三代测序原理技术比较
一代,二代,三代测序原理
一代测序一般指Sanger测序，是上世纪70年代由sanger和Coulson开创的DNA双脱氧链终止法测序，当初几 十个国家花了几十亿刀完成的人类基因组计划就是使用的改良版sanger测序。
Sanger测序一次可以读取600-1000bp的碱基，准确性十分之高，至今仍是正确性的金标准。该技术在当下依 然被广泛应用，比如构建载体做克隆，基因敲除等实验都可以用到。但其通量实在太低，导致在很多情况 下成本太高，难以广泛应用。
二代测序
二代测序技术，又称为Next Generation Sequencing（NGS）技术，高通量测序技术， 是为了改进一代测序通量过低的问题而出现的。刚面世时主要包括Roche公司的454技 术、ABI公司的Solid技术和Illumina公司的Solexa技术。这三种技术都极大的提高了测 序的通量，大大降低了测序成本和周期。
➢ 二代测序和一代测序最大的不同点在于其边合成边测序技术。
二代测序
二代测序
测序流动槽(flowcell)： 每个槽都有共价交联的两种oligo（P5和P7），分别与两 端的接头互补。DNA聚合酶
P5 P7
桥式PCR合成另一条链
NaOH解开双链
NaOH解开双链 后模板链被洗掉
二代测序
流动槽加入引物 Rd1 SP、DNA 聚合酶、荧光标 记的dNTP，对 第一条链测序
三代测序
SMRT Cell含有纳米级的零模波导孔，每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序， 并实时检测插入碱基的荧光信号。ZMW是一个直径只有10~50 nm的孔，当激光打在ZMW底部时，只能照亮很小 的区域，DNA聚合酶就被固定在这个区域。只有在这个区域内，碱基携带的荧光基团被激活从而被检测到，大幅 地降低了背景荧光干扰。
二三代测序技术的介绍和比较
二三代测序技术的介绍和比较二代测序技术（也称为高通量测序技术）和三代测序技术是目前最常用的两种DNA测序技术。
下面将对这两种技术进行详细介绍和比较。
1.二代测序技术：二代测序技术的代表性平台包括Illumina HiSeq、Ion Torrent PGM 等。
其工作原理是将DNA样本切割为较短的片段，并通过PCR扩增产生大量的拷贝。
然后，这些片段被连接在测序芯片上，每个片段都被反复地鸟嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）、鸟嘧啶（G）四种碱基中的一种互补的碱基识读，并记录下与之相对应的碱基序列。
这些碱基序列最后被计算机软件组装为完整的DNA序列，进而获取样本的遗传信息。
优点：（1）高通量：可以同时测序数百万个DNA片段，获得庞大数量的数据。
（2）成本低廉：通过并行测序的方式，可以大大减少测序成本。
（3）高精度：二代测序技术的错误率较低，可以达到0.1%以下。
（4）测序速度快：每天可获得几百GB的数据。
缺点：（1）仅适用于短序列：由于二代测序技术的局限性，只能测序相对较短的DNA片段，对于长序列的测序存在困难。
（2）高度依赖参考序列：在组装过程中，需要有可靠的参考序列作为基础，否则可能出现组装错误。
（3）无法解析复杂的基因组结构：由于只能产生相对较短的序列片段，二代测序技术无法很好地解析复杂的基因结构，例如重复序列。
2.三代测序技术：三代测序技术的代表性平台包括PacBio SMRT、Oxford Nanopore等。
三代测序技术的特点是可以直接测量DNA单分子的临床序列。
该技术中的样本DNA被引入到小孔中，随后测序设备会通过测量DNA分子在小孔中的电信号变化来捕捉和记录碱基序列。
这种技术可以完整地获取较长的DNA片段，从而提供了更全面和准确的基因组信息。
优点：（1）长读长：能够测序较长的DNA片段，可以获得更全面和准确的基因组信息。
（2）无需参考序列：三代测序技术不需要依赖已知的参考序列，可以直接解析未知基因组。
一二三四代测序技术原理详解
一二三四代测序技术原理详解一、第一代测序技术原理第一代测序技术最早出现于1977年，是由Sanger等人发明的，并被称为“链终止法”。
其原理是通过DNA聚合酶将输入的DNA序列再生产出一条互补链，同时在每个位点上加入一种特殊的荧光标记的二进制核苷酸，然后将这些被标记的DNA片段分开进行电泳，根据电泳结果可以得到DNA的序列。
第一代测序技术的核心原理是首先将待测序列分成多个片段，然后利用DNA聚合酶在每个片段的3'末端加入一种荧光标记的二进制核苷酸。
