基因测序技术的优缺点及应用
分析下一代DNA测序技术的优缺点并比较
分析下一代DNA测序技术的优缺点并比较近年来，基因测序技术取得了快速发展，其发展速度远高于摩尔定律规律。
第一代测序技术“链终止法”虽然技术成熟，但其高成本和低效率限制了其广泛应用。
随着第二代测序技术的出现，基因测序不断向着高通量、高准确度和低成本的方向发展。
本文将分析下一代DNA测序技术的优缺点并比较，希望为读者提供更多的技术资讯和了解。
一、下一代DNA测序技术的优点1. 高通量：下一代DNA测序技术具有高通量的特点，可同时对一个物种或个体的全基因组进行快速测序，达到高通量基因组测序的目标。
这种高通量使得科学家可以在较短时间内提取大量基因信息。
2. 快速速度：下一代DNA测序技术具有极高的速度，一晚上可以测序数千万条序列，并在几个小时内将结果生成和分析。
这种快速速度使得科学家可以在更短的时间里完成大量的测序工作，为基因组研究提供了更强大的工具。
3. 高准确度：下一代DNA测序技术具有很高的准确度，一般达到99.9%或更高。
这种高准确度使检测结果更加准确，从而更好地发现细微的变化或突变。
4. 低成本：下一代DNA测序技术的成本相对较低，能够快速进行测序并且价格低廉，使得大规模的测序在实践中得到了广泛的应用。
二、下一代DNA测序技术的缺点1. 数据分析困难：下一代DNA测序技术获得的数据量大，处理数据的复杂性也增加。
因此需要使用计算机等自动化工具进行数据分析，但是这些应用需要更高的计算能力和存储容量，而且也需要高水平的数据分析人员。
2. 测序误差率高：虽然下一代DNA测序技术具有很高的准确性，但由于基因数据量惊人，在处理过程中仍存在一定误差。
虽然这些误差比较小，但是在分析工作中仍然可能影响结果。
因此需要运用质量控制等手段来保持数据的准确性和可靠性。
3. 长序列难以获得：虽然下一代DNA测序技术能够产生大量序列，但其获得的序列长度均较短，通常只有较短的几百个碱基。
由于每个基因组都包含大量的重复序列和复杂序列，这些情况可能导致测序效率低，难以覆盖全部基因组情况。
简述基因一代、二代和三代测序技术原理及其应用范围
一、基因测序技术的发展1. 基因测序技术的概念及意义2. 基因测序技术的发展历程3. 基因测序技术的分类及特点4. 基因测序技术的应用范围二、基因测序技术原理及方法1. 基因一代测序技术原理及方法2. 基因二代测序技术原理及方法3. 基因三代测序技术原理及方法三、基因测序技术在生物研究中的应用1. 基因一代测序技术在生物研究中的应用2. 基因二代测序技术在生物研究中的应用3. 基因三代测序技术在生物研究中的应用四、基因测序技术在医学诊断与治疗中的应用1. 基因一代测序技术在医学诊断与治疗中的应用2. 基因二代测序技术在医学诊断与治疗中的应用3. 基因三代测序技术在医学诊断与治疗中的应用五、基因测序技术的发展趋势和展望1. 基因测序技术的发展趋势2. 基因测序技术的未来展望六、结语在人类基因组项目完成后，基因测序技术得到了长足的发展。
基因测序技术已经成为现代生物医学研究的重要工具，其在生物学研究、医学诊断与治疗等领域发挥着重要作用。
基因测序技术主要分为一代、二代和三代测序技术。
本文将对这三种基因测序技术的原理、应用范围等进行详细阐述，旨在全面了解基因测序技术的发展和应用。
一、基因测序技术的发展1. 基因测序技术的概念及意义基因测序技术是指通过化学或物理方法对DNA序列进行测定，进而推导出蛋白质的氨基酸序列的技术。
基因测序技术的发展对于了解生命活动、疾病的发生机制、药物研发等方面具有重要意义。
2. 基因测序技术的发展历程基因测序技术的发展经历了多个阶段，自20世纪末以来，随着技术的不断进步和成本的降低，基因测序技术得到了迅速发展和广泛应用。
3. 基因测序技术的分类及特点基因测序技术可以分为一代、二代和三代测序技术。
