第三代测序技术的三种技术平台介绍
二三代测序技术的介绍和比较
二三代测序技术的介绍和比较二代测序技术（也称为高通量测序技术）和三代测序技术是目前最常用的两种DNA测序技术。
下面将对这两种技术进行详细介绍和比较。
1.二代测序技术：二代测序技术的代表性平台包括Illumina HiSeq、Ion Torrent PGM 等。
其工作原理是将DNA样本切割为较短的片段，并通过PCR扩增产生大量的拷贝。
然后，这些片段被连接在测序芯片上，每个片段都被反复地鸟嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）、鸟嘧啶（G）四种碱基中的一种互补的碱基识读，并记录下与之相对应的碱基序列。
这些碱基序列最后被计算机软件组装为完整的DNA序列，进而获取样本的遗传信息。
优点：（1）高通量：可以同时测序数百万个DNA片段，获得庞大数量的数据。
（2）成本低廉：通过并行测序的方式，可以大大减少测序成本。
（3）高精度：二代测序技术的错误率较低，可以达到0.1%以下。
（4）测序速度快：每天可获得几百GB的数据。
缺点：（1）仅适用于短序列：由于二代测序技术的局限性，只能测序相对较短的DNA片段，对于长序列的测序存在困难。
（2）高度依赖参考序列：在组装过程中，需要有可靠的参考序列作为基础，否则可能出现组装错误。
（3）无法解析复杂的基因组结构：由于只能产生相对较短的序列片段，二代测序技术无法很好地解析复杂的基因结构，例如重复序列。
2.三代测序技术：三代测序技术的代表性平台包括PacBio SMRT、Oxford Nanopore等。
三代测序技术的特点是可以直接测量DNA单分子的临床序列。
该技术中的样本DNA被引入到小孔中，随后测序设备会通过测量DNA分子在小孔中的电信号变化来捕捉和记录碱基序列。
这种技术可以完整地获取较长的DNA片段，从而提供了更全面和准确的基因组信息。
优点：（1）长读长：能够测序较长的DNA片段，可以获得更全面和准确的基因组信息。
（2）无需参考序列：三代测序技术不需要依赖已知的参考序列，可以直接解析未知基因组。
三代基因组测序技术简介及其原理整理
三代基因组测序技术简介及其原理整理第一代测序技术第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法以及1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）。
1977年，桑格测定了第一个基因组序列——噬菌体X174，全长5375个碱基。
自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。
研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。
在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础。
Sanger法原理：1）在模板指导下，DNA聚合酶不断将dNTP（N=A/G/T/ C）加到引物的3’- OH末端，合成出新的互补链。
在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP，在互补链在DNA聚合酶作用下延伸时，一旦连接上ddNTP，由于双脱氧核糖的2’和3’都不含羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键而终止反应，随即形成一系列不同长度的、以同样引物为起始、以同一碱基终止的短片段混合物。
2）双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，从而读取DNA核苷酸序列。
化学裂解法原理：与Sanger法类似，将DNA模板分成4个反应。
在每个反应中，先在模板5’端进行放射性标记，再加入能特异性在其中一种碱基处切开DNA的化学试剂。
反应进行时，平均一个DNA分子只在随机位点产生一次裂解。
接着，通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。
第二代测序技术第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。
因而第一代测序技术并不是最理想的测序方法。
经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa，Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。
