重亚硫酸盐测序技术介绍
第三代测序技术的三种技术平台介绍
第三代测序技术的三种技术平台介绍随着生物学的发展，人们对基因的功能研究更加透彻，为了进一步研究和改造基因的目的需要详细了解生物的基因组全序列，因为DNA序列是改造基因的基础，这就要求具有高效的DNA测序技术。
DNA测序技术到目前为止已经发展到了第三代测序技术。
最早的Sanger测序在人类基因组计划中立下赫赫战功，但也给基因组测序贴上了数亿美元的价格标签，让人生畏。
这两年发展迅猛的第二代测序仪——Illumina的Genome Analyzer、Roche 454的GS系列以及ABI的SOLiD系统——让人类基因组重测序的费用蹭地降低到10万美元以下。
现在，能对单个DNA分子进行测序的第三代测序仪也加入到这场比赛中，让竞争更加激烈。
目前，第三代测序主要有三种技术平台。
两种通过掺入并检测荧光标记的核苷酸，来实现单分子测序。
Helicos的遗传分析系统已上市，而Pacific Biosciences准备在明年推出单分子实时(SMRT)技术。
第三种Oxford Nanopore的纳米孔(nanopore)测序还尚未有推出的时间表，但有可能是这三种当中最便宜的。
纳米孔测序的优势在于它不需要对DNA进行标记，也就省去了昂贵的荧光试剂和CCD照相机。
最近，Oxford Nanopore T echnologies的Hagan Bayley及他的研究小组正致力于改善纳米孔。
根据他们之前的工作，他们以a-溶血素来设计纳米孔，并将环式糊精共价结合在孔的内侧(下图)。
当核酸外切酶消化单链DNA后，单个碱基落入孔中，它们瞬间与环式糊精相互作用，并阻碍了穿过孔中的电流。
每个碱基ATGC以及甲基胞嘧啶都有自己特有的电流振幅，因此很容易转化成DNA序列。
每个碱基也有特有的平均停留时间，它的解离速率常数是电压依赖的，+180 mV的电位能确保碱基从孔的另一侧离开。
a-溶血素纳米孔(剖面图)以及共价结合的环式糊精(浅蓝色)瞬间结合落入孔中的碱基(红色)。
(完整版)甲基化检测方法(亚硫酸氢盐修饰后测序法)
甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰后测序法）第一部分基因组DNA的提取。
这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。
DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。
此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。
因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。
使用两者的细节：1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。
否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。
两者均于-20度保存。
验证提取DNA的纯度的方法有二：1：紫外分光光度计计算OD比值；2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。
我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。
第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。
1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；3：42℃水浴30min；水浴期间配制：4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）5：3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。
这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。
PH一定要准确为5.0。
加520ul至上述水浴后溶液中。
6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。
7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。
8：50℃避光水浴16h。
一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am 以后收，时间上很合适。
Illumina_HiSeq_2000-BGI
Illumina HiSeq 2000Illumina Hiseq 2000测序系统是一种高通量测序技术，其测序原理和Illumina Genome Analyzer II 测序系统相似，仍然是采用可逆终止法的边合成边测序技术。