一代测序技术具有测序长度长、费用高、速度慢等特点；二代测序技术具有高通量、快速、低成本等特点；三代测序技术具有单分子测序、实时测序等特点。
4. 基因测序技术的应用范围基因测序技术在领域广泛，如生物学研究、医学诊断与治疗、个性化医疗、药物研发等领域都有重要应用。
基因诊断中测序技术的应用及优缺点
基因诊断中测序技术的应用及优缺点一、概述基因诊断，作为现代生物医学领域的一项重要技术，正逐步改变我们对人类遗传性疾病和复杂病症的认知。
测序技术作为基因诊断的核心手段，发挥着至关重要的作用。
测序技术通过直接对DNA或RNA 序列进行测定，能够精准地揭示个体的遗传信息，进而为疾病的预防、诊断和治疗提供有力支持。
随着科技的不断进步，测序技术也在不断更新换代，从早期的第一代测序技术，到如今的第二代、第三代测序技术，其测序速度、准确性和成本效益都得到了显著提升。
这些技术的发展，使得基因诊断的应用范围越来越广，不仅限于遗传性疾病的诊断，还逐渐扩展到肿瘤、心血管疾病、感染性疾病等多个领域。
测序技术在基因诊断中的应用也并非尽善尽美。
其优缺点并存，使得在实际应用中需要谨慎权衡。
优点方面，测序技术具有高度的准确性和灵敏度，能够检测到基因序列中的微小变异同时，其信息量巨大，能够为研究者提供丰富的遗传信息。
缺点也不容忽视，如测序成本较高、数据处理复杂、隐私保护问题等，都在一定程度上限制了测序技术的广泛应用。
在探讨基因诊断中测序技术的应用及优缺点时，我们需要全面、客观地分析其技术特点、应用范围及挑战，以期更好地推动其在生物医学领域的发展和应用。
1. 基因诊断的概念与重要性在《基因诊断中测序技术的应用及优缺点》一文的“基因诊断的概念与重要性”段落中，我们可以这样描述：基因诊断，即通过直接分析人类基因或基因产物来诊断疾病的方法，是现代医学领域中的一项重要技术。
它涉及对个体的基因组进行深入研究，以揭示与特定疾病相关的基因变异或异常表达。
基因诊断不仅为疾病的预防、早期发现和治疗提供了有力支持，还极大地推动了个性化医疗的发展。
基因诊断的重要性在于其能够提供精准、可靠的疾病诊断信息。
通过基因测序等技术，医生能够直接检测到与疾病相关的基因变异，从而明确疾病的遗传背景和发病机制。
这有助于实现疾病的早期发现和干预，提高治疗效果，降低医疗成本。
高通量基因测序的技术特点及其应用
高通量基因测序的技术特点及其应用随着科技的不断发展，特别是计算机和生物科学技术的快速发展，高通量基因测序的技术在生物医学领域越来越受到广泛关注。
高通量基因测序的技术特点高通量基因测序是一种用于测定DNA或RNA序列的技术。
与传统的基因测序技术相比，高通量基因测序具有以下几个特点：1.高通量：高通量基因测序技术可以使一次运行同时处理许多样本，实现大规模的基因测序，大大提高了测序的效率和准确性。
2.高精度：高通量基因测序技术使用高质量的芯片、仪器、设备和计算机算法，可以获得高精度的基因序列信息。
这种技术可以检测单个碱基的变异，以及揭示微小基因结构的变化。
3.高效性：高通量基因测序可以快速识别成千上万个样本的基因，并为大规模分析提供基础数据。
高通量基因测序的应用高通量基因测序的技术特点决定了它可以在许多领域中发挥重要作用。
以下是一些应用领域：1.癌症诊断:高通量基因测序技术可以通过捕捉肿瘤相关基因，并对多个基因组进行测序，来诊断癌症，并确定外部环境对癌症的影响。
2.个体化医疗:高通量基因测序技术可以根据每个人的基因信息来定制治疗方案，包括用药和剂量，避免不必要或有害的治疗。
3.基因组学研究:高通量基因测序技术可以快速分析不同基因组之间的区别，以及不同生物和疾病之间的基因变异和表达差异等。
4.环境监测:高通量基因测序技术可以检测环境中的微生物种群和生物多样性，以及对环境因素的响应，为环境保护和生态研究提供支持。
5.农业和食品安全:高通量基因测序技术可以识别和筛选高产量、高品质和抗病性的农作物，以及对食品安全问题的检测和监测。