华大基因、达安基因、贝瑞和康三大无创DNA检测技术平台比较
华大基因、达安基因、贝瑞和康三大无创DNA检测技术平台比较点击数：7561录入时间：2014-6-6[打印此页][返回]2014年2月，国家食药监总局和卫计委联合发布通知，暂停基因测序临床应用。
而在临床医学上，基因测序应用最广泛、最成熟的是无创产前基因检测，尤其是产前唐氏综合征筛查。
相比于传统技术，无创产前基因检测仅需抽取少量孕妇外周血，用高通量测序技术即可准确分析胎儿是否患有染色体疾病，具有安全、快速、检测周期短等优势，已逐渐被中国大众所接受。
据统计，无创产前基因检测目前在中国已经积累了超过40万例临床应用。
“叫停令”直接影响了国内多家实施基因检测的公司，但所幸的是，“叫停”并不是完全停止，通知第二条规定：“基因测序诊断产品应按规定经食品药品监管部门审批注册，并经卫生计生行政部门批准技术准入方可应用。
”中国当前市场使用的测序仪均不符合这一条件。
为促进无创产前基因检测在中国市场尽快获批，各大测序服务提供商开始通过高通量基因测序仪的“国产化”，来满足现有的监管法规要求。
贝瑞和康此次联合Illumina共同生产新型测序仪，并向食药总局申请注册，使得Illumina公司的测序平台进入了中国的注册审批程序。
据财新网消息，除贝瑞和康外，当前正在向食药总局申请注册的“国产”测序仪包括：华大基因的BGISEQ1000（基于CG的测序平台）、中山大学达安基因股份有限公司的DA8600（基于Life Technologies公司的Ion Proton测序平台）。
这些公司都是国内无创产前检测的领头公司。
现在，他们站在差不多同一条起跑线上，将在中国市场上进行搏杀。
他们之间的竞争，将会走向何方？我们可以从各自使用的技术平台和申报国家医疗器械注册证情况探知一二。
竞争激烈“国产化”将走向何方？当前，全球市场上测序仪最主要的提供商是美国的Illumina公司和Life Technologies公司，我国市场上的基因测序仪也几乎被这两家公司垄断。
第三代测序技术介绍
• 基因测序，硝烟再起。总部位于加利福尼 亚州卡尔斯巴德的Life Technologies公司宣 布，今年将在第一代测序仪 Personal Genome Machine的基础上推出一 款新的测序机器：Ion Proton。它是由 Life Technologies的子公司Ion Torrent研发的， 能够在一天内完成全部基因组测序，而且 所需花费不到1000美元。
3. Oxford Nanopore Technologies公司 公司
• Oxford Nanopore Technologies公司正在研究 的纳米孔单分子技术是一种基于电信号测 序的技术。他们设计了一种以α-溶血素为材 料制作的纳米孔，在孔内共价结合有分子 接头环糊精。用核酸外切酶切割ssDNA时， 被切下来的单个碱基会落入纳米孔，并和 纳米孔内的环糊精相互作用，短暂地影响 流过纳米孔的电流强度，这种电流强度的 变化幅度就成为每种碱基的特征。
2. Pacific Biosciences公司 公司
• Pacific Biosciences公司的SMRT技术基于边合成边测序的思想， 以SMRT芯片为测序载体进行测序反应。SMRT芯片是一种带有 很多ZMW(zero-mode waveguides)孔的厚度为100 nm的金属片。 将DNA聚合酶、待测序列和不同荧光标记的dNTP放入ZMW孔的 底部，进行合成反应。与其他技术不同的是，荧光标记的位置 是磷酸基团而不是碱基。当一个dNTP被添加到合成链上的同时， 它会进入ZMW孔的荧光信号检测区并在激光束的激发下发出荧 光，根据荧光的种类就可以判定dNTP的种类。此外由于dNTP在 荧光信号检测区停留的时间（毫秒级）与它进入和离开的时间 （ 微秒级） 相比会很长，所以信号强度会很大。其它未参与合 成的dNTP由于没进入荧光型号检测区而不会发出荧光。在下一 个dNTP被添加到合成链之前，这个dNTP的磷酸基团会被氟聚合 物（fluoropolymer）切割并释放，荧光分子离开荧光信号检测 区。
第三代测序技术单分子即时测序
第三代测序技术:单分子即时测序・７１８・第三代测序技术：单分子即时测序刘岩吴秉铨ＤＮＡ测序技术是分子生物学研究中最常用的技术，它的出现极大地推动了生物学的发展。
从人类基因组计划（ｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｅｐｒｏｊｅｃｔ），到人类基因组单倍型图计划（ＨａｐＭａｐ），再到人类癌症基因组及个体基因组计划，第一代和第二代ＤＮＡ测序技术功不可没。
