才可以在分之一天平上称量，新开启的在使用后，必须标注。
5、对照或标准溶液需要保存的，其有效性必须经，确定后方可使用。
6、在系统适用性试验中：分离度除另有规定外，待测组分与相邻共存物之间的分离度应；拖尾因子除另有规定外，应在之间。
7、对于要求梯度洗脱的样品，在样品分析前必须进行，以辨认杂质峰，如洗脱过程中基线漂移较大，亦可对色谱图进行处理。
8、配制好的流动相应通过 um滤膜滤过，用前必须，否则容易在系统内，影响泵的工作、、检测器的灵敏度以及等。
对于规定pH值的流动相，应使用进行调节，除另有规定外，偏差一般不超过 pH单位。
*9、当两份平行测试样品检验结果一份合格、另一份不合格时，不得将其，应视为。
两份平行测试样品检验结果相对偏差应。
10、在出现检验结果、检验结果时应启动OOS。
11、配制好的流动相应及时记录，记录应包括：、、、、等，配制好的流动相应储存于中，避免直射，有效期一般为。
*12、外标法求组分含量计算公式：。
*13、内标法求组分含量计算公式：。
14、相对偏差计算公式：。
*15、相对标准偏差计算公式：。
16、调整流动相组分比例时，以组分比例较低者（小于或等于50%）相对改变量不超过 %且绝对改变量不超过 %为限，如 %相对改变的数值超过10%，则改变量以 %为限。
17、一般情况下，对于反相色谱柱，如使用缓冲液或含盐溶液作为流动相，在试验结束后，应用 %的甲醇/乙腈-水溶液冲洗，使色谱柱内的盐完全溶解洗脱出。
如色谱柱需长期保存，反相柱可以贮存于中，并将色谱柱两端，以免干燥，保存。
2024年waters2695现场培训教程
Waters2695现场培训教程一、引言Waters2695是一种高效液相色谱仪，广泛应用于制药、食品、环保、化工等领域。
为了帮助用户更好地了解和掌握Waters2695的使用方法，提高实验技能，我们特此编写了本现场培训教程。
本教程将详细介绍Waters2695的基本原理、操作步骤、维护保养以及常见问题解答，旨在为用户提供全面、系统的培训。
二、Waters2695基本原理1.高效液相色谱（HPLC）简介高效液相色谱（HighPerformanceLiquidChromatography，简称HPLC）是一种以液体为流动相的色谱分离分析方法。
它具有分离效能高、灵敏度高、应用范围广等优点，已成为化学、生物、医药等领域的重要分析手段。
2.Waters2695系统组成（1）输液泵：负责输送流动相，保证流动相的稳定性和准确性。
（2）进样器：用于自动进样，提高实验的准确性和重复性。
（3）色谱柱：用于分离样品中的各个组分。
（4）检测器：检测分离后的组分，获取实验数据。
（5）数据处理系统：用于处理和分析实验数据。
三、Waters2695操作步骤1.开机及初始化（1）打开Waters2695电源开关，启动仪器。
（2）检查仪器自检是否正常，确保仪器处于正常工作状态。
（3）设定流动相比例、流速等参数。
2.色谱柱平衡（1）将色谱柱装在仪器上，连接流动相。
（2）开启输液泵，使流动相缓慢通过色谱柱，直至色谱柱平衡。
3.样品制备与进样（1）根据实验需求，制备样品溶液。
（2）使用进样器自动进样，进样量根据实验需求设定。
4.色谱分离（1）开启输液泵，使流动相携带样品溶液进入色谱柱。
（2）根据实验需求，调整流动相比例、流速等参数，实现样品的分离。
5.检测与数据处理（1）样品分离后，通过检测器获取实验数据。
（2）使用数据处理系统对实验数据进行处理和分析。
6.关闭仪器（1）实验结束后，关闭输液泵和检测器。
（2）排空色谱柱中的流动相。
（3）关闭Waters2695电源开关。
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滤膜类型：
聚四氟乙烯滤膜： 适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。 醋酸纤维滤膜： 不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶液，推荐用于蛋白质 和其相关样品。 尼龙66滤膜： 适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸,70%乙醇、 二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。 再生纤维素滤膜： 具有蛋白吸收低，同样适用水溶性样品和有机溶剂。
输液泵 溶剂
进样器
色谱柱 柱温箱
检测器
数据处理
HPLC Business Dept Shimadzu Corporation
流动相
流动相选择注意事项： 纯度：采用“ HPLC ”级溶剂 避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶 剂 对试样有适宜的溶解度 溶剂粘度要小 与检测器相匹配 流动相配制时的顺序
*所有单元都既可做高压梯度又可做低压梯度
HPLC Business Dept Shimadzu Corporation
等度洗脱
输液泵
进样器 柱温箱 检测器
色谱柱
单一或混合溶剂
HPLC Business Dept Shimadzu Corporation
梯度洗脱
A A泵
B 浓度
进样器
色谱柱
检测器
柱温箱
HPLC Business Dept Shimadzu Corporation
溶 剂 等 级
水的等级
纯化水 蒸馏水 去离子水
吸 光 率
去离子水
纯化水
波长 (nm)
因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高
纯化水中去除了无机和有机的污染物
HPLC Business Dept Shimadzu Corporation
-Si-CH2CH2CH2CN -Si-CH2CH2CH2NH2
Si Silica gel
HPLC Business Dept Shimadzu Corporation
-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)
Si Modified Si
反相HPLC色谱柱
C18 (ODS) type C8 (octyl) type C4 (butyl) type Phenyl type TMS type Cyano type
输液泵控制方式： 恒流控制 恒压控制
HPLC Business Dept Shimadzu Corporation
柱Байду номын сангаас往复泵
马达和凸轮
泵头
单向阀
柱塞杆 柱塞杆密封圈
HPLC Business Dept Shimadzu Corporation
10 -100uL
柱塞往复泵
优点
压力脉动小
易于更换溶剂
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高压/低压梯度系统
高压梯度 低压梯度
混合器
低压梯度比例阀
HPLC Business Dept Shimadzu Corporation
脱气机
高压/低压梯度系统
高压梯度系统
梯度准确度好 系统复杂 (需两台或三台泵)
低压梯度系统
Non-polar property -Si-C18H37
Si
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反 相 色 谱