这种测序技术通过将基因组DNA的随机片断附着到光学透明的表面，这些DNA片断通过延长和桥梁扩增，形成了具有数以亿计cluster的Flowcell，每个cluster具有约1000拷贝的相同DNA模板，然后用4种末端被封闭的不同荧光标记的碱基进行边合成边测序。
这种新方法确保了高精确度和真实的一个碱基接一个碱基的测序，排除了序列方面的特殊错误，能够测序同聚物和重复序列。
这种技术避免了像传统测序技术那样耗费大量人力、物力进行片段克隆、转化、质粒抽提等繁琐的操作。
而且多种样品制备方法使此技术有一系列的广泛应用，包括基因表达、小RNA的发现，蛋白质核酸相互作用等。
HiSeq 2000测序系统是前所未有的高通量测序系统，不仅提高测序通量，降低了成本，而且具有创新的用户体验。
预先配置、即插即用的试剂，简单的流动槽上样，简单的触摸屏用户界面，这种人机交互设计特征以及轻松的测序流程，使操作更简单，更方便。
HIseq 2000 cBotFlowcell Cluster Image测序实验流程：•基因组DNA打断；• DNA 末端修复；•连接接头；• DNA片段杂交到 Flowcell上；• DNA模板延伸，桥式扩增；• Flowcell制备；• SBS（synthesis-based-sequenceing）边合成边测序；• Hiseq上自动化测序；•图片处理，实时分析，碱基识别；•图片实时分析；•变异分析；•总结报告；技术特点：•每个run平均达到200G的数据通量，读长为2 x 100bp；•每个run可同时运行2张Flow cell, 且每张Flow cell 可进行上下两面扫描；•采用TDI 线性扫描技术，4个相机同时扫描；•预先配置、即插即用的试剂，简单的流动槽上样，触摸屏式的用户界面；•低成本：单次运行即可以～30倍的覆盖度同时对两个人类基因组样品进行测序，或同时绘制200个基因表达谱。
重亚硫酸盐测序技术介绍PPT课件
未来重亚硫酸盐测序技术将进一步优化测序精度，降低测序错误率， 提高数据分析的可靠性。
测序成本不断降低
随着技术的成熟和规模化生产，重亚硫酸盐测序技术的成本将逐渐 降低，使得更多人能够享受到基因测序的益处。
在生物医药领域的应用前景
疾病诊断与预测
重亚硫酸盐测序技术可用于检测与特定疾病相关的基因变 异，从而为疾病的早期诊断和预测提供依据。
其他应用领域
进化生物学研究
利用重亚硫酸盐测序技术，可以对不同物种的基因组 进行比较分析，研究物种进化关系和演化历程。
药物研发
通过重亚硫酸盐测序技术，可以对药物作用靶点进行 精准定位，为新药研发提供有力支持。
生物多样性研究
利用重亚硫酸盐测序技术，可以研究生物多样性，包 括物种分类、种群结构等。
03
比较与选择
重亚硫酸盐测序技术
在DNA序列分析中，重亚硫酸盐测序技术是一种基于连接反应和重亚硫酸盐转化的序列 特异性扩增技术。它具有高灵敏度、高特异性和可检测突变丰度的优点，因此在基因突变 筛查、基因分型和突变体鉴定等领域具有广泛的应用价值。
与其他测序技术的比较
与第二代测序技术相比，重亚硫酸盐测序技术的通量更高，能够检测低丰度的突变；与第 三代测序技术相比，重亚硫酸盐测序技术的准确性更高，适用于对准确性要求较高的应用 。
代表性技术
基于PCR扩增和光学检测的Sanger测序法。
特点
准确性高，但通量低，测序长度短，主要用于完成人类基因组计划等基础研究。
第三代测序技术
代表性技术
基于纳米孔的单分子测序技术（如PacBio RS II）和合成式测序技术（如Illumina MiSeq）。
特点
高通量、长读长，但准确性相对较低，主要用于临床诊断、基因组组装和基因表达分析 等应用。
Illumina_HiSeq_2000-BGI
Illumina HiSeq 2000Illumina Hiseq 2000测序系统是一种高通量测序技术，其测序原理和Illumina Genome Analyzer II 测序系统相似，仍然是采用可逆终止法的边合成边测序技术。
这种测序技术通过将基因组DNA的随机片断附着到光学透明的表面，这些DNA片断通过延长和桥梁扩增，形成了具有数以亿计cluster的Flowcell，每个cluster具有约1000拷贝的相同DNA模板，然后用4种末端被封闭的不同荧光标记的碱基进行边合成边测序。
这种新方法确保了高精确度和真实的一个碱基接一个碱基的测序，排除了序列方面的特殊错误，能够测序同聚物和重复序列。
这种技术避免了像传统测序技术那样耗费大量人力、物力进行片段克隆、转化、质粒抽提等繁琐的操作。
而且多种样品制备方法使此技术有一系列的广泛应用，包括基因表达、小RNA的发现，蛋白质核酸相互作用等。
HiSeq 2000测序系统是前所未有的高通量测序系统，不仅提高测序通量，降低了成本，而且具有创新的用户体验。
预先配置、即插即用的试剂，简单的流动槽上样，简单的触摸屏用户界面，这种人机交互设计特征以及轻松的测序流程，使操作更简单，更方便。
