DNA测序原理和方法.

DNA测序原理和方法

DNA序列测定分手工测序和自动测序，手工测序包括Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学降解法。自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。美国PE ABI公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA测序仪，其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。本实验介绍的是ABI PRISM 310型DNA测序仪的测序原理和操作规程。

【原理】ABI PRISM 310型基因分析仪(即DNA测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基的3''''末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。

它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。PE公司还提供凝胶高分子聚合物，包括DNA测序胶(POP 6)和GeneScan胶(POP 4)。这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集，分析和仪器运行等软件。它使用最新的CCD摄影机检测器，使DNA 测序缩短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析为10～40min。

由于该仪器具有DNA测序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，临床上可除进行常规DNA测序外，还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。【试剂与器材】

1．BigDye测序反应试剂盒主要试剂是BigDye Mix，内含PE专利四色荧光标记的ddNTP 和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS，反应缓冲液等。

2．pGEM-3Zf (+) 双链DNA对照模板0.2g/L，试剂盒配套试剂。

3．M13(-21)引物TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2μmol/L，即3.2pmol/μl，试剂盒配套试剂。

4．DNA测序模板可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA等。模板浓度应调整在PCR 反应时取量1μl为宜。本实验测定的质粒DNA，浓度为0.2g/L，即200ng/μl。

5．引物需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物，配制成3.2μmol/L，即3.2pmol/μl。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。

6．灭菌去离子水或三蒸水。

7．0.2ml或和0.5ml的PCR管盖体分离，PE公司产品。

8．3mol/L 醋酸钠(pH5.2) 称取40.8g NaAc·3H2O溶于70ml蒸馏水中，冰醋酸调pH至5.2，定容至100ml，高压灭菌后分装。

9．70%乙醇和无水乙醇。

10．NaAc/乙醇混合液取37.5ml无水乙醇和2.5ml 3mol/L NaAc混匀，室温可保存1年。11．POP 6测序胶ABI产品。

12．模板抑制试剂(TSR) ABI产品。

13．10×电泳缓冲液ABI产品。

14．ABI PRISM 310型全自动DNA测序仪。

15．2400型或9600型PCR仪。

16．台式冷冻高速离心机。

17．台式高速离心机或袖珍离心机。

【操作步骤】

1．PCR测序反应

(1) 取0.2ml的PCR管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂：

所加试剂测定模板管标准对照管

BigDye Mix 1μl 1μl

待测的质粒DNA 1μl －

pGEM-3Zf (+) 双链DNA －1μl

待测DNA的正向引物1μl －

M13(-21)引物－1μl

灭菌去离子水2μl 2μl

总反应体积5μl，不加轻矿物油或石蜡油，盖紧PCR管，用手指弹管混匀，稍离心。(2) 将PCR管置于9600或2400型PCR仪上进行扩增。98℃变性2min后进行PCR循环，PCR循环参数为96℃10s，50℃5s，60℃4min，25个循环，扩增结束后设置4℃保温。2．醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物

(1) 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5ml EP管中。

(2) 加入25μl醋酸钠/乙醇混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀DNA。12 000r/min于4℃离心30 min，小心弃上清。

(3) 加70%(V/V)的乙醇50μl洗涤沉淀2次。12 000r/min于4℃离心5min，小心弃上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10～15min。

3．电泳前测序PCR产物的处理。

(1) 加入12μl的TSR于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解DNA沉淀，稍离心。

(2) 将溶液转移至盖体分离的0.2ml PCR管中，稍离心。

(3) 在PCR仪上进行热变性(95℃2min)，冰中骤冷，待上机。

4．上机操作按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。仪器将自动灌胶至毛细管，1.2kV预电泳5min，按编程次序自动进样，再预电泳(1.2kV，20min)，在7.5kV下电泳2h。电泳结束后仪器会自动清洗，灌胶，进下一样品，预电泳和电泳。每一个样品电泳总时间为2.5h。电泳结束后仪器会自动分析或打印出彩色测序图谱。

5．仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。

6．测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。

【计算】

测序反应精确度计算公式：100%－差异碱基数(不包括N数)/650×100%

差异碱基即测定的DNA序列与已知标准DNA序列比较不同的碱基，N为仪器不能辨读的碱基。

【注意事项与评价】

1．ABI PRISM 310基因分析仪是高档精密仪器，需专人操作、管理和维护。

2．本实验测序PCR反应的总体积是5μl，而且未加矿物油覆盖，所以PCR管盖的密封性