经典：第三代基因测序原理及应用
三代基因组测序技术原理简介
三代基因组测序技术原理简介摘要：从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。
虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。
测序技术的每一次变革，也都对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。
在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。
图1：测序技术的发展历程生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。
以上（图1）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。
第一代测序技术第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）. 并在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基1。
自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。
研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。
在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA 合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP （分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2）。
这个网址为sanger测序法制作了一个小短片，形象而生动。
值得注意的是，就在测序技术起步发展的这一时期中，除了Sanger法之外还出现了一些其他的测序技术，如焦磷酸测序法、链接酶法等。
三代基因组测序技术简介及其原理整理
三代基因组测序技术简介及其原理整理第一代测序技术第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法以及1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）。
1977年，桑格测定了第一个基因组序列——噬菌体X174，全长5375个碱基。
自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。
研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。
在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础。
Sanger法原理：1）在模板指导下，DNA聚合酶不断将dNTP（N=A/G/T/ C）加到引物的3’- OH末端，合成出新的互补链。
在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP，在互补链在DNA聚合酶作用下延伸时，一旦连接上ddNTP，由于双脱氧核糖的2’和3’都不含羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键而终止反应，随即形成一系列不同长度的、以同样引物为起始、以同一碱基终止的短片段混合物。
2）双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，从而读取DNA核苷酸序列。
化学裂解法原理：与Sanger法类似，将DNA模板分成4个反应。
在每个反应中，先在模板5’端进行放射性标记，再加入能特异性在其中一种碱基处切开DNA的化学试剂。
反应进行时，平均一个DNA分子只在随机位点产生一次裂解。
接着，通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。
第二代测序技术第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。
因而第一代测序技术并不是最理想的测序方法。
经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa，Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。
一二三四代测序技术原理详解
一二三四代测序技术原理详解一、第一代测序技术原理第一代测序技术最早出现于1977年，是由Sanger等人发明的，并被称为“链终止法”。
其原理是通过DNA聚合酶将输入的DNA序列再生产出一条互补链，同时在每个位点上加入一种特殊的荧光标记的二进制核苷酸，然后将这些被标记的DNA片段分开进行电泳，根据电泳结果可以得到DNA的序列。
第一代测序技术的核心原理是首先将待测序列分成多个片段，然后利用DNA聚合酶在每个片段的3'末端加入一种荧光标记的二进制核苷酸。
这种核苷酸的特殊之处在于，它们只能和待测序列的碱基互补配对，并且在加入过程中会停止DNA链的生长。
随后，将加入了荧光标记的DNA片段进行分离和电泳。
由于不同长度的DNA片段在电场下移动的速度不同，所以通过观察不同片段的移动位置，可以推断出每个片段的碱基序列。
二、第二代测序技术原理第二代测序技术的原理是通过对待测DNA片段进行多轮的扩增和测序，最后将所有结果进行比对和组装，得到完整的DNA序列。