特别是近几年发展起来的第二代ＤＮＡ测序技术则使得ＤＮＡ测序进入了高通量、低成本的时代。
目前，基于单分子读取技术的第三代测序技术已经出现，该技术测定ＤＮＡ序列更快，并有望进一步降低测序成本，为人类从基因水平深入理解疾病的发生、发展、诊断和治疗提供新的手段，使个体化医疗成为现实。
本文回顾了测序技术发展过程，并对第三代测序技术的特点和优势进行详细论述。
一、第一代ＤＮＡ测序（ｆｉｒｓｔ—ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）成熟的ＤＮＡ测序技术始于２０世纪７０年代中期，１９７７年Ｍａｘａｍ和Ｇｉｌｂｅｒｔ…报道了通过化学降解测定ＤＮＡ序列的方法。
同一时期，Ｓａｎｇｅｒ等拉１发明了双脱氧链终止法，基本原理是利用４种双脱氧核苷酸（ｄｄＮＴＰ）代替脱氧核苷酸（ｄＮＴＰ）作为底物进行ＤＮＡ合成反应。
一旦ｄｄＮＴＰ掺入到ＤＮＡ链中，由于核糖的第３位碳原子上不含羟基，不能与下一核苷酸反应形成磷酸二酯键，ＤＮＡ合成链的延伸反应被终止，生成了若干长度仅相差单个碱基的ＤＮＡ片段。
在４个ＤＮＡ合成反应体系中，分别加入一定比例的带有放射性同位素标记的某种ｄｄＮＴＰ，通过单碱基分辨率的凝胶电泳分离不同长度的ＤＮＡ片段和放射自显影后，可以根据电泳带的位置确定待测ＤＮＡ分子的序列。
２０世纪９０年代初出现的荧光自动测序技术也是基于Ｓａｎｇｅｒ等¨１原理。
但用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了ＤＮＡ测序的速度和准确性，将ＤＮＡ测序带入自动化测序的时代，这些技术统称为第一代ＤＮＡ测序技术。
三代测序
第一代测序技术1977年，Sanger发明的DNA双脱氧核苷酸末端终止测序法（chainter⁃minatorsequencing）和A.M.Maxam和W.Gilbert 报道的DNA化学降解测序法(chemicaldegradationse⁃quencing)为代表的第一代测序技术诞生，但由于化学降解法的程序复杂，后来逐渐被Sanger测序法代替。
Sanger测序法原理：双脱氧核苷酸没有3′-OH，且DNA聚合酶对其没有排斥性。
当添加放射性同位素标记的引物时，在聚合酶作用下ddNTP被合成到链上，但其后的核苷酸无法连接，合成反应也随之终止，后续再根据各个合成片段的大小不同进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影后，便可根据片段大小排序及相应泳道的末端核苷酸信息读出整个片段的序列信息。
通过调节加入的dNTP和ddNTP的相对量即可获得较长或较短的末端终止片段。
一代测序的特点：速度快，但是一次只能测一条单一的序列，且最长也就能测1000-1500bp。
所以被广泛应用在单序列测序上。
在小型的细菌基因组测序、质粒测序、细菌人工染色体末端测序、突变位点验证等研究领域中较为常见。
第二代测序技术第二代测序技术也称为新一代测序技术NGS(Next Generation Sequencing)，相比第一代测序技术，总体往高通量、低成本方向发展。
第二代测序技术的核心思想是边合成边测序（Sequencing by Synthesis），即通过捕捉新合成末端的标记来确定DNA的序列。
其特点是能一次并行几十万到几百万条DNA分子的序列测定，且一般读长较短。
通过物理或是化学的方式将DNA随机打断成无数的小片段（250-300bp），之后通过建库）富集了这些DNA片段。
接下来将建完的库放入测序仪中测序，测序仪中有着可以让DNA片段附着的区域，每一个片段都有独立的附着区域，这样测序仪可以一次检测所有附着的DNA序列信息。
最后通过生物信息学分析将小片段拼接成长片段。
第三代测序技术原理
第三代测序技术原理
第三代测序技术是一种新型的高通量DNA测序技术，相较于第二代测序技术，其具有更高的准确性和更高的读长，可以更好地解决一些基因组学研究领域中的难题。
第三代测序技术的原理是基于单分子测序，即将单个DNA分子进行直接测序，避免了PCR扩增等步骤对样本的影响。
该技术的主要方法包括单分子实时测序、纳米孔测序和光学显微镜测序等。
其中，单分子实时测序采用的是荧光标记的核苷酸，通过读取荧光信号来确定每个核苷酸的序列。
纳米孔测序则是将DNA分子通过纳米孔，测量通过纳米孔时所产生的电流变化，从而获得每个核苷酸的序列。
光学显微镜测序则是通过观察DNA分子的荧光信号，确定每个核苷酸的序列。
与第二代测序技术相比，第三代测序技术在读长、准确性和检测能力等方面都有明显提高。
它可以实现单分子、单细胞、全基因组和全转录组等领域的研究，有望在生物医学、农业、环境等领域产生广泛的应用。