总结总之，高通量基因测序技术的特点和应用广泛，已经在医学、生物学、环境科学和农业等领域发挥了重要作用。
未来，高通量基因测序技术将继续快速发展，为我们提供更多更准确的生物信息，以及为生命科学和疾病治疗提供新的、更好的解决方案。
三代基因测序技术的优势及其局限性
三代基因测序技术的优势及其局限性近年来，随着基因测序技术的不断发展，人类对于自身基因结构的研究也变得更加深入和广泛。
其中，三代基因测序技术作为最新的一项技术，具备许多优势和应用前景。
在本文中，我们将探讨三代基因测序技术的优势及其局限性。
一、三代基因测序技术的优势1.高通量相比较之前的两代基因测序技术，三代基因测序技术最大的优势在于其高通量性质。
利用三代基因测序技术进行测序，可在相对较短的时间内获得更多的基因信息。
这使得科研人员和医疗机构都能够更加高效地进行基因研究和诊断。
同时，这也对于解决人类基因修复等方面的问题具有重要作用。
2.直接读取DNA分子三代基因测序技术是直接读取DNA分子的，不需要进行PCR 扩增等前置工作。
这意味着，三代基因测序技术可以避免PCR扩增过程中产生的偏差和差异，从而提高了数据质量和准确性。
同时，这也使得三代基因测序技术非常适用于那些含量较低的DNA 样本，如肿瘤组织、单细胞等。
3.能够分析基因组结构、建立基因组超图另外，三代基因测序技术还可以在基因组结构、基因密度等方面提供更多的信息。
利用三代基因测序技术，科研人员可以对基因组结构进行更为准确的分析和建立基因组超图，这在马铃薯基因组等大型基因组的分析中具有重要作用。
二、三代基因测序技术的局限性1.数据处理难度大相比较之前的两代基因测序技术，三代基因测序技术的数据处理难度要大得多。
由于三代基因测序技术获得的数据质量不如二代测序技术那么高，因此需要更多的数据清洗和纠错过程。
这在一定程度上增加了数据处理难度和成本。
另外，三代测序技术的数据处理也需要更多的计算资源和存储空间。
2.仍存在一定的误差率尽管在技术发展过程中，三代基因测序技术的准确率和测序深度得到了大幅提升，但事实上仍存在一定的误差率。
这可能导致分析结果存在偏差或错误，从而对相关研究和应用产生不利影响。
3.确定了正确的测序媒介三代基因测序技术目前没有确定最为优秀的测序媒介。
基因测序技术的优缺点分析
基因测序技术的优缺点分析随着科技的不断进步和发展，基因测序技术越来越成为人们关注和利用的焦点，被广泛应用于医学、农业以及科学研究等方面。
这项技术可以帮助我们深入了解基因信息和变异情况，提高研究和治疗的准确性和效率。
然而，基因测序技术也存在一些缺点需要我们及时解决和改进，本文将对其优缺点进行分析。
一、基因测序技术的优点1.精确性高基因测序技术可以高度精确地分析和鉴定某个体的DNA序列，对于发现基因突变等有很高的准确性和可靠性，尤其对于在早期就可以有效识别和预防患者疾病产生的风险，有着不可替代的意义。
2.广泛的应用领域基因测序技术的应用范围非常广泛，无论是在医学、科学研究还是在农业、食品安全等领域都有巨大的作用和潜力。
医学领域可以用于疾病诊断、药物研究和发展；农业领域可以用于改良作物、提高品质和种子的选育；食品安全领域可用于检测食品中是否含有致病菌、过敏原等。
3.研究成本低随着技术的逐渐成熟和普及，人们对基因测序技术的需求也呈现出爆发式增长。
而与此同时，技术成本也逐渐下降，人们可以用更少的资金完成基因测序，从而进一步推动技术的发展和应用。
二、基因测序技术的缺点1. 数据管理和隐私问题基因测序技术产生了大量数据，数据的存储和管理成为了一个巨大的挑战。
同时，与此相关的隐私问题也愈加突出，人们对于个人基因信息的保护和使用引起了很多争议，需要制定更加严格的规定和方案。
2. 准备样本问题在进行基因测序之前需要提供足够的DNA样本，常见的样品类型有血液、唾液、皮肤等。