HIseq 2000 cBotFlowcell Cluster Image测序实验流程：•基因组DNA打断；• DNA 末端修复；•连接接头；• DNA片段杂交到 Flowcell上；• DNA模板延伸，桥式扩增；• Flowcell制备；• SBS（synthesis-based-sequenceing）边合成边测序；• Hiseq上自动化测序；•图片处理，实时分析，碱基识别；•图片实时分析；•变异分析；•总结报告；技术特点：•每个run平均达到200G的数据通量，读长为2 x 100bp；•每个run可同时运行2张Flow cell, 且每张Flow cell 可进行上下两面扫描；•采用TDI 线性扫描技术，4个相机同时扫描；•预先配置、即插即用的试剂，简单的流动槽上样，触摸屏式的用户界面；•低成本：单次运行即可以～30倍的覆盖度同时对两个人类基因组样品进行测序，或同时绘制200个基因表达谱。
重亚硫酸盐测序技术介绍
DNA甲基化含义 DNA甲基化含义
在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷 在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷 酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5 酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5－甲基胞 嘧啶，这常见于基因的5'-CG-3'序列。大多数脊椎 嘧啶，这常见于基因的5'-CG-3'序列。大多数脊椎 动物基因组DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要 动物基因组DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要 集中在基因5 集中在基因5＇端的非编码区，并成簇存在。甲基 化位点可随DNA的复制而遗传，因为DNA复制后， 化位点可随DNA的复制而遗传，因为DNA复制后， 甲基化酶可将新合成的未甲基化的位点进行甲基 化。DNA的甲基化可引起基因的失活。 化。DNA的甲基化可引起基因的失活。 DNA甲基化主要形成5－甲基胞嘧啶（5 mC） DNA甲基化主要形成5－甲基胞嘧啶（5-mC） 和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7 和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7－甲基鸟嘌 呤（7 mG） 呤（7-mG）
启动子的CpG岛 启动子的CpG岛
CpG岛主要位于基因的启动子和第一 CpG岛主要位于基因的启动子和第一 外显子区域，约有60%以上基因的启动 外显子区域，约有60%以上基因的启动 子含有CpG岛。GC含量大于50%,长度 子含有CpG岛。GC含量大于50%,长度 超过200bp。在启动子（promotor）或 超过200bp。在启动子（promotor）或 “起始”区域周围，甲基化经常被抑 起始” 制。这些区域包含浓度相对较高的 CpG对，与此段区域对应的染色体区 CpG对，与此段区域对应的染色体区 段一起被称作CpG岛。CpG岛与56%的 段一起被称作CpG岛。CpG岛与56%的 基因编码有关。
全基因组重亚硫酸盐测序和简化代表性重亚硫酸盐测序分析流程
#流程大放送#WGBS和RRBS测序分析流程介绍WGBS全称Whole Genome Bisulfite Seuqneicng，即全基因组重亚硫酸盐测序。
该方法通过Bisulfite处理，将原基因组中未发生甲基化的C碱基转换成U的同时，保留所有甲基化C 的碱基不发生转变，从而帮助科研人员识别发生甲基化的CpG位点。
该种测序技术适用于绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱。
RRBS全称Reduced Representation Bisulfite Sequencing，即简化代表性重亚硫酸盐测序。
该方法在Bisulfite处理前，使用MspI（该酶的酶切位点为CCGG）酶切对样本进行处理，去除低CG含量DNA片段，从而使用较小的数据量富集到尽可能多的包含CpG位点的DNA片段。
相比于WGBS技术，RRBS是一种准确、高效且经济的DNA甲基化研究方法，通过酶切，并进行Bisulfite测序，该方法在保证DNA甲基化状态检测的高分辨率的同时提升测序数据的高利用率。
该项技术可用于以下研究1、处于特定时期或特定处理条件下的样本中，研究样本中染色体高精度DNA甲基化模式；2、比较不同细胞、组织、样本间的高精度DNA甲基化修饰模式的差异；3、疾病样本中，与疾病发生发展相关的高精度DNA甲基化表观遗传机理研究和相关高精度DNA甲基化位点分子标志的探索性研究。