第二代测序技术的核心原理是将待测DNA样本分成许多小片段，然后将每个片段进行扩增，所得到的扩增产物再次进行扩增，并且在扩增过程中引入一种荧光标记的二进制核苷酸。
在每个扩增步骤之后，需要将扩增产物进行分离，例如利用固相法将扩增产物固定在芯片上。
然后，对每个扩增产物进行毛细管电泳或基于光信号的测量，以确定每个扩增产物对应的碱基序列。
最后，通过将所有碱基序列进行比对和组装，可以得到待测DNA的完整序列。
第二代测序技术相较于第一代测序技术具有更高的通量和更低的成本，可以同时进行大规模的测序，因此被广泛应用于基因组学和生物医学研究。
三、第三代测序技术原理第三代测序技术是在第二代测序技术的基础上发展而来的，其主要原理是通过直接测量DNA或RNA单分子的序列来进行测序，无需进行扩增和分离过程。
第三代测序技术的核心原理是通过探测DNA或RNA单分子在固定的平面上的位置变化，来确定每个单分子的碱基序列。
简述基因一代、二代和三代测序技术原理及其应用范围
一、基因测序技术的发展1. 基因测序技术的概念及意义2. 基因测序技术的发展历程3. 基因测序技术的分类及特点4. 基因测序技术的应用范围二、基因测序技术原理及方法1. 基因一代测序技术原理及方法2. 基因二代测序技术原理及方法3. 基因三代测序技术原理及方法三、基因测序技术在生物研究中的应用1. 基因一代测序技术在生物研究中的应用2. 基因二代测序技术在生物研究中的应用3. 基因三代测序技术在生物研究中的应用四、基因测序技术在医学诊断与治疗中的应用1. 基因一代测序技术在医学诊断与治疗中的应用2. 基因二代测序技术在医学诊断与治疗中的应用3. 基因三代测序技术在医学诊断与治疗中的应用五、基因测序技术的发展趋势和展望1. 基因测序技术的发展趋势2. 基因测序技术的未来展望六、结语在人类基因组项目完成后，基因测序技术得到了长足的发展。
基因测序技术已经成为现代生物医学研究的重要工具，其在生物学研究、医学诊断与治疗等领域发挥着重要作用。
基因测序技术主要分为一代、二代和三代测序技术。
本文将对这三种基因测序技术的原理、应用范围等进行详细阐述，旨在全面了解基因测序技术的发展和应用。
一、基因测序技术的发展1. 基因测序技术的概念及意义基因测序技术是指通过化学或物理方法对DNA序列进行测定，进而推导出蛋白质的氨基酸序列的技术。
基因测序技术的发展对于了解生命活动、疾病的发生机制、药物研发等方面具有重要意义。
2. 基因测序技术的发展历程基因测序技术的发展经历了多个阶段，自20世纪末以来，随着技术的不断进步和成本的降低，基因测序技术得到了迅速发展和广泛应用。
3. 基因测序技术的分类及特点基因测序技术可以分为一代、二代和三代测序技术。
一代测序技术具有测序长度长、费用高、速度慢等特点；二代测序技术具有高通量、快速、低成本等特点；三代测序技术具有单分子测序、实时测序等特点。
4. 基因测序技术的应用范围基因测序技术在领域广泛，如生物学研究、医学诊断与治疗、个性化医疗、药物研发等领域都有重要应用。
第三代测序技术的主要特点及其在病毒基因组研究中的应用
关键 词 ： 第三代测序技术 ； Ｐ ａ ｃ ｉ ｆ ｉ ｃ Ｂ ｉ ｏ ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ ； 单分子实 时测序 ； 病毒基 因组
Ｃｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｓ ｔ ｉ ｃ ｓ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｔ ｈｉ ｒ ｄ ｇ ｅ ｎ ｅ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｉ ｎ ｇ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ａ ｎ ｄ ｉ ｔ ｓ ａ ｐ ｐｌ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｉ ｎ ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ ｉ ｎ ｇ ｏ ｆ ｖ ｉ ｒ ａ ｌ ｇ ｅ ｎ ｏ ｍｅ ｓ
方面 。本文 主要对 Ｔ Ｇ Ｓ技术 的原 理 、 特点 和应 用 ， 特 别是 在 病毒 研究 中 的应 用进 行介 绍 ， 并 与第二 代测 序 （ ｎ ｅ ｘ ｔ ｇ ｅ ｎ ｅ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｉ ｎ ｇ ， Ｎ ＧＳ ） 技术进行 比较 ， 为基因组测序技术的选择及其临床应用提供一定参考 。
Ｓ ａｎ ｈ ｇ ｈ ａ ｉ ２ ０ ０ ０ ２ ５，Ｃｈ ｉ ｎ ａ
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ｗｉ ｔ ｈ ｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ｎ ｓ ｅ ｃ ｕ ｔ ｉ ｖ ｅ ｉ ｎ ｎ ｏ ｖ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ａ ｐ ｐ ｌ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｇ ｅ ｎ ｅ ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｉ ｎ ｇ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， ｔ ｈ ｅ ｔ ｈ ｉ ｒ ｄ