色谱柱 : 溶剂 :
非极性
极性
水 / 甲醇 / 乙腈
HPLC Business Dept Shimadzu Corporation
液相色谱流程图
返回
HPLC Business Dept Shimadzu Corporation
比例色谱
280nm
220 nm
ratio 280/220 返回
HPLC Business Dept Shimadzu Corporation
波长扫描
返回
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二极管阵列检测器（SPD－M10AVP） 二十一世纪标准紫外检测器 色谱信息： 保留时间 常规紫外检测器
紫外光谱
二极管阵列检测器
HPLC Business Dept Shimadzu Corporation
二极管阵列检测器
样品池
光栅
D2 / W灯
每一单元可检测一个 波长下的吸光度
二极管阵列（512个单元）
甲醇
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乙睛
正己烷
溶剂前处理
过滤：0.45um或更小孔径滤膜
目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱 柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。
过滤膜种类
水系过滤膜
有机系过滤膜
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分析结果重现性好
提高柱效
降低柱压
保证检测稳定性
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色谱柱
ODS柱的使用注意点：
1）柱压低于150kgf/cm2（15cm色谱柱） 2）柱温在40℃左右，最高使用温度为50℃ 3）流动相PH使用范围为2～7.5
电化学检测器（L-ECD）
质谱检测器（MS） 蒸发光散射检测器（ELSD）
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紫外可见检测器
紫外可见检测器
原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择 性吸收 定量基础：Lambert-Beer定律，A＝KCL 优点：1）对温度和流速变化不敏感
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溶剂前处理
脱气
目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气
泡 一般混合溶剂中能容纳的空气量往往要比单个 溶剂所能容纳的空气总量要小 气泡对测定的影响：
1）柱压波动，流量偏小
2）基线波动
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微量分析、梯度洗脱
都经过蒸馏和0.45um的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒)
优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂 HPLC级经过0.22um的过滤,且除去有紫外吸收的杂质
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溶 剂 等 级
分析纯级和 HPLC 级溶剂的吸光度比较图
系统简单 需在线脱气机 存在时间滞后效应
返回
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进样器
自动进样器
手动进样器
原理：（六通阀） 注入方式： 1）全量注入 2）部分注入
返回
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手动进样器的原理图
梯度洗脱
95%
30%
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MeOH
浓 度
梯度洗脱：
优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和 提高分离精度
注意事项：
溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差 梯度混合的溶剂互溶性要好 梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测 器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流 动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）
HPLC Business Dept Shimadzu Corporation
液相色谱按两相极性不同分为:
正相色谱
反相色谱
化合物保留时间随流动相配比的变化 不同极性的化合物出峰顺序
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正相HPLC色谱柱
硅胶型 氰基型 氨基型 糖类分析 二醇基型 蛋白质分析
液相色谱基础知识
HPLC Business Dept Shimadzu Corporation
一、色谱起源
石油醚
色谱
组分
色素
碳酸钙颗粒
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液相色谱基础知识
液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法
适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的 分析 流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用
2）可用于梯度分析
缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质
HPLC Business Dept Shimadzu Corporation
紫外可见检测器
光栅
样品池
l
Ein
Eout
光电管
Ein
Ein
参比池
光电管
D2 / W 灯
HPLC Business Dept Shimadzu Corporation
岛津VP系列紫外检测器功能
样品过滤头的类型：
30mm内径： 适用于大进样量的过滤，由0.22µ m和0.45µ m两种规格,材料有 纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品体积少于50µ l。 13mm内径： 适用于范围广的过滤，由0.22µ m和0.45µ m两种规格,材料为纤 维素。 3mm内径： 适用于小进样量的过滤，由0.22µ m和0.45µ m两种规格。处理 样品体积为7µ l。
缺点
需要更换柱塞杆密封圈
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岛津VP系列输液泵