准备样本需要高度专业的知识和技术，有时还需要侵入性操作，具有一定风险和限制。
3.分析难度由于基因测序产生的数据非常庞大而复杂，在数据分析阶段可能会遇到巨大的困难。
数据分析需要进行深入的挖掘和判断，对于科研人员和分析团队的要求较高，一旦分析错误可能会对研究产生不良的影响。
三、未来的技术发展目前基因测序技术仍然处于不断发展和改进的过程中，未来有望在一些方面实现更多的突破和进步。
基因检测的优缺点及应用前景
基因检测的优缺点及应用前景基因检测是目前生命科学领域中一个备受关注的领域，它基于对DNA序列的扫描分析，可以帮助我们研究并预测人类的一些生理状况，对于人类健康的保护与治疗有着非常重要的作用。
但是，基因检测也存在着一些缺点和不足。
本文将重点探讨基因检测的优缺点，并对其应用前景进行展望。
一、基因检测的优势1. 帮助诊断通过基因检测，我们可以获得个体的基因信息，进而进行疾病的诊断。
比如，基因检测可以帮助判断患者是否患有某些常见遗传疾病，如唐氏综合症、亨廷顿病和多囊肾等。
而对于一些恶性肿瘤，基因检测更是可以在早期发现风险因素，帮助预防和诊断癌症等疾病。
2. 可预测遗传病的风险基因检测不仅可以发现某些已知的遗传疾病，还可以帮助预测遗传病的患病风险。
通过分析基因序列，识别患者是否有某些与疾病相关的基因变异，从而预测患病的风险。
这对于进行疾病预防、定期检查或适时治疗都有很大帮助。
3. 个性化医疗基因检测还可以帮助进行个性化的医疗，比如基于检测结果的药物选择、药物治疗剂量的调节等，从而提高疗效，并减少患者的药物不良反应。
4. 促进科学研究基因检测可以为科学研究提供依据，例如人类基因组计划，通过测序人类基因组，为各种疾病的发病机制和治疗方式提供了有效的基因信息和治疗策略。
二、基因检测的缺点与限制1. 基因检测费用较高目前，基因检测的技术和设备仍比较昂贵，因此对于一些经济困难的人来说，基因检测仍然是一项奢侈的服务。
2. 检测结果的解读存在不确定性基因检测结果常常存在不确定性，并需要专业的医学专家进行解读。
即使解读专家已经尽最大努力，但是，对于一些基因序列的意义、功能以及与疾病的关联性，还存在很多未知的领域。
3. 疾病结果的预测误差可能存在基于基因检测的预测结果并不能够完全反映患病风险，甚至有可能存在误差。
这些误差可能源于基因序列的变异、基因变异的不同突发性以及患病环境等一系列因素。
4. 隐私安全问题基因检测会涉及个人隐私和保密，一旦泄露，可能存在安全风险。
基因测序技术的应用及局限性
基因测序技术的应用及局限性随着现代科技的飞速发展，基因测序技术已经逐渐成为了细胞生物学和医学研究的核心技术之一，同时也在精准医疗领域得到了广泛运用。
然而，基因测序技术也存在一些局限性和缺陷。
本文将从应用和局限性两个方面来进行阐述。
一、基因测序技术的应用（一）基因组测序基因组测序技术是指对一个生物体的所有基因组进行测序，通常可分为两种类型：全基因组测序和外显子组测序。
相较于外显子组测序，全基因组测序具有更高的基因检出率，可以检测一些外显子组测序中无法检测到的变异。
而外显子组测序则可用于检测易位、拷贝数变异和基因交错等。
应用方面，基因组测序技术可发掘生命科学的未知领域，对于理解基因组结构和功能以及研究遗传病的诊断和治疗具有重要意义。
例如，近年来发现很多肿瘤患者的基因组存在明显突变，如果能够通过基因组测序来测出患者具体的基因突变位置，不仅可以对肿瘤治疗提供有力的理论支持，还可以为肿瘤预防和治疗提供更加精准的方式和手段。
（二）转录组测序转录组测序技术是指对一个生物体所有转录本进行测序，即对生物体不同时期和不同组织、器官中所表达的所有基因进行测序，以揭示基因在不同组织中表达的差异和调控方式。
目前，转录组测序技术应用最为广泛的就是用于研究各类疾病的发病机制，如病理性心肌增生、阿尔茨海默病等神经系统疾病。