这种核苷酸的特殊之处在于，它们只能和待测序列的碱基互补配对，并且在加入过程中会停止DNA链的生长。
随后，将加入了荧光标记的DNA片段进行分离和电泳。
由于不同长度的DNA片段在电场下移动的速度不同，所以通过观察不同片段的移动位置，可以推断出每个片段的碱基序列。
二、第二代测序技术原理第二代测序技术的原理是通过对待测DNA片段进行多轮的扩增和测序，最后将所有结果进行比对和组装，得到完整的DNA序列。
第二代测序技术的核心原理是将待测DNA样本分成许多小片段，然后将每个片段进行扩增，所得到的扩增产物再次进行扩增，并且在扩增过程中引入一种荧光标记的二进制核苷酸。
在每个扩增步骤之后，需要将扩增产物进行分离，例如利用固相法将扩增产物固定在芯片上。
然后，对每个扩增产物进行毛细管电泳或基于光信号的测量，以确定每个扩增产物对应的碱基序列。
最后，通过将所有碱基序列进行比对和组装，可以得到待测DNA的完整序列。
第二代测序技术相较于第一代测序技术具有更高的通量和更低的成本，可以同时进行大规模的测序，因此被广泛应用于基因组学和生物医学研究。
三、第三代测序技术原理第三代测序技术是在第二代测序技术的基础上发展而来的，其主要原理是通过直接测量DNA或RNA单分子的序列来进行测序，无需进行扩增和分离过程。
第三代测序技术的核心原理是通过探测DNA或RNA单分子在固定的平面上的位置变化，来确定每个单分子的碱基序列。
DNA测序技术发展史一代二代三代测序技术简要原理及比较
DNA测序技术发展史一代二代三代测序技术简要原理及比较一、一代测序技术一代测序技术最早出现于1977年，由Sanger和Gilbert等人开发。
其原理基于DNA链延伸，即通过将DNA链合成过程中加入少量的dideoxy核苷酸（ddNTP），使得DNA链延伸在一些特定位置停止，并通过凝胶电泳分析停止位置来确定每个核苷酸的顺序。
一代测序技术的特点是：1.准确性较高，可以达到99.99%的准确率。
2.读长较短，一般为500至1000个碱基。
3.测序过程复杂，需要进行多次扩增和凝胶电泳分析，耗时较长。
二、二代测序技术二代测序技术的发展始于2005年，它采用大规模并行的方式进行测序，实现了高通量测序。
主要的二代测序技术包括454测序、illumina测序和Ion Torrent测序。
454测序技术采用循环化学法，通过将DNA片段固定在微小的载体上，然后进行多次扩增和测序，最后通过压缩气体冲击来释放碱基，从而实现测序。
illumina测序技术采用桥式扩增法，通过将DNA固定在玻璃芯片上的小孔中，并用荧光标记核苷酸进行扩增和测序，最后通过激光扫描来检测荧光信号。
Ion Torrent测序技术是一种基于半导体芯片原理的测序技术，通过检测氢离子的释放来确定DNA序列。
二代测序技术的特点是：1.高通量：可以同时测序数百万甚至数十亿个片段。
2.快速：通常只需几个小时到几天的时间完成测序。
3.读长较短：大部分二代测序技术的读长在100至1000个碱基之间。
4.相对较低的测序准确率：一般在99%左右。
三、三代测序技术三代测序技术是指第三代测序技术，它的发展始于2024年。
三代测序技术主要包括单分子测序和纳米孔测序。
单分子测序技术（如PacBio和Nanopore）通过将DNA片段转化为单分子，然后通过观察单分子的扩增和测序来获得DNA序列。
纳米孔测序技术则是将DNA分子引入纳米孔中，通过纳米孔内的电信号变化来确定碱基对的序列。
三代测序技术的原理
三代测序技术的原理三代测序技术是指通过直接测序DNA或RNA分子，而不需要进行PCR扩增，从而能够更快地获取基因组或转录组的信息。
三代测序技术的原理主要有以下几种：1. 单分子测序原理：这种技术通过将DNA或RNA分子固定在测序平台上，利用荧光信号的变化来识别核酸碱基的顺序。
具体而言，这种技术一般使用一种特殊的引物，将DNA或RNA单分子连接到测序平台上。
接着，通过向样本中供应一种特定的核酸碱基，当该碱基与目标分子的下一个碱基匹配时，就会释放一种荧光信号，可以通过检测这种信号来确定核酸序列。
2. 实时测序原理：这种技术通过监测DNA合成的过程中释放的荧光信号来测序。
具体而言，这种技术使用一种特殊的合成DNA酶，它能够在DNA合成过程中释放荧光信号。
在测序的过程中，使用一个特定的引物和荧光信号强度监测系统，当该引物与待测DNA的下一个碱基匹配时，会释放出荧光信号。
通过监测这种信号的变化，可以获得核酸序列信息。
3. 液相法测序原理：这种技术通过在一种特殊的反应体系中进行DNA合成和检测。
