仔猪黄痢实验室诊断技术

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畜牧与饲料科学
第 31 卷
学特异性检查。
最后用蒸馏水漂洗 30 s。 甩干后，加 pH 值 7.4 缓冲甘油，盖
3.5 动物试验 通常利用小鼠 、豚鼠、家兔和断奶猪 ，做经 上盖玻片，用荧光显微镜检查。 猪痢疾蛇形螺旋体可发出耀
口感染试验和肠结扎试验。 经口感染试验，用猪痢疾蛇形螺 眼的黄绿色荧光。 同时应设立空白对照片。
可将分离的菌株接种普通肉汤，取 18 h 肉汤培养物 0.5 mL 口服感染 未 吃 初 乳 的 新 生仔 猪 ，如 发 生 腹 泻 ，并 排 特征 性黄色糊状粪便，即可确诊。 4 定型检查
对已经生化试验鉴定的大肠杆菌纯培养物 ，可用 K88、 K99、987P、F41 及 O141 等因子血清， 做活菌平板凝集试验 定型检查。 取 1 滴标准因子血清于平板上，用接种环取少许 待鉴定培养物 ，与血清混合均匀 ，在室温下于 3 min 内判定 完毕。 出现凝集团块者为阳性，同时设盐水对照以检查待检
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鼠接种 0.1 mL。 同时样培养基的 100 mL 三角瓶中，又经 物接种的对照组 。 ③结果判定。 接种后 2～3 h 将鼠麻醉致
(2)：361.
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为主要特征，多见于 1~3 日龄的乳猪，7 日龄以上的仔猪很少发病。 该病在我国大多数省、市和自治区均有不同程度的发
生与流行。 笔者对仔猪黄痢的实验室诊断技术进行阐述，以期为该病的诊断提供参考。
关键词：仔猪黄痢；大肠杆菌；实验室诊断
中 图 分 类 号 ：S858.281.2
文 献 标 识 码 ：A
文 章 顺 序 编 号 ：1672-5190(2010)04-0121-01
在养猪业不断趋向规模化和集约化发展的今天， 各种 细 菌 性 、 病 毒 性 疾 病 也 在 蔓 延 和 扩 大 。 仔 猪 黄 痢 (yellow scour of newborn piglets)，就是一种由致病性大肠杆菌引起的 一种急性高度致死性肠道传染病。 该病主要发生于刚出生 后不久到 7 日龄仔猪，以剧烈腹泻、排出黄色或黄白色水样 粪便以及迅速脱水死亡为特征。 据调查，我国仔猪死亡率一 般波动在 15%～25%之间，其中 70%的死亡被认为是致病性 大肠杆菌所致。 仔猪黄痢在我国流行面广，终年发生，即使 幸免于死的仔猪亦出现生长缓慢，饲料报酬率降低，造成较 大经济损失。 因此，如何准确诊断仔猪腹泻病例，从而及时 治疗，提高仔猪成活率已成为养猪业生产的一项重要任务。 1 病料采集和处理
收 稿 日 期 ：2010-04-08 作 者 简 介 ：王 志 明 （1980—），男 ，助 理 兽 医 师 ，主 要 研 究 方 向 为
动物疫病防治。
细菌有无自凝。 也可将待检菌的 18 h 固体培养物用生理盐 水洗 下 制 成 菌 悬 液 ，分 成 2 份，1 份 经 121 ℃处 理 2 h，为 热 处理菌液，目的是破坏 K 抗原。 另 1 份经福尔马林 (最终含 量 0.5％) 37 ℃处理 24 h，为非热处理菌液，目的是保留 O 抗 原。然后分别用上述方法做凝集试验检查。带有 K88 抗原的 菌株是仔猪黄白痢的重要病原， 有 K88 抗血清可对分离菌 株直接检测有无 K88 抗原， 如无此血清， 可利用大肠杆菌 K88 能 低 温 凝 集 豚 鼠 红 细 胞 并 不 能 被 甘 露 醇 所 阻 止 的 特 性，进行间接推断检查。 4.1 材料准备 4.1.1 菌液的制备： 将待检大肠杆菌接种于肉汤中培养 18 h，移植于牛心汤琼脂斜面上，37 ℃培养 18 h，用灭菌生理盐 水洗下，配成 6 亿 ／ mL 的菌液，相当于麦氏比浊管第 2 管的 浓度，此为生理盐水菌液。 同样，用含 0.5％甘露醇的生理盐 水洗下并制备同样浓度的菌液 1 份。 4.1.2 3％豚 鼠 红 细 胞 的 制 备 ： 从 豚 鼠 心 脏 无 菌 采 血 1～2 mL，置于含 5％柠檬酸钠的生理盐水中 ，混匀，用生理盐水 ， 以 5 000 r ／ min 20 min 离心洗涤 3 次， 取最后 1 次离心浓缩 的红 细 胞 沉 淀 物 0.3 mL 加 到 9.7 mL 无 菌 生 理 盐 水 中 混 匀 即成。 4.2 操作方法 将等量的菌液与豚鼠红细胞液混合，如在 试管中进行各取 0.50 mL，如用微量凝集板 ，各取 0.025 mL。 充分混匀，于 0～3 ℃条件下作用 1 h 后，观察结果。 同时设等 量生理盐水与红细胞液的对照，此对照应不发生凝集。 4.3 结果判定 如无甘露醇的菌液与红细胞凝集 ，而有甘 露醇的菌液与红细胞不凝集，该菌株为甘露醇敏感菌株，无 K88 抗原； 如有甘露醇和无甘露醇的菌液都与豚鼠红细胞 发生凝集 ，则这样菌株为甘露醇抵抗菌 株 ，带 有 K88 抗 原 。 而且这种凝集发生在低温 0～3 ℃，低温下凝集的红细胞 ，于 37 ℃放置 30 min，凝集现象就消失 ，再置于 0 ℃条件下 1 h， 凝集现象又出现。 5 肠毒素检查