- 1 -。
三代测序技术的应用以及与二代技术的比较
微生物组
无需打断、无需组装，转录本直接反转录得全长cDNA
平均读长15K，无需PCR，均匀覆盖基因组
测序同时直接检测各种碱基修饰、脉冲间隔持续时间IPD不同来识别
快速获得基因组完成图
根据长度不同，会建600bp（Hiseq测））如DNA甲基化，检测同、同源基因、超家族基因或等位基因表达的转录本
解决高GC、高重复和海量段序列组装困扰
25中碱基修饰，如5-mC,N6-mA、DNA损伤
目前主要应用领域，解决GC异常、高重复区
SMRT-Analysis、Gmap、
Hiseq、Miseq
基因组组装
二代补洞、三代辅助组装提升contig N50；IRYS光学图谱，提升Scaffold N50到染色体水平【将Scaffold N50再浓缩提升延长】
读长较短，只能组装到Scaffold水平
特点
做结构鉴定isoform
做表达鉴定（可以检测低丰度的）
PE150、PE300
测序准确率
单次测序准确率87.5%，测序深度15X准确度达到Q40，30Xun(8个SMRT cell) 8G
一个Lane 60G [Hiseq PE150]
一个Lane 15G[Miseq PE300]
代表
PacBio、Oxford Nanopore
SMRT-Analysis、组装【HGAP、MHAP、Falcon】
Params.xml
二代、三代测序平台比较
三代测序技术
二代测序技术
A经PCR扩增后形成分子簇，变合成边测序
测序对象
单分子DNA
PCR扩增后的DNA分子簇
测序读长
平均15K，最长45K
三代测序也叫单分子实时测序（SMRT），PacBio SMRT技术，不需要进行PCR扩增，具备超长读长、高准确率、高敏感性、无GC偏向性和直接检测修饰碱基等特点，能解决二代测序的海量数据拼接困难、稀有突变被淹没、高GC区域无法跨越、高重复片段无法准确测定的困扰。
三代测序技术的比较
一代、二代、三代测序技术张祥瑞2013/04/22 11:43第一代测序技术-Sanger链终止法一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先发明。
其基本原理是，聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来。
一代测序实验的起始材料是均一的单链DNA分子。
第一步是短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火，然后该寡聚核苷酸就充当引物来合成与模板互补的新的DNA链。
用双脱氧核苷酸作为链终止试剂（双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需要的3－OH基团，所以可被用作链终止试剂）通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。
测序引物与单链DNA模板分子结合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物。
延伸反应分四组进行，每一组分别用四种ddNTP（双脱氧核苷酸）中的一种来进行终止，再用PAGE分析四组样品。
从得到的PAGE胶上可以读出我们需要的序列。
第二代测序技术-大规模平行测序大规模平行测序平台（massively parallel DNA sequencing platform）的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。
新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。
市面上出现了很多新一代测序仪产品，例如美国Roche Applied Science公司的454基因组测序仪、美国Illumina公司和英国Solexa technology公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司的SOLiD测序仪。
Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。
在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。
三代测序技术的应用以及与二代技术的比较
微生物组
无需打断、无需组装，转录本直接反转录得全长cDNA
平均读长15K，无需PCR，均匀覆盖基因组
测序同时直接检测各种碱基修饰、脉冲间隔持续时间IPD不同来识别