具体来说，这种技术一般使用一种特殊的酶（如聚合酶），它能够在特定的反应条件下使用脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）作为合成DNA的底物。
在反应的过程中，每添加一个核苷酸，就会释放出一种特定的荧光信号。
通过监测这种信号的强度变化，可以获得核酸的序列信息。
总的来说，三代测序技术的原理主要是通过不同的方法来区分和检测DNA或RNA分子的碱基序列，从而实现基因组或转录组的测序。
这些技术相较于传统的第二代测序技术拥有更高的测序速度和更低的成本，已被广泛应用于生物学和医学领域。
一代-二代-三代测序原理
缺少3'位的羟基的ddNTP结合到DNA链上，会使得后面的单 脱氧核苷酸（dNTP）无法再聚合上来，致使聚合反应终止。
P5与流动槽共价 连接的单链被切 断后洗掉
化学方法切断
一轮反应只能 加上一个碱基， 一个簇只能测 150-300个反应。
洗掉杂质后加 入引物I7， DNA聚合酶， 荧光标记的 dNTP，对 index 1进行测 序
洗掉杂质 后，DNA 聚合酶， 荧光标记 的dNTP， 对index 2 进行测序， 并合成另 一条链
三代测序
SMRT Cell含有纳米级的零模波导孔，每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单 分子测序，并实时检测插入碱基的荧光信号。ZMW是一个直径只有10~50 nm的孔，当激光打在ZMW底 部时，只能照亮很小的区域，DNA聚合酶就被固定在这个区域。只有在这个区域内，碱基携带的荧光基 团被激活从而被检测到，大幅地降低了背景荧光干扰。
优势4 ：实时检测碱基修饰信 息
三代测序
三代测序
三代测序
SMRT 测序建库
三代测序
Thank you for time
三代测序
1GB=10亿pb
三代测序
三代测序
二代测序dNTP荧光标记在碱基上 三代测序dNTP荧光标记在5‘磷酸基团上
三代测序
① 四色荧光基团标记的dNTP加入ZMW孔中； ② 与模板序列对应的dNTP进行配对，进入ZMW孔底物检测区域，激发光照射下发 射对应的荧光，经过光学系统转化为对应的碱基识别信号； ③ 磷酸二酯键合成后，磷酸基团脱落，荧光基团随着脱落； ④ 重复①-③ 注：经过改良的DNA聚合酶每秒合成3个碱基，确保光学系统能够捕捉到相应碱性释放 的荧光信号。而正常的DNA聚合酶在天然状态下每秒合成100多个碱基，有的甚至达
一代测序、二代测序以及三代测序的优缺点及应用对比
一代测序、二代测序以及三代测序的优缺点及应用对比一、初现庐山真面目——一代测序：又称Sanger测序（多分子，单克隆）历史：第一代DNA测序技术（又称Sanger测序）在1975年，由Sanger等人开创，并在1977年完成第一个基因组序列（噬菌体X174），全长5375个碱基。
研究人员经过30年的实践并对技术及测序策略的不断改进（如使用了不同策略的作图法、鸟枪法），2001年完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础。
原理：在4个DNA合成反应体系（含dNTP）中分别加入一定比例带有标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。
由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应。
二、江山辈有人才出——二代测序：NGS技术（多分子，多克隆）背景：Sanger测序虽读长较长、准确性高，但其测序成本高通量低等缺点，使得de novo测序、转录组测序等应用难以普及。
经过数据不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa，Hiseq技术，ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生，后起之秀Thermo Fisher的Ion Torrent技术近年来也杀入历史舞台。
1、Illumina 原理：桥式PCR 4色荧光可逆终止激光扫描成像主要步骤：①DNA文库制备——超声打断加接头②Flowcell——吸附流动DNA片段③桥式PCR扩增与变性——放大信号④测序——测序碱基转化为光学信号优势劣势：Illumina的这种测序技术每次只添加一个dNTP的特点能够很好的地解决同聚物长度的准确测量问题，它的主要测序错误来源是碱基的替换。