司的单 分 子 实 时 测 序 （ ｓ ｉ ｎ ｇ ｌ ｅ ｍｏ ｌ ｅ ｃ ｕ ｌ ｅ ｒ ｅ ａ ｌ ｔ ｉ ｍｅ ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｉ ｎ ｇ ） 为 代 表 的第 三代 测 序 （ ｔ ｈ ｉ ｒ ｄ ｇ ｅ ｎ ｅ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ
三代测序原理
三代测序原理三代测序技术（Third Generation Sequencing，TGS）现在主要有美国的 Pacific Biosciences（PacBio）的 SMRT 和英国的Oxford Nanopore Technology的nanopore 技术。
首先对测序来说，最好是对原模板进行直接测序，并且不受读长的限制，但是显然二代测序无法达到这两点，而三代测序弥补了这两点不足。
可以对单分子进行测序，nanopore 还能避免在扩增的过程中造成的偏好性，对单分子进行测序读长超过了 2 Mb，还能检测碱基修饰等信息。
1、 SMRT 技术这个技术关键的是有一个称为零级波导（zero-mode waveguides， ZMW）的纳米结构。
ZMW是一个孔状的光电结构，底部有一个激发光，并且固定着 DNA 聚合酶。
这个激发光在进入 ZMW 后会呈指数级衰减。
当进行合成反应的时候模板和引物与酶结合，互补配对的 dNTP 因为在底部停留的时间较长，所以能够被激发光激发荧光信号，而其他的游离 dNTP 则信号弱，这样子就有力区分了背景噪音和荧光信号。
在进行一次反应后，由于荧光基团是被固定在 dNTP 的 5’磷酸位上，脱水缩合时能够将荧光基团去除，便于进行下一次的反应。
SMRT 测序最大限度地保持了聚合酶的活性，是最接近天然状态的聚合酶反应体系，它的损伤主要是由于激光造成的。
另外通过检测间隔碱基之间的时长可以判断是否存在修饰，因为修饰碱基会影响聚合酶反应的速度，光谱也会发生变化。
这个方法的缺点也很显而易见，因为在进入 ZMW 之前并没有形成DNA 簇，检测的是单分子的荧光信号，因此错误率比较高。
但是由于这种错误是随机误差产生的，可以通过多重测序进行纠正。
为了提高测序的准确性，PacBio 公司在 2019 年推出了高精度的 HiFi 测序。
通过 CCS（Circular Consensus Sequencing）技术，能够将测序准确度达到 99% 以上。
第三代测序技术的原理和应用
第三代测序技术的原理和应用第一部分：引言随着基因组学研究的快速发展，测序技术也在不断进步。
第一代测序技术（Sanger测序）和第二代测序技术（高通量测序）已经取得了重大突破，但仍存在一些限制。
为了克服这些限制，第三代测序技术应运而生。
本文将介绍第三代测序技术的原理和应用。
第二部分：第三代测序技术的原理第三代测序技术是一种新型的高通量测序技术，其原理与传统的测序技术有所不同。
第三代测序技术的原理主要包括以下几个方面：1.基于单分子扩增：第三代测序技术采用单分子扩增的方法，不需要PCR过程和文库构建步骤，从而避免了样本损失和引入偏差。
2.实时测序：第三代测序技术实时监测DNA合成过程，可以直接检测每个碱基的加入，无需后续的显著化和检测步骤。
这大大提高了测序速度，并降低了成本。
3.长读长读长读：相比第二代测序技术生成的短读长度，第三代测序技术可以产生更长的读长，一次读取几千个碱基。
这种特点对于重复序列的分析、基因组结构建模和个体基因组描绘等研究非常有用。
第三部分：第三代测序技术的应用第三代测序技术广泛应用于不同领域的基因组学研究。
以下是第三代测序技术的几个重要应用方面：1.药物研发：第三代测序技术可以快速高效地获得个体基因组序列信息，帮助科学家识别药物靶点，推动个体化药物研发。
2.疾病研究：通过第三代测序技术，我们可以快速识别临床样本中的致病基因，深入研究疾病的遗传基础，并帮助制定个性化治疗方案。
3.农业研究：第三代测序技术可以高通量地鉴定和分析作物、家畜和其它农业生物的基因组信息，有助于优化农业生产和提高农作物品质。
4.环境研究：第三代测序技术可以帮助科学家研究环境中的微生物群落，揭示微生物对环境变化的响应，从而提供更好的环境保护策略。
5.进化研究：第三代测序技术可以提供大量的遗传信息，促进生物的进化研究，深入了解物种的起源、演化和适应性变化等问题。
第四部分：结论第三代测序技术以其独特的原理和广泛的应用前景吸引了基因组学研究领域的关注。
第三代DNA测序技术的原理及应用
第三代DNA测序技术是近年来生物学领域的一项重大突破，它的原理和应用在基因研究和生物科学中具有重要意义。
本文将深入探讨第三代DNA测序技术的原理，并分析其在不同领域的应用。
1. 引言DNA测序技术是生物学研究中最基础、最重要的工具之一。
传统的第一代和第二代DNA测序技术虽然有着高效和准确的特点，但在测序速度、数据质量和测序长度方面存在一定的局限性。
而第三代DNA测序技术的出现，为我们提供了更高的测序速度、更长的测序读长和更低的测序成本。
2. 原理第三代DNA测序技术的原理与传统技术有所不同。
它不再依赖于离散的信号和化学反应，而是通过直接读取单个DNA分子中的碱基序列来实现测序。
下面将介绍几种常见的第三代DNA测序技术原理及其特点。
2.1 单分子实时测序技术单分子实时测序技术是第三代DNA测序技术中的一种重要方法。
它利用了DNA链的线性自我扩增特性，通过监测单个DNA分子的合成过程来实现测序。
这种方法具有实时性好、测序速度快、数据产量高的优点，适用于高通量测序和长读长要求的研究。
2.2 纳米孔测序技术纳米孔测序技术是一种基于离子传导原理的第三代DNA测序方法。