快速获得基因组完成图
根据长度不同，会建600bp（Hiseq测）【HGAP、MHAP、Falcon】
Params.xml
二代、三代测序平台比较
三代测序技术
二代测序技术
A经PCR扩增后形成分子簇，变合成边测序
测序对象
单分子DNA
PCR扩增后的DNA分子簇
测序读长
平均15K，最长45K
PE150、PE300
测序准确率
单次测序准确率87.5%，测序深度15X准确度达到Q40，30X达到Q50
通常Q30
通量
一个run(8个SMRT cell) 8G
一个Lane 60G [Hiseq PE150]
一个Lane 15G[Miseq PE300]
代表
PacBio、Oxford Nanopore
三代测序也叫单分子实时测序（SMRT），PacBio SMRT技术，不需要进行PCR扩增，具备超长读长、高准确率、高敏感性、无GC偏向性和直接检测修饰碱基等特点，能解决二代测序的海量数据拼接困难、稀有突变被淹没、高GC区域无法跨越、高重复片段无法准确测定的困扰。
三代测序应用范围
全长转录组
全基因组De novo
Hiseq、Miseq
基因组组装
二代补洞、三代辅助组装提升contig N50；IRYS光学图谱，提升Scaffold N50到染色体水平【将Scaffold N50再浓缩提升延长】
读长较短，只能组做表达鉴定（可以检测低丰度、同源基因、超家族基因或等位基因表达的转录本
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第三代测序技术的三种技术平台介绍
随着生物学的发展，人们对基因的功能研究更加透彻，为了进一步研究和改造基因的目的需要详细了解生物的基因组全序列，因为DNA序列是改造基因的基础，这就要求具有高效的DNA测序技术。
DNA测序技术到目前为止已经发展到了第三代测序技术。
最早的Sanger测序在人类基因组计划中立下赫赫战功，但也给基因组测序贴上了数亿美元的价格标签，让人生畏。
这两年发展迅猛的第二代测序仪——Illumina的Genome Analyzer、Roche 454的GS系列以及ABI的SOLiD系统——让人类基因组重测序的费用蹭地降低到10万美元以下。
现在，能对单个DNA分子进行测序的第三代测序仪也加入到这场比赛中，让竞争更加激烈。
目前，第三代测序主要有三种技术平台。
两种通过掺入并检测荧光标记的核苷酸，来实现单分子测序。
Helicos的遗传分析系统已上市，而Pacific Biosciences准备在明年推出单分子实时(SMRT)技术。
第三种Oxford Nanopore的纳米孔(nanopore)测序还尚未有推出的时间表，但有可能是这三种当中最便宜的。
纳米孔测序的优势在于它不需要对DNA进行标记，也就省去了昂贵的荧光试剂和CCD照相机。
最近，Oxford Nanopore T echnologies的Hagan Bayley及他的研究小组正致力于改善纳米孔。
根据他们之前的工作，他们以a-溶血素来设计纳米孔，并将环式糊精共价结合在孔的内侧(下图)。
当核酸外切酶消化单链DNA后，单个碱基落入孔中，它们瞬间与环式糊精相互作用，并阻碍了穿过孔中的电流。
每个碱基ATGC以及甲基胞嘧啶都有自己特有的电流振幅，因此很容易转化成DNA序列。
每个碱基也有特有的平均停留时间，它的解离速率常数是电压依赖的，+180 mV的电位能确保碱基从孔的另一侧离开。
a-溶血素纳米孔(剖面图)以及共价结合的环式糊精(浅蓝色)瞬间结合落入孔中的碱基
(红色)。
以往对甲基胞嘧啶进行测序，都要先进行重亚硫酸盐转化，而纳米孔技术能直接读出这第五种碱基。
这对表观基因组测序的研究人员来说可谓是个好消息。
纳米孔测序预计能满足大部分测序用户的需求：99.8%的准确性相当高，且错误很容易通过计算来纠正。
均聚物延伸也没有问题，因为纳米孔记录每一个碱基，而不管其前后的碱基。
读长也会很长。
Bayley认为：“它有可能读取数千个碱基，序列质量也不会下降。
即使中途有一些小差错，它也可以重新开始。
”
但是，Oxford Nanopore的测序仪仍面临两个重要的技术问题。
一是如何将核酸外切酶更好地附着在孔上，让它每次只掉入一个碱基，这是一个大挑战。
另一个是并行化。
这个问题可能简单一些。
他们可以开发出一个芯片，上面有数万个孔，来确保整个测序过程更快速。
在纳米孔测序技术的推动下，实现千元基因组的目标指日可待了。
基因测序技术始于上个世界70年代，到目前为止已经发展到了第三代测序技术。
第三代纳米孔测序技术因为其不再需要荧光标记物使测序价格大大降低，这项技术预示着基因测序技术又登上了一个新的台阶。