而读长短（200bp-500bp）也让其应用有所局限。
2、Roche 454油包水PCR 4种dNTP车轮大战检测焦磷酸水解发光主要步骤：①DNA文库制备——喷雾打断加接头②乳液PCR——注水入油独立PCR③焦磷酸测序——磁珠入孔，焦磷酸信号转化为光学信号优势劣势：454技术优势测序读长较长，平均可达400bp，缺点是无法准确测量类似于PolyA的情况时，测序反应会一次加入多个T，可能导致结果不准确。
一代二代三代测序原理
一代二代三代测序原理一代、二代和三代测序技术在测序原理上有一定的区别。
下面为您详细介绍这三代测序技术的原理：1. 一代测序（Sanger测序）：一代测序，也称为Sanger测序，是由英国生物化学家Frederick Sanger 发明的一种测序方法。
其核心原理是双脱氧链终止法，利用DNA复制过程中的终止现象进行测序。
在Sanger测序反应中，包含目标DNA片段、脱氧三磷酸核苷酸（dNTP）、双脱氧三磷酸核苷酸（ddNTP）、测序引物和DNA聚合酶等。
测序反应的关键是使用的ddNTP，由于缺少3'-OH基团，不具有与另一个dNTP连接形成磷酸二酯键的能力。
这些ddNTP可以用来中止DNA链的延伸。
在测序过程中，设置多个反应体系，分别加入引物、DNA聚合酶、四种dNTP和一定比例的ddNTP（带有放射性标记）。
例如，第一个体系中加入ddATP，负责测定T碱基的位置；依次加入ddCTP、ddTTP和ddGTP，分别测定C、T和G碱基的位置。
扩增过程中，ddNTP结合到相应的测序位点，最后通过凝胶电泳和放射自显影检测带有荧光标记的ddNTP，得到测序序列。
一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但通量低、成本高。
目前，一代测序在验证序列和验证基因组组装完整性方面被认为是金标准。
2. 二代测序（高通量测序）：二代测序，也称为高通量测序技术，相较于一代测序，具有更高的通量。
它一次可以同时测序大量的序列，从而满足对一个物种或样本中所有序列信息进行分析的需求。
二代测序的核心原理是测序by synthesis（测序合成法），利用DNA聚合酶和测序引物在模板DNA上进行实时测序。
在测序过程中，将DNA 随机打断成小片段（如250-300bp），然后通过建库和富集这些DNA 片段。
建库后的样本放入测序仪中进行测序，测序仪中有着不同的测序深度，根据碱基互补配对原则，读取测序数据并拼接成完整的序列。
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导读从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。
摘要：从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。
虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。
测序技术的每一次变革，也都对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。
在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。
图1：测序技术的发展历程生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。
以上（图1）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。
第一代测序技术第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）. 并在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基1。
自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。
研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。
在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA 合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2）。
这个网址为 sanger测序法制作了一个小短片，形象而生动。
