凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量PowerPoint
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凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量24页PPT
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61、奢侈是舒适的，否则就不是奢侈 。——CocoCha nel 62、少而好学，如日出之阳；壮而好学 ，如日 中之光 ；志而 好学， 如炳烛 之光。 ——刘 向 63、三军可夺帅也，匹夫不可夺志也。 ——孔 丘 64、人生就是学校。在那里，与其说好 的教师 是幸福 ，不如 说好的 教师是 不幸。 ——海 贝尔 65、接受挑战，就可以享受胜利的喜悦 。——杰纳勒 尔·乔治·S·巴顿
凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量
21、没有人陪你走一辈子，所以你要 适应孤 独，没 有人会 帮你一 辈子， 所以你 要奋斗 一生。 22、当眼泪流尽的时候，留下的应该 是坚强 。 23、要改变命运，首先改变自己。
24、勇气很有理由被当作人类德性之 首，因 为这种 德性保 证了所 有其余 的德性 。--温 斯顿． 丘吉尔 。 25、梯子的梯阶从来不是用来搁脚的 ，它只 是让人 们的脚 放上一 段时间 ，以便 让别一 只脚能 够再往 上登。
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质 ppt课件
吸水能力，每g干胶吸水量的10倍
数字愈小,交联度越大,被筛分物质的分子量也愈小
例：
Sephadex G-50：
对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量)为: 1500 – 30000
Sephadex G-200：
对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量)为: 5000 – 80000
B. 琼脂糖凝胶
( 商品名: Sepharose , Bio- gel – A ) 对实验条件要求高 ( 温度, pH )
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质
一、 实验目的
1.掌握凝胶过滤层析法的基本原理； 2.掌握凝胶过滤层析法分离蛋白质的过程。
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质
1. 常用生化实验技术
分光光度技术 电泳技术 离心技术 层析技术
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质
是利用混合物中各组分的理化性质差异（吸附 力、溶解度、分子形状和大小、分子极性、分子亲 和力等）建立起来的技术。
注意：
防止床面干涸，可适当补充蒸馏水
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质
① 加样前打开出口，使床面的蒸馏水流出，正好露 出床面时，立即关闭出口（将干未干）
② 用滴管将混合样品(0.6ml，即血红蛋白和溶菌酶 各0.3ml)缓缓沿柱内壁小心加于床表面
③ 打开出口，使样品进入床内，直到床面重新露出, 立即加入1~2倍于样品体积的蒸馏水
名称
操作形式
柱层析法
固定相装于层析柱内，使样品沿着一个方 向前移而达分离的层析法，包括一般柱层 析法、毛细管层析法和微粒填充柱层析法
平面层析法 层析过程在固定相构成的平面层内进行的 层析法，包括纸层析法、薄层层析法和薄 膜层析法
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质
分离效率高 分析速度快 具有极高的灵敏度 应用范围广
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量PPT课件
在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的分子大小和形状 以及所带电荷多少等因素所造成的电泳迁移率有差别。在 聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠 （SDS），形成蛋白质－SDS复合物，这种复合物由于结 合了大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成 了仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或 消除了各种蛋白质分子之间的天然的电荷差异，此时，蛋 白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其 它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。
四、浓缩胶的配制（5%）
试剂
H2O 凝胶贮备液 分离胶缓冲液(pH6.8) 10% SDS
TEMED 10%过硫酸铵
总体积
体积 2.92（ml） 0.8（ml） 1.25（ml） 0.05（ml）
5（ul） 25（ul） 5.05（ml）
五、浓缩胶的灌注和聚合
用移液管将所配制的浓缩胶缓冲液沿 着凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓注入，将 梳子插入胶液顶部，放置室温下待其聚合。
• 必须学会欣然面对的一种结果----被接纳
• 以具体的形式感谢招聘单位的接纳，如邮件、短信 • 考虑怎样使自己的知识能力更适应工作需要 • 把走进工作岗位当作职业生涯的重要的第一步，认
真思考如何为以后的发展开好头。
结束语
当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的， 所以不要放弃，坚持就是正确的。
When You Do Your Best, Failure Is Great, So Don'T Give Up, Stick To The End
相对迁移率mR=蛋溴白酚质蓝样区品带距中分心离距胶分顶离端 胶迁 顶移 端距 距离 离((ccmm))
以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移 率作图，得到标准曲线，根据待测样品相对 迁移率，从标准曲线上计算出其分子量。
实验八凝胶过滤法分离蛋白质ppt课件
用蒸馏水过柱几遍，以稳定床体积(不能让凝胶表面露出水
面 )。
装柱时，凝胶柱内若有气泡或分离断层，可用玻棒搅动消除
或重新装柱，装柱结束后凝胶表面应平整。
实验操作
3、加样：
取4mg/ml 蓝色葡聚糖溶液、6mg/ml细胞色素C溶液、 2mg/ml重铬酸钾溶液各6滴混合--------上柱样品。
当分子量未知时，选择Sephadex
G-25
洗脱时，大分子受阻小最先流出，小分子受阻大 而最后流出，结果使大小不同的物质分离。用葡 萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的 时间就比较短。
用于分离及测定样品分子量：标准分子量样品， logMW对洗脱体积作图
三、器材与试剂
1×20cm层析柱、自动部分收集器，蠕动泵 葡聚糖凝胶Sephadex-50 蒸馏水 三角铁架 4mg/ml 蓝色葡聚糖溶液(200万） 6mg/ml细胞色素C溶液 （几万） 样品混合液 2mg/ml重铬酸钾溶液（几百）
四、实验操作
1、凝胶溶胀
取Sephadex G-50 15g，加500ml蒸馏水室温溶胀 一天（或沸水浴中溶胀1h）。 待溶胀平衡后，倾去上层清液，包括细颗粒，然后再 放些蒸馏水搅乱，静置使凝胶下沉，再倾去上层清液， 至无细颗粒为止。 不能剧烈搅拌，严禁用