它使得DNA分子能够通过纳米孔的通道，并且依据碱基的化学特性在电流传导上产生差异，从而实现测序。
这种方法具有高速度、低成本和无需扩增的特点，适用于快速测序和实时监测。
2.3 光学测序技术光学测序技术是第三代DNA测序技术中的又一种重要方法。
它利用了荧光染料的性质和光信号的检测来实现测序。
通过将DNA分子与特定的荧光染料标记，然后在测序仪器中激发并检测荧光信号，从而获取对应的碱基信息。
这种方法具有高灵敏度和高分辨率的特点，适用于复杂样品和高标准的测序要求。
3. 应用第三代DNA测序技术在生物学研究和医学领域的应用十分广泛，下面将介绍几个典型的应用案例。
3.1 基因组测序第三代DNA测序技术在基因组测序中具有重要意义。
其高通量、长读长和低成本的特点使得科学家们能够更快地完成全基因组的测序工作，并且能够检测到一些传统方法难以观察到的基因变异。
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什么是DNA？
• DNA是英文Deoxyribonucleic acid的缩写，中文含义为脱 氧核糖核酸。
• 脱氧核糖核苷酸的类型： 腺嘌呤（A）= 胸腺嘧啶（T）
胞嘧啶（C）= 鸟嘌呤（G）
DNA分子的排列顺序是可以检测 的，从而可以解读遗传信息，即测序。
DNA结构（视频）
2
什么是基因？
第二代测序原理-高通量测序
NextSeq 500 – 灵活通量
化学试剂
缓冲液
废液槽
Flow Cell
12
测序基3础’ 5原’ 理：边合成边测序(SBS)
A
C T
A
G
C T
G A
T
G
C
T G C T A C G A
T A C C C G A T C G A
T
5’
如何理解边合成边测序？
用不同颜色的荧光标记四种dNTP，在聚合酶 作用下，按照碱基互补配对原则（A与T配对， C与G配对）进行链的延伸，每延伸一个碱基， 碱基释放荧光。通过光学系统捕获荧光，从 而获得碱基信息。
DNA连接酶（DNA ligase）
• 功能：连接DNA链3‘-OH末端和另一DNA链的5’-P末端，使二者生成磷 酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链。
DNA复制
Sanger测序法
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第一代测序成果：人类基因组
2001年2月份同时发表，从此有了人类基因组模板。
参考序列： 测序所得序列：
1977年，英国人Fred Sanger 发现，如果在DNA复制过 程中掺入ddNTP，就会产生一系列末端终止的DNA链，并能通 过电泳按长度分辨。不同末端终止DNA链的长度是由掺入到 新合成链上随机位置的ddNTP决定的。
复制叉（Replication fork）
DNA ligase：DNA连接酶； DNA gyrase：DNA旋转酶； DnaB helicase：解旋酶 SSB：单链结合蛋白；
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Helico BioScience 单分子测序技术
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Pacific Bioscience SMRT 技术
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Oxford Nanopore Technologies 的纳米孔单分子测序技术
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第三代测序原理-单分子测序
第三代测序方法与现在的测序技术相比之下的优 点： 1）更高的通量； 2）更短的测序时间； 3）更长的读取长度； 4）更高的精确性，可以检测出极少的变异； 5）需要很少的起始量； 6）低成本。
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个人观点供参考，欢迎讨论
个人观点供参考，欢迎讨论
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一体化进行：上样后，测序仪 自动化完成扩增和测序
Cluster
测序
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HOURS
HOURS
信息分析
0.5
HOURS
二代测序法
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第三代测序原理-单分子测序
第三代测序方法与现在的测序技术相比之下的优 点： 1）更高的通量； 2）更短的测序时间； 3）更长的读取长度； 4）更高的精确性，可以检测出极少的变异； 5）需要很少的起始量； 6）低成本。
• 基因是具有遗传效应的DNA分子片段，由许多脱氧核苷酸按照一定的 碱基顺序构成的长链聚合物。
身高
基 因
胖瘦
肤色
智商 3
什么是基因组？
基因组：一个细胞内的全套染色体为一个基因组，或是一个细胞中 的全部DNA为一个基因组
基因组>染色体>基因 4
测序技术发展史
第一代测序原理-Sanger测序法
双脱氧链终止法（Sanger法）：
ATCGAACTTCCATTGCACCAATATAGGTACGTAA ATCGAACTTCC TTGCACCTATATAGGTGTACGTAA
碱基缺失
碱基重复
碱基突变
• 特点：测序长度700-1000bp；通量小，一次96个样本，每个样本1 条序列
• 临床应用：单基因病检测 ，如血友病、白化病、地中海贫血等