MRSA耐药机制与分子生物学检测方法研究新进展_杨长顺

·综　述·M RSA 耐药机制与分子生物学检测方法研究新进展杨长顺,审校刘文恩(中南大学湘雅医院,湖南长沙410008)关键词:M RSA ;耐药机制;分子生物学检测方法中图分类号:R378.1+1 文献标识码:A 文章编号:1005-4529(2007)03-0356-03收稿日期:2006-07-16;　修回日期:2006-10-20 随着抗菌药物的广泛使用,出现了越来越多的耐药性细菌。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(M RSA )就是其中很重要的一种,由于其传播速度快,并且表现出多重耐药性,常引起感染的流行及暴发流行。

目前M RSA 感染已与H BV 、A IDS 并列世界范围内的3大难解决的感染性疾病。

笔者就其流行特点、耐药机制及分子生物学检测方法进行综述。

1　M RSA 的流行特点 1961年Jev ons 在英国首次发现M RSA ,20世纪60年代中期扩展至欧洲许多国家及加拿大。

70年代末M RSA 急剧增多遍及全球,耐药范围日益扩大,耐药程度也日益严重。

80年代后期已成为全球性的病原微生物,居医院感染病原菌的首位,占大型教学医院分离金黄色葡萄球菌的60%～80%。

特别是氟喹诺酮类药物应用于临床后,对其耐药的金黄色葡萄球菌迅速出现,而且>90%为M RSA 。

由于M RSA 对多种抗菌药物具有广泛耐药性,对其可用的仅为万古霉素等糖肽类抗菌药物。

但是在90年代后期又出现了耐万古霉素M RSA ,开始表现为中介度耐万古霉素金黄色葡萄球菌(V ISA ),美、英、德、意大利、韩国等相继报道检出了V ISA [1]。

2002年美国密执安州及宾夕法尼亚州先后报道了完全耐万古霉素M RSA (V RSA )[2,3],2004年美国报道了第3株V RS A[4],并为美国感染性疾病控制中心确证。

临床上对其治疗可选用的抗菌药物越来越少,使得M RSA 成为临床最关注的一类耐药菌。

2　M RSA 的耐药机制 M RSA 的耐药机制很复杂,主要包括由染色体介导的固有耐药和通过质粒转移获得的耐药(如V anA 介导的万古霉素耐药[5])、基因表达调控有关的耐药和主动外排系统等。

2.1　耐药有关的基因2.1.1　mecA 基因　mecA 基因是M RSA 特有的耐药基因,在其耐药性中起决定性的作用。

最近Lee[6]的研究也体现了它在M RSA 耐药性中的重要作用。

mecA 是一个外源基因,来自凝固酶阴性葡萄球菌或肠球菌属,通过转座子或R 质粒转到原本敏感的金黄色葡萄球菌中,并整合在染色体第10节段上。

mecA 基因编码78×103的蛋白,是一种对β-内酰胺类抗菌药物具低亲和力的青霉素结合蛋白即(PBP2a )。

当金黄色葡萄球菌固有的P BP s 被β-内酰胺类抗菌药物结合失活后,P BP2a 能替代结合失活的PBP s 发挥转肽酶的功能,促进细胞壁合成,从而产生耐药性。

2.1.2　vanA 基因　va nA 操纵子位于T n1546,T n1546在金黄色葡萄球菌对万古霉素的耐药性中起重要作用[7],它可以通过质粒自由转移。

这些质粒并非肠球菌属所特有,而是可以通过转移到多种革兰阳性球菌中去,因此当M RSA 接受此质粒后,就会产生相应的耐药性。

No ble 等经体外实验证实肠球菌属的耐药基因va nA 能通过结合转移进入金黄色葡萄球菌,导致金黄色葡萄球菌对万古霉素高度耐药。

最近M ly na rczy k 等[8]研究也发现:肠球菌属通过结合转移可使受体菌(肠球菌属和金黄色葡萄球菌)获得万古霉素耐药性。

美国分离的世界上第1株临床VRSA 含有肠球菌万古霉素耐药基因-vanA 基因,而且该患者有耐万古霉素肠球菌(V RE )感染[1,9]。

Severin 等[10]也证实了vanA 基因在M RSA 对万古霉素的耐药性中的重要作用。

2.1.3　辅助基因　M RSA 具有异质性耐药的特点即不同菌株表现出不同程度的耐药性,但M RSA 耐药水平的高低与mecA 基因的表达水平及PBP2a 的产量无关,据此推测金黄色葡萄球菌染色体中,存在与异质性耐药有关的辅助基因。

实验证明的确存在这种辅助基因,即fem 基因。

fem 基因是独立于mecA 基因的新基因,研究发现fem 基因与M RSA 耐药性的表达有关。

现已确定的fem 基因有4种:fem A 、femB 、femC 、femD ,这些基因一起参与M RSA 耐药性的表达。

2.2　主动外排系统　细菌的主动外排系统是在1980年由Ball 和M cM urry 在研究大肠埃希菌对四环素的耐药性时同时发现的。

之后学者们对主动外排系统进行了大量的研究,证实了主动外排系统是细菌的正常生理结构,在敏感株中同样也存在。

当长时间受到环境中底物诱导时,系统的基因被激活,表达增加,外排药物的功能大大增强,因此表现出耐药性。

M RSA 对多种药物存在耐药性,主动外排系统在其中发挥了作用。

存在于金黄色葡萄球菌细胞膜上的多药泵出蛋白有3种:QacA 、N o rA 、Smr 。

No guchi 等[11]认为Q acA 是M RSA 中很重要的一种。

多药泵出蛋白都属于质子驱动蛋白(PM F ):即不是依赖于A T P 水解释放能量,而是通过细胞膜两侧H +形成的电化学梯度进行物质交换,通常是一个反·356·Chin J N osocomiol Vo l .17N o .32007转过程:即H+从胞外到胞内,而胞内有害物质如染料、抗菌药物从胞内流向胞外。