（三）表观基因组学表观基因组学是指对不同时期、不同组织和不同个体中表观遗传变异进行测序。
表观基因组学研究的是DNA序列上的化学修饰，如甲基化和乙酰化等修饰，这些修饰对基因表达的调节及细胞分化和功化等过程具有极其重要的作用。
表观基因组学技术在肿瘤起源、生殖系统疾病、神经系统疾病等方面的研究中具有广泛的应用前景。
二、基因测序技术的局限性（一）误检和漏检目前，基因测序技术尚未完全消除误检或漏检的风险，随着测序数据的累积和分析技术的不断发展，错误率已经有所降低，但在某些特殊情况下不可避免出现。
因此，无论是在遗传性疾病的诊断还是药物靶向治疗的选择上，基因测序技术还有不断完善的空间。
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基因测序技术的优缺点及应用随着人类基因组计划的完成,人类对自身遗传信息的了解和掌握有了前所未有的进步。
与此同时,分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善,使得基因检测技术得到了迅猛发展,基因检测效率不断提高。
从最初第一代以 Sanger 测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为代表的间接测序技术,到 2005 年,以Illumina 公司的 Solexa技术和 ABI 公司的 SOLiD 技术为标志的新一代测序 (next-generation sequencing,NGS) 的相继出现,测序效率明显提升,时间明显缩短,费用明显降低,基因检测手段有了革命性的变化。
其技术正向着大规模、工业化的方向发展,极大地提高了基因检测的检出率,并扩展了疾病在基因水平的研究范围。
2009 年 3 月,约翰霍普金斯大学的研究人员在《Science》杂志上发表了通过 NGS外显子测序技术,发现了一个新的遗传性胰腺癌的致病基因PALB2,标志着 NGS 测序技术成功应用于致病基因的鉴定研究。
同年,《Nature》发表了采用 NGS 技术发现罕见弗里曼谢尔登综合征MYH3 致病基因突变和《Nat Genet》发表了遗传疾病米勒综合征致病基因。
此后,通过 NGS 技术,与遗传相关的致病基因不断被发现,NGS 技术已成为里程碑式的进步。
2010 年,《Science》杂志将这一技术评选为当年“十大科学进展”。
近两年,基因检测成为临床诊断和科学研究的热点,得到了突飞猛进和日新月异的发展,越来越多的临床和科研成果不断涌现出来。
同时,基因检测已经从单一的遗传疾病专业范畴扩展到复杂疾病和个体化应用更加广阔的领域,其临床检测范围包括高危疾病的新生儿筛查、遗传疾病的诊断和基因携带的检测以及基因药物检测用于指导个体化用药剂量、选择和药物反应等诸多方面的研究。
目前,基因检测在临床诊断和医学研究的应用正越来越受到医生的普遍重视和引起研究人员的极大的兴趣。
本文介绍了几种 DNA 水平基因检测常见的方法,比较其优缺点和在临床诊断和科学研究中的应用,对指导研究生和临床医生课外学习,推进临床科研工作和提升科研教学水平有着指导意义。
1、第一代测序1.1 Sanger 测序采用的是直接测序法。
1977年,Frederick Sanger 等发明了双脱氧链末端终止法,这一技术随后成为最为常用的基因测序技术。
2001 年,Allan Maxam 和 Walter Gibert 发明了 Sanger 测序法,并在此后的 10 年里成为基因检测的金标准。
其基本原理即双脱氧核苷三磷酸(dideoxyribonucleoside triphosphate,ddNTP) 缺乏PCR 延伸所需的 3'-OH,因此每当 DNA 链加入分子 ddNTP,延伸便终止。