数据处理和分析流程图分析结果示例图片展示示例图1 样本中各区域DNA甲基化水平信息统计和样本间差异DNA甲基化分析结果展示[1]示例图2 差异DNA甲基化区域内转录因子基序识别[1]示例图3 DNA甲基化水平变化与基因表达水平变化的关联性分析[1]示例图来源文献[1]. Ng, C.W., et al., Extensive changes in DNA methylation are associated with expression of mutant huntingtin. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013. 110(6): p. 2354-9.。
DNA重亚硫酸盐转化
> 85% 平 均 ： 200-2000 bp 峰值 800 bp 离心管
> 85% 平 均 ： 200-2000 bp 峰值 800 bp 离心管
图 1 重亚硫酸盐处理后胞嘧啶（cytosine）转化为尿嘧啶（uracil）
图 2 重亚硫酸盐处理将胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U） ，5-甲基胞嘧啶（5-mC）保持不变； 再经 PCR 扩增，U 转换为胸腺嘧啶（T） ，而 5-mC 重新恢复为 C，以此可将基因中的 C 与 5-mC 区别开。
产品名称
货号 研发代码 用途
DNA 产品关键词 Illumina 工 作流程兼容 最稳定可靠 重亚硫酸盐 测序、 NGS 和 各种 MSP 的 理想选择 DNA 50 pg < 2 hours 8-20 μl 99.9% √ Illumina 工 作流程兼容 热循环变性 液体重亚硫 酸盐转化试 剂 DNA 100 pg 1 hour 8-20 μl 99.9% √ 反应快速 real-time MSP 的理想 选择 测序最佳选 择 DNA 200 pg 30 minutes 10-20 μl 99.9% √ 省 略 了 DNA 分 离 的步骤 DNA 含量 低样品的理 想选择 细胞、 组织、 血液 100 个细胞， 1 μl 血液 < 3 hours 8-20 μl 99.9% √ Illumina 工作 流程兼容 流线型高通 量分析 专为大量样 品或者自动转 化设计 DNA < 10 ng < 1 hour 20 minutes 20 μl 99.9% √
起始材料 最低 DNA 用 量 转化所需总 时间 洗脱体积 转化效率 脱磺酸基作 用/清除 回收率 转化后 DNA 片段尺寸 储存管
> 75% 平 均 ： 200-2000 bp 峰值 800 bp 离心管
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6、意志坚强的人能把世界放在手中像 泥块一 样任意 揉捏。 2020年 12月12 日星期 六上午 2时9分 17秒02 :09:172 0.12.12
SSCP
将亚硫酸氢盐处理和单链构 象多态性 PCR(PCR．SSCP)结合起来，设计了针 对 转化后DNA序列的引物，同时扩增 未甲基化和甲 基化的DNA，由此产生 的两种不同的扩增产物可以 通过SSCP 区分。此方法可方便地应用于任何序 列的甲基化状态的分析，能对甲基化 的等位基因进行半定量，获得甲基化 和未甲基化等位基因的比例；并且可 以提示甲基化状态的不均匀性。
CpG岛的甲基化
CpG岛经常出现在真核生物的 house-keeping基因的调控区，在其 它地方出现时会由于CpG中的C易 被甲基化而形成5'-甲基胞嘧啶，脱 氨基后形成胸腺嘧啶，由于T本身 就会存在于DNA中，因此不易被 修复，所以被淘汰。故CpG在基因 组中是以岛的形式分布的。
基本原理
重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱 氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变， 行PCR扩增(引物设计时尽量避免有CpG，以免受甲 基化因素的影响)所需片段，则尿嘧啶全部转化成 胸腺嘧啶。最后，对PCR产物进行测序，并且与未 经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。 此方法一种可靠性及精确度很高的方法，能明确目 的片段中每一个CpG位点的甲基化状态。在寻找有 意义的关键性CpG位点上，有其他方法无法比拟的 优点。
重亚硫酸氢盐直接测序技术的优缺点
优点：测序法以CpG岛两侧不含CpG点的一段序 列为引物配对区，能够同时扩增出甲基化和非甲 基化靶序列。
缺点：它的不足是耗费时间和耗资过多，至少要 测序10个以上的克隆才能获得可靠数据，需要大 量的克隆及质粒提取测序，过程较为繁琐、昂贵。 在甲基化变异细胞占少数的混杂的样品中，由于 所用链特异性PCR不是特异扩增变异靶序列，故 灵敏度较MSP差。
重亚硫酸氢盐直接测序技术介绍
DNA甲基化含义