K ristiansen等[12]的实验,也证明了主动外排系统在M RSA耐药性中的作用。

2.3　基因表达的调控　mecA转录调控系统主要有两种即mec R1-mec1系统和blaR1-bla1系统。

G arcia-Castellano s 等[13]研究证实mecR1-mec1在M RSA中的作用。

mecR1-mec1位于mecA基因的上游,编码蛋白调节P BP2a的产生。

而blaR1-bla1原本是调节blaZ基因,而blaZ基因编码β-内酰胺酶,但在某些M RSA菌株中,它调控mecA基因的作用比mecR1-mec1还强。

它的作用机制可能为当BlaR1(一种跨膜蛋白)接触到β-内酰胺抗菌药物刺激后,即将信号传向胞内,与mecA基因启动子结合的Bla1蛋白接受信号后即从结合位点脱落,从而使mecA基因转录,最终产生P BP2a。

3　检测方法 美国临床及实验室标准学会(CLSI)推荐M RSA的检测方法为药敏纸片法、苯唑西林-盐琼脂筛查法、β-内酰胺酶检测、E-test试验和试管双倍稀释法等。

这类方法鉴定依据是金黄色葡萄球菌的耐药表型,根据抑菌环大小或在含一定浓度抗菌药物培养基中生长情况判定。

为克服表型的异质性,传统方法采用不易降解,M RSA异质性相对较低的苯唑西林,通过适当培养条件如在30℃或35℃培养,提高培养基NaCl浓度(2%～4%),强化耐药性表达,延长培养时间(至少24h)来提高准确性。

但这些方法需要的时间长,结果重现性比较差,且对于临界耐药的细菌显得无能为力。

本综述就其快速准确灵敏的检验方法即分子生物学检测方法加以介绍,主要针对M RSA特有的基因mecA,葡萄球菌属具有的fem、nuc(耐热核酸酶基因)等进行检测。

3.1　核酸杂交技术　mecA基因是M RSA特有的外来性基因,在敏感株中不存在,所以临床分离的M RSA均含有mecA基因。

当基因被克隆测序后,据此设计了放射性核素、地高辛及酶等标志的特异性的DN A探针与mecA片段进行杂交来鉴定M RSA。

目前常采用菌落原位杂交、斑点杂交和So uthe rn印迹法。

Ko lber t利用化学发光杂交法检测mecA 基因。

Fong等[14]建立了一种检测M RSA mecA基因的循环探针技术(CPT),该方法分为两部分:CPT和试纸检测。

CP T针对mecA基因设计的DN A-RNA-DN A探针的5′及3′端分别用荧光素(fluorescein,F)/生物素(bio tin,B)标志。

模板DN A与探针在55℃恒温下作用25min,若为M RSA,探针与模板退火结合,RN ase H切割聚合体的RN A部分,被切割探针由于退火温度不同,从模板上解离,释放模板可用于下一轮杂交。

若为M SSA,不与模板结合的探针不能被RN ase H切割,保持完整的F-D NA-RNA-DN A-B形式。

检测纸条包括结合金颗粒的鼠抗荧光素抗体(anti-F-G P)部分和浸有生物素及Ig G的硝酸纤维素滤膜部分。

CP T实验结束后,将试纸条浸入CP T反应液中,若为M SSA,完整的探针F-DN A-RN A-DN A-B与anti-F-G P结合,并靠B端被生物素截留,从而在试纸上出现“测试线”,而M RSA无此线。

第2条“测试线"作为检测反应液是否浸满试纸的对照线。

由anti-F-G P与兔抗鼠IgG结合产生,若无此线,则测试不合格。

总之,无论采用哪种杂交方法,与药敏实验方法比较敏感度高,耗时短,尤其是对药敏实验方法难以确定的临界耐药菌株,用该方法能获得较客观的结果。

3.2　PC R技术　聚合酶链反应(PCR)技术的问世,为人们提供了新的M RSA检测方法。

mecA基因高度保守,根据其核苷酸序列设计不同的引物,PC R对其进行扩增,以mecA 基因的存在与否判定是否为M RSA菌株。

由于PC R方法特异性强,灵敏度高而在鉴定中得到广泛应用,并逐步被发展和完善,目前P CR检测mecA基因成为M RSA鉴定的金标准。

Kear ns则发展了一种认为快速而可靠的复合PCR法,该方法同时检测凝固酶基因和mecA基因,既可把葡萄球菌属分类鉴定为SA U和CN S,又可判断其耐药类型,为临床诊断和治疗M RS A感染提供了可靠依据和节省宝贵的时间[15]。

N ilsso n等[16]应用实时PCR来检测M RSA,他首先用M RSA选择性肉汤增菌16h,然后定量检测nuc基因来确定M RSA。

Perez-Ro th等[17]运用多重PCR在一个反应管中同时检测femB、mecA和ileS22[编码莫匹罗星(mupir ocin)耐药的基因],从而可检测出莫匹罗星耐药的M RSA。

Fra n-cois等[18]则应用多重实时定量PC R直接从临床标本中检测M RSA,使检测时间大大缩短。

此外,荧光增强重复序列PCR、等温信号扩增法等技术都有快速、灵敏、特异的特点。

最近的酶联PC R(ED-PCR),将P CR及酶联试验的优点结合起来,免去了PCR琼脂糖凝胶电泳分析的步骤,整个过程只需3h。