每一次 DNA 测序是由 4个独立的反应组成,将模板、引物和 4 种含有不同的放射性同位素标记的核苷酸的ddNTP 分别与DNA 聚合酶混合形成长短不一的片段,大量起始点相同、终止点不同的 DNA 片段存在于反应体系中,具有单个碱基差别的 DNA 序列可以被聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离出来,得到放射性同位素自显影条带。
依据电泳条带读取DNA 双链的碱基序列。
人类基因组的测序正是基于该技术完成的。
Sanger 测序这种直接测序方法具有高度的准确性和简单、快捷等特点。
目前,依然对于一些临床上小样本遗传疾病基因的鉴定具有很高的实用价值。
例如,临床上采用 Sanger 直接测序FGFR 2 基因证实单基因 Apert 综合征和直接测序 TCOF1 基因可以检出多达90% 的与 Treacher Collins 综合征相关的突变。
值得注意的是,Sanger 测序是针对已知致病基因的突变位点设计引物,进行 PCR 直接扩增测序。
单个突变点的扩增包括该位点在内的外显子片段即可,不必将该点所在基因的全部外显子都扩增。
因此,应明确定位要扩增的位点所在的基因外显子和该点的具体位置,设计包括该点在内的上下游 150 ~ 200 bp 的外显子片段引物。
此外,尽管有NGS 的出现,但 Sanger 测序对于有致病基因位点明确并且数量有限的单基因遗传疾病的致病基因的检测是非常经济和高效的。
到目前为止,Sanger 测序仍然是作为基因检测的金标准,也是 NGS 基因检测后进行家系内和正常对照组验证的主要手段。
值得注意的是,Sanger 测序目的是寻找与疾病有关的特定的基因突变。
对于没有明确候选基因或候选基因数量较多的大样本病例筛查是难以完成的,此类测序研究还要依靠具有高通量测序能力的 NGS。
虽然 Sanger 测序具有高度的分析准确性,但其准确性还取决于测序仪器以及测序条件的设定。
另外,Sanger 测序不能检测出大片段缺失或拷贝数变异等基因突变的类型,因此对于一些与此相关的遗传性疾病还不能做出基因学诊断。
1.2 连锁分析采用的是间接测序法。
在 NGS 出现之前,国际通用的疾病基因定位克隆策略是建立在大规模全基因扫描和连锁分析基础上的位置候选基因克隆。
人类的染色体成对出现,一条来自父亲,一条来自母亲,每一对染色体在同样的位置上拥有相同的基因,但是其序列并不完全相同,被称为父系和母系等位基因。
遗传标记是指在人群中表现出多态现象的 DNA 序列,可追踪染色体、染色体某一节段或某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。
它存在于每一个人,但大小和序列有差别,具有可遗传性和可识别性。
目前采用第二代遗传标记,即重复序列多态性,特别是短串联重复序列,又称微卫星标记。
连锁分析是以连锁这种遗传现象为基础,研究致病基因与遗传性标记之间关系的方法。
如果控制某一表型性状的基因附近存在遗传标记,那么利用某个遗传标记与某个拟定位的基因之间是否存在连锁关系,以及连锁的紧密程度就能将该基因定位到染色体某一位置上。
1986 年 Morton 等提出优势对数记分法 (log odds score method,LOD),主要检测两基因以某一重组率连锁时的似然性。
LOD 值为正,支持连锁 ;LOD 值为负,则否定连锁。
通过计算家系中的微卫星标记与致病位点之间的 LOD 值,可以初步估算二者间的遗传距离及连锁程度,从而确定该基因在染色体上的粗略位置。
然后利用该区域的染色体基因图谱,分析定位区域内所有基因的功能与表达,选择合适的候选基因进行突变检测,最终将致病基因定位或克隆。
然而,采用连锁分析进行基因检测存在很大的局限性。
不但所需遗传样本量较大,一般要求提供三代及以上遗传家系患者血样,而且数据量大、处理复杂、产出速度较慢、定位不够精确 ( 一般只能定位在染色体某一区间 ),这就使得研究工作繁重和定位基因的时间周期特别长。