在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷 酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5－甲基胞 嘧啶，这常见于基因的5'-CG-3'序列。大多数脊椎 动物基因组DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要 集中在基因5＇端的非编码区，并成簇存在。甲基 化位点可随DNA的复制而遗传，因为DNA复制后， 甲基化酶可将新合成的未甲基化的位点进行甲基 化。DNA的甲基化可引起基因的失活。
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7、最具挑战性的挑战莫过于提升自我 。。20 20年12 月上午 2时9分 20.12.1 202:09 December 12, 2020
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8、业余生活要有意义，不要越轨。20 20年12 月12日 星期六 2时9分 17秒02 :09:171 2 December 2020
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酶切法同亚硫酸氢盐联合法
酶切法：限制性酶切后选用对特 异DNA片段甲 基化序列敏感的限制性内切酶(酶 切位点与甲基 化位点不重叠)进行酶切后，以待测 甲基化位点 外侧序列为扩增起始点进行PCR。该 DNA片段 若存在甲基化，将会有扩增产物出现；若 无甲 基化，则不会有任何片段扩增出现。当用甲基 化不敏感的内切酶消化产物作为PCR模板时，不 论 该部位是否甲基化都不应有片段扩出。PCR 法比 Southem法更为敏感，但只能检测甲基化敏 感的限 制性位点的CpG甲基化，且DNA必须酶 切完全，否 则会出现假阳性。
重亚硫酸直接测序法对启动子测序 的应用
CpG岛不仅是基因的一种标志，而且还参 与基因表达的调控和影响染色质的结构。 启动子的甲基化能抑制基因的表达。
研究证明启动子区的高甲基化导致抑癌基 因失活是人类肿瘤所具有的共同特征之一， 而且这种高甲基化是导致抑癌基因失活的 又一个机制。
谢谢！
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1、有时候读书是一种巧妙地避开思考 的方法 。20.1 2.1220. 12.12Sa turday, December 12, 2020
DNA甲基化主要形成5－甲基胞嘧啶（5-mC） 和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7－甲基鸟嘌 呤（7-mG）
启动子的CpG岛
CpG岛主要位于基因的启动子和第一 外显子区域，约有60%以上基因的启动 子含有CpG岛。GC含量大于50%,长度 超过200bp。在启动子（promotor）或 “起始”区域周围，甲基化经常被抑 制。这些区域包含浓度相对较高的 CpG对，与此段区域对应的染色体区 段一起被称作CpG岛。CpG岛与56%的 基因编码有关。
酶切法同亚硫酸氢盐联合法
联合亚硫酸氢盐限制分析(combined bisul— rite restriction analysis，C0BRA) 亚硫酸氢钠可以使 DNA未甲基化的C经脱氨基作用转化为u，通过随 后的PcR，u将转化为T，但亚硫酸氢钠对已发生 甲基化的C无上述转化作用。故此，DNA经亚硫 酸氢钠处理后，进行限制性酶切CpG位点时，限 制性位点的保留与否能反应该DNA片段是否发生 甲基化。经电泳后电泳条带长度和强度差异观察， 可以分析DNA甲基化状态和甲基化程度。COBRA 集使用方便，定量准确和与石蜡切片良好的兼容 性三 种特色于一身，能定量检测微量DNA样品特 定基 因位点的甲基化状态，但由于涉及PCR和限 制性酶 的使用，通常只能分析一个特定的序列
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2、阅读一切好书如同和过去最杰出的 人谈话 。02:0 9:1702: 09:1702 :0912/ 12/2020 2:09:17 AM
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3、越是没有本领的就越加自命不凡。 20.12.1 202:09: 1702:0 9Dec-20 12-Dec-20
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4、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的 错儿。 02:09:1 702:09: 1702:0 9Saturday, December 12, 2020