旋体的低代次培养 物 ，经 口感 染 小 鼠 、豚 鼠 和 断 奶 猪 ，均 可 3.7.4 间接荧光抗体法： 先将已知血清型的猪痢疾蛇形螺
在 1～2 周内发病。 引起不同程度的肠炎， 排出带血样的粪 旋体制成抗原片，再将经 56 ℃ 30 min 灭活的被检血清用 pH
便，此时检查粪便 ，可查 出 大 量 的 猪 痢 疾 蛇 形螺 旋 体 ，证 明 值 7.4 的 PBS 液做 2～256 倍的系列稀释，分别滴加于抗原片
37 ℃培养 18 h 后，加入 1％硫柳汞 0.15 mL，于 4 ℃冰箱中过 死，取出肠道及其内容物 ，并称出其重量 (X) 和剩余残体重
夜，以 3 500 r ／ min 离心 20 min，取上清液做 LT 检 测用 。 检 (Y )， 计 算 X 与 Y 的 比 值 。 如 果 X∶Y≥0.085 者 为 阳 性 ，X∶
致病性大肠杆菌可产生 2 种肠毒素，其主要差异在对热 的抵抗力上，耐热毒素 (ST) 能抵抗 100 ℃15 min，而热敏毒素 (LT) 在 60 ℃条件下 15 min 失活。 常用的检查 LT 或 ST 的方 法为回肠结扎试验以及乳鼠胃内接种试验， 还有用 Y-1 肾 上腺细胞或中国仓鼠卵细胞的组织培养法来检查 ST。 5.1 LT 的检测 ①LT 的制备。 将被检大肠杆菌接种于 1 mL 酪蛋白酵母浸膏培养基 ，37 ℃培养 18 h 后，将此培养物
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采取发病仔猪或其新鲜尸体小肠前部内容物， 为了避 免杂菌污染，最好无菌采取肠系膜淋巴结、肝、脾、肾等实质 器官作为病原分离的材料。 送检时，可将病料放在灭菌的试 管中，用冰瓶尽快送到实验室。 2 细菌学检查
将采集的病料，划线接种于麦康凯琼脂平板、普通琼脂 平板、血液琼脂平板上，于 37 ℃培养 24 h。 通常普通营养琼 脂上形成直径约 2 mm 的圆形、光滑、隆起、湿润 、半 透 明 淡 灰色的菌落；在麦康凯琼脂上菌落为红色，部分致病性菌株 在血液琼脂平板上呈 β 溶血。 挑取可疑菌落进行涂片染色 镜检， 如为革兰氏染色阴性中等大小的杆菌， 将进行纯培 养 ，接 种 生 化 管 做 生 化 鉴 定 。 如 果 乳 糖 、葡 萄 糖 产 酸 产 气 ，β半乳糖苷酶试验阳性，产生吲哚，MR 阳性，VP 阴性，不利用 柠 檬 酸 盐 ， 不 产 生 H2S， 不 分 解 尿 素 ， 具 有 运 动 性 ， 在 含 有 KCN 的培养基上不生长，就可鉴定为埃希氏大肠杆菌。 3 动物试验
形螺旋体，说明接种物是致病性菌株。 用断奶猪做该试验， 3.7.5 免疫琼脂扩散试验： 将含 Tris 缓冲生理盐水配成的
效果更好。
1％琼脂凝胶融化后， 平铺于平皿内， 凝固后打孔。 孔径 6
3.7 血清学诊断
mm，孔间距离 10 mm。 在中央孔加入琼脂扩散用抗原，周围
3.7.1 微量凝集试验：先将被检血清用 1％新生犊牛血清的 孔加入被检血清，置于 37 ℃湿盒内 4～6 h，再置室温 6～18 h，
试验段注入人工培养物 3 mL，而对照肠段注入同量的生理 内 30 min，再用 PBS 液换液 3 次洗涤 15 min。 干后镜检，判
盐水，48 h 后剖检。 试验肠段明显臌气，液体增多，肠黏膜肿 定结果。 间接荧光抗体效价≥1∶8 为阳性；<1∶2 为阴性；1∶4
胀充血，并有黏性渗出物。 涂片镜检可见到大量的猪痢疾蛇 为疑似。
为致病性的菌株。
上 ，同 时 做已 知 阳 性 和 阴 性 血 清 对 照 ，置 37 ℃湿 盒 内 作 用
3.6 肠结扎试验 利用兔和断奶猪做回肠结扎试验。 按一 30 min 使其特异性结合，再用 PBS 液洗 15 min，中途换 PBS
般外科手术的方法将回肠分段结扎 ，每段 5 cm，间隔 2 cm， 液 3 次。 干后滴加标记的兔抗猪荧光抗体 ，放置 37 ℃湿盒
PBS 液做 1∶8 稀释，于 56 ℃ 30 min 水浴灭能。 应用 U 形孔 观察结果。 根据沉淀线的有无，进行判定。