目前,连锁分析采用的单核苷酸多肽性和短串联重复序列还在使用,但经典的间接测序方法,如单链构象多肽性、变性梯度凝胶电泳和异源双链分析在美国已被淘汰,而在发展中国家作为研究手段还在有限使用。
2、新一代测序 (NGS)主要包括全基因组重测序 (whole-genomesequencing,WGS)、全外显子组测序 (whole-exomesequencing,WES) 和目标区域测序 (Targeted regionssequencing,TRS),它们同属于新一代测序技术。
总体而言,NGS 技术具有通量大、时间短、精确度高和信息量丰富等优点,使得遗传学者可以在短时间内对感兴趣的基因进行精确定位。
但这些不同的测序技术在测序范围、数据分析量以及测序费用和时间等方面又有很大差别,如果选择适合的方法,对于临床诊断和科学研究将起到事半功倍的作用。
2.1 目标区域测序目前常用的是基因芯片技术。
其测序原理是基于 DNA 杂交原理,利用目标基因组区域定制的探针与基因组 DNA 进行芯片杂交或溶液杂交,将目标基因区域 DNA 富集,再通过NGS 技术进行测序。
其测序过程是通过把数以万计的 cDNA 或寡聚核苷酸置于芯片上制成列阵,将芯片上固定好的已知序列的核苷酸探针与溶液中含有荧光标记的相应核酸序列进行互补配对,根据测序仪所显示强荧光的位置和强度,获取每组点阵列信息,再利用生物信息学算法确定目的靶核苷酸的序列组成。
测序所选定的目标区域可以是连续的 DNA 序列,也可以是分布在同一个染色体不同区域或不同染色体上的片段。
目标区域测序技术,对于以往通过连锁分析将基因突变锁定在染色体某一片段区域内,但无法找出突变是一个非常好的进一步检测手段。
2010 年,Nicholas等使用基因分型芯片联合连锁分析技术,成功发现头小畸形的新基因WDR62,文章发表在《NatGenet》杂志。
类似的研究在家族性胰腺癌中确定 8 个候选变异位点和在家族性渗出性玻璃体视网膜病变发现易感基因 TSPAN12。
基因芯片测序技术可以将经过连锁分析锁定了目标范围或经过全基因组筛选的特定基因或区域进行更深一层的研究,是解决连锁分析无法发现致病基因的有效手段。
基因芯片技术对于已知基因突变的筛查具有明显优势,可以快速、全面地检测出目标基因突变。
同时,由于目标区域受到了限制,测序范围大幅度减少,测序时间和费用相应降低。
但基因芯片检测所需要的 DNA 的量要大,由于已提取的 DNA 存在降解的风险,用于基因芯片研究的血标本最好是冰冻的全血,这样可以使用于检测 DNA 的量有充分保证。
2.2 全外显子组测序 (WES) 外显子组是单个个体的基因组 DNA 上所有蛋白质编码序列的总合。
人类外显子组序列约占人类全部基因组序列的 1%,但大约包含 85% 的致病突变。
WES 是利用序列捕获技术将全外显子区域 DNA 捕捉并富集后进行高通量测序的基因分析方法。
采用的技术平台主要是罗氏公司的SeqCap EZ 全外显子捕获系统,Illumina 公司的 Solexa 技术和 Agilent 公司的 SureSelect 外显子靶向序列富集系统。
其捕获的目标区在 34 ~ 62 M 之间,不仅包括编码区同时也加入了部分非编码区。
NGS 的测序过程主要包括DNA 测序文库的制备、锚定桥接、PCR 扩增、单碱基延伸测序和数据分析。
研究者根据测序仪捕获到在测序过程中掺入有不同荧光标记碱基片段,经计算机将荧光信号转化成不同颜色的测序峰图和碱基序列。
基因测序结果与NCBI的SNP数据库、千人基因组数据库等国际权威数据库比对,最终确定是否为突变基因。
自NGS 技术问世以来,利用 WES 在临床疾病致病基因的鉴定研究中取得前所未有的成果。
这些成果不仅集中在单基因遗传疾病,还在多基因影响的复杂疾病中获得大量相关基因的发现。
在单基因遗传性疾病中,如视网膜色素变性、终端骨发育不良等发现新基因或已知基因新突变。