值得注意的是，就在测序技术起步发展的这一时期中，除了Sanger法之外还出现了一些其他的测序技术，如焦磷酸测序法、链接酶法等。
其中，焦磷酸测序法是后来Roche公司454技术所使用的测序方法2–4，而连接酶测序法是后来ABI公司SOLID技术使用的测序方法2,4，但他们的共同核心手段都是利用了Sanger1中的可中断DNA合成反应的dNTP。
图2：Sanger法测序原理第二代测序技术总的说来，第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达 %，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。
因而第一代测序技术并不是最理想的测序方法。
经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina 公司的Solexa，Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。
第二代测序技术大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性，以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多。
表1和图3对第一代和第二代测序技术各自的特点以及测序成本作了一个简单的比较5，以下我将对这三种主要的第二代测序技术的主要原理和特点作一个简单的介绍。
图3. 测序成本的变化1.Illumine2.Illumina公司的Solexa和Hiseq应该说是目前全球使用量最大的第二代测序机器，这两个系列的技术核心原理是相同的2,4。
这两个系列的机器采用的都是边合成边测序的方法，它的测序过程主要分为以下4步，如图4.（1）DNA待测文库构建利用超声波把待测的DNA样本打断成小片段，目前除了组装之外和一些其他的特殊要求之外，主要是打断成200-500bp长的序列片段，并在这些小片段的两端添加上不同的接头，构建出单链DNA文库。
（2）FlowcellFlowcell是用于吸附流动DNA片段的槽道，当文库建好后，这些文库中的DNA 在通过flowcell的时候会随机附着在flowcell表面的channel上。
每个Flowcell有8个channel，每个channel的表面都附有很多接头，这些接头能和建库过程中加在DNA片段两端的接头相互配对（这就是为什么flowcell能吸附建库后的DNA的原因），并能支持 DNA在其表面进行桥式PCR的扩增。
（3）桥式PCR扩增与变性桥式PCR以Flowcell表面所固定的接头为模板，进行桥形扩增，如图所示。
经过不断的扩增和变性循环，最终每个DNA片段都将在各自的位置上集中成束，每一个束都含有单个DNA模板的很多分拷贝，进行这一过程的目的在于实现将碱基的信号强度放大，以达到测序所需的信号要求。
（4）测序测序方法采用边合成边测序的方法。
向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4中dNTP（如同Sanger测序法）。
这些dNTP的3’-OH被化学方法所保护，因而每次只能添加一个dNTP。
在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。
接着，再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，并有光学设备完成荧光信号的记录，最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。
这样荧光信号记录完成后，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP 3’-OH保护基团，以便能进行下一轮的测序反应。
Illumina的这种测序技术每次只添加一个dNTP的特点能够很好的地解决同聚物长度的准确测量问题，它的主要测序错误来源是碱基的替换，目前它的测序错误率在1%%之间，测序周期以人类基因组重测序为例，30x测序深度大约为1周。
图4. Illumina测序流程1.Roche 4542.Roche 454测序系统是第一个商业化运营二代测序技术的平台。
它的主要测序原理是（图5 abc）2：（1）DNA文库制备454测序系统的文件构建方式和illumina的不同，它是利用喷雾法将待测DNA打断成300-800bp长的小片段，并在片段两端加上不同的接头，或将待测DNA变性后用杂交引物进行PCR扩增，连接载体，构建单链DNA文库（图5a）。
