经典：第三代基因测序原理及应用
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1977年，英国人Fred Sanger 发现，如果在DNA复制过 程中掺入ddNTP，就会产生一系列末端终止的DNA链，并能通 过电泳按长度分辨。不同末端终止DNA链的长度是由掺入到 新合成链上随机位置的ddNTP决定的。
复制叉（Replication fork）
DNA ligase：DNA连接酶； DNA gyrase：DNA旋转酶； DnaB helicase：解旋酶 SSB：单链结合蛋白；
• 基因是具有遗传效应的DNA分子片段，由许多脱氧核苷酸按照一定的 碱基顺序构成的长链聚合物。
身高
基 因
胖瘦
肤色
智商 3
什么是基因组？
基因组：一个细胞内的全套染色体为一个基因组，或是一个细胞中 的全部DNA为一个基因组
基因组>染色体>基因 4
测序技术发展史
第一代测序原理-Sanger测序法
双脱氧链终止法（Sanger法）：
14
MiSeq
建库
2
HOURS
一体化进行：上样后，测序仪 自动化完成扩增和测序
Cluster
测序
14
HOURS
HOURS
信息分析
0.5
HOURS
二代测序法
16
17
第三代测序原理-单分子测序
第三代测序方法与现在的测序技术相比之下的优 点： 1）更高的通量； 2）更短的测序时间； 3）更长的读取长度； 4）更高的精确性，可以检测出极少的变异； 5）需要很少的起始量； 6）低成本。
ATCGAACTTCCATTGCACCAATATAGGTACGTAA ATCGAACTTCC TTGCACCTATATAGGTGTACGTAA
碱基缺失
碱基重复
碱基突变
• 特点：测序长度700-1000bp；通量小，一次96个样本，每个样本1 条序列
• 临床应用：单基因病检测 ，如血友病、白化病、地中海贫血等
第三代测序原理
1
什么是DNA？
• DNA是英文Deoxyribonucleic acid的缩写，中文含义为脱 氧核糖核酸。
• 脱氧核糖核苷酸的类型： 腺嘌呤（A）= 胸腺嘧啶（T）
胞嘧啶（C）= 鸟嘌呤（G）
DNA分子的排列顺序是可以检测 的，从而可以解读遗传信息，即测序。
DNA结构（视频）
2
什么是基因？
22
个人观点供参考，欢迎讨论
个人观点供参考，欢迎讨论
第二代测序原理-高通量测序
NextSeq 500 – 灵活通量
化学试剂
缓冲液
废液槽
Flow Cell
12
测序基3础’ 5原’ 理：边合成边测序(SBS)
A
C T
A
G
C T
G A
T
G
wenku.baidu.com
C
T G C T A C G A
T A C C C G A T C G A
T
5’
如何理解边合成边测序？
用不同颜色的荧光标记四种dNTP，在聚合酶 作用下，按照碱基互补配对原则（A与T配对， C与G配对）进行链的延伸，每延伸一个碱基， 碱基释放荧光。通过光学系统捕获荧光，从 而获得碱基信息。
18
Helico BioScience 单分子测序技术
19
Pacific Bioscience SMRT 技术
20
Oxford Nanopore Technologies 的纳米孔单分子测序技术
21
第三代测序原理-单分子测序
第三代测序方法与现在的测序技术相比之下的优 点： 1）更高的通量； 2）更短的测序时间； 3）更长的读取长度； 4）更高的精确性，可以检测出极少的变异； 5）需要很少的起始量； 6）低成本。
DNA连接酶（DNA ligase）
• 功能：连接DNA链3‘-OH末端和另一DNA链的5’-P末端，使二者生成磷 酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链。
DNA复制
Sanger测序法
9
第一代测序成果：人类基因组
2001年2月份同时发表，从此有了人类基因组模板。
参考序列： 测序所得序列：
复制叉（Replication fork）
DNA ligase：DNA连接酶； DNA gyrase：DNA旋转酶； DnaB helicase：解旋酶 SSB：单链结合蛋白；
• 基因是具有遗传效应的DNA分子片段，由许多脱氧核苷酸按照一定的 碱基顺序构成的长链聚合物。
身高
基 因
胖瘦
肤色
智商 3
什么是基因组？
基因组：一个细胞内的全套染色体为一个基因组，或是一个细胞中 的全部DNA为一个基因组
基因组>染色体>基因 4
测序技术发展史
第一代测序原理-Sanger测序法
双脱氧链终止法（Sanger法）：
14
MiSeq
建库
2
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一体化进行：上样后，测序仪 自动化完成扩增和测序
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测序
14
HOURS
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信息分析
0.5
HOURS
二代测序法
16
17
第三代测序原理-单分子测序
第三代测序方法与现在的测序技术相比之下的优 点： 1）更高的通量； 2）更短的测序时间； 3）更长的读取长度； 4）更高的精确性，可以检测出极少的变异； 5）需要很少的起始量； 6）低成本。
ATCGAACTTCCATTGCACCAATATAGGTACGTAA ATCGAACTTCC TTGCACCTATATAGGTGTACGTAA
碱基缺失
碱基重复
碱基突变
• 特点：测序长度700-1000bp；通量小，一次96个样本，每个样本1 条序列
• 临床应用：单基因病检测 ，如血友病、白化病、地中海贫血等
第三代测序原理
1
什么是DNA？
• DNA是英文Deoxyribonucleic acid的缩写，中文含义为脱 氧核糖核酸。
• 脱氧核糖核苷酸的类型： 腺嘌呤（A）= 胸腺嘧啶（T）
胞嘧啶（C）= 鸟嘌呤（G）
DNA分子的排列顺序是可以检测 的，从而可以解读遗传信息，即测序。
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废液槽
Flow Cell
12
测序基3础’ 5原’ 理：边合成边测序(SBS)
A
C T
A
G
C T
G A
T
G
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C
T G C T A C G A
T A C C C G A T C G A
T
5’
如何理解边合成边测序？
用不同颜色的荧光标记四种dNTP，在聚合酶 作用下，按照碱基互补配对原则（A与T配对， C与G配对）进行链的延伸，每延伸一个碱基， 碱基释放荧光。通过光学系统捕获荧光，从 而获得碱基信息。
18
Helico BioScience 单分子测序技术
19
Pacific Bioscience SMRT 技术
20
Oxford Nanopore Technologies 的纳米孔单分子测序技术
21
第三代测序原理-单分子测序
第三代测序方法与现在的测序技术相比之下的优 点： 1）更高的通量； 2）更短的测序时间； 3）更长的读取长度； 4）更高的精确性，可以检测出极少的变异； 5）需要很少的起始量； 6）低成本。
DNA连接酶（DNA ligase）
• 功能：连接DNA链3‘-OH末端和另一DNA链的5’-P末端，使二者生成磷 酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链。
DNA复制
Sanger测序法
9
第一代测序成果：人类基因组
2001年2月份同时发表，从此有了人类基因组模板。
参考序列： 测序所得序列：