（2）Emulsion PCR （乳液PCR，其实是一个注水到油的独特过程）454当然DNA扩增过程也和illumina的截然不同，它将这些单链DNA结合在水油包被的直径约28um的磁珠上，并在其上面孵育、退火。
乳液PCR最大的特点是可以形成数目庞大的独立反应空间以进行DNA扩增。
其关键技术是“注水到油”（水包油），基本过程是在PCR反应前，将包含PCR所有反应成分的水溶液注入到高速旋转的矿物油表面，水溶液瞬间形成无数个被矿物油包裹的小水滴。
这些小水滴就构成了独立的PCR反应空间。
理想状态下，每个小水滴只含一个DNA模板和一个磁珠。
这些被小水滴包被的磁珠表面含有与接头互补的DNA序列，因此这些单链DNA序列能够特异地结合在磁珠上。
同时孵育体系中含有PCR反应试剂，所以保证了每个与磁珠结合的小片段都能独立进行PCR扩增，并且扩增产物仍可以结合到磁珠上。
当反应完成后，可以破坏孵育体系并将带有DNA的磁珠富集下来。
进过扩增，每个小片段都将被扩增约100万倍，从而达到下一步测序所要求的DNA量。
（3）焦磷酸测序测序前需要先用一种聚合酶和单链结合蛋白处理带有DNA的磁珠，接着将磁珠放在一种PTP平板上。
这种平板上特制有许多直径约为44um的小孔，每个小孔仅能容纳一个磁珠，通过这种方法来固定每个磁珠的位置，以便检测接下来的测序反应过程。
测序方法采用焦磷酸测序法，将一种比PTP板上小孔直径更小的磁珠放入小孔中，启动测序反应。
测序反应以磁珠上大量扩增出的单链DNA为模板，每次反应加入一种dNTP进行合成反应。
如果dNTP能与待测序列配对，则会在合成后释放焦磷酸基团。
释放的焦磷酸基团会与反应体系中的ATP硫酸化学酶反应生成ATP。
生成的ATP和荧光素酶共同氧化使测序反应中的荧光素分子并发出荧光，同时由 PTP板另一侧的CCD照相机记录，最后通过计算机进行光信号处理而获得最终的测序结果。
由于每一种dNTP在反应中产生的荧光颜色不同，因此可以根据荧光的颜色来判断被测分子的序列。
反应结束后，游离的dNTP会在双磷酸酶的作用下降解ATP，从而导致荧光淬灭，以便使测序反应进入下一个循环。
由于 454测序技术中，每个测序反应都在PTP板上独立的小孔中进行，因而能大大降低相互间的干扰和测序偏差。
454技术最大的优势在于其能获得较长的测序读长，当前454技术的平均读长可达400bp，并且454技术和illumina的Solexa和Hiseq技术不同，它最主要的一个缺点是无法准确测量同聚物的长度，如当序列中存在类似于PolyA的情况时，测序反应会一次加入多个T，而所加入的T的个数只能通过荧光强度推测获得，这就有可能导致结果不准确。
也正是由于这一原因，454技术会在测序过程中引入插入和缺失的测序错误。
图5. Roche 454测序流程1.Solid技术2.Solid测序技术是ABI公司于2007年开始投入用于商业测序应用的仪器。
它基于连接酶法，即利用DNA连接酶在连接过程之中测序（图6）2,4。
它的原理是：图6-a. Solid测序技术（1）DNA文库构建片段打断并在片段两端加上测序接头，连接载体，构建单链DNA文库。
（2）Emulsion PCRSolid的PCR过程也和454的方法类似，同样采用小水滴emulsion PCR，但这些微珠比起454系统来说则要小得多，只有1um。
在扩增的同时对扩增产物的3’端进行修饰，这是为下一步的测序过程作的准备。
3’修饰的微珠会被沉积在一块玻片上。
在微珠上样的过程中，沉积小室将每张玻片分成1个、4个或8个测序区域（图6-a）。
Solid系统最大的优点就是每张玻片能容纳比454更高密度的微珠，在同一系统中轻松实现更高的通量。
（3）连接酶测序这一步是Solid测序的独特之处。
它并没有采用以前测序时所常用的DNA聚合酶，而是采用了连接酶。
Solid连接反应的底物是8碱基单链荧光探针混合物，这里将其简单表示为：3’-XXnnnzzz-5’。
连接反应中，这些探针按照碱基互补规则与单链DNA模板链配对。
探针的5’末端分别标记了CY5、Texas Red、CY3、6-FAM这4种颜色的荧光染料（图6-a）。
这个8碱基单链荧光探针中，第1和第2位碱基（XX）上的碱基是确定的，并根据种类的不同在6-8位（zzz）上加上了不同的荧光标记。
这是Solid的独特测序法，两个碱基确定一个荧光信号，相当于一次能决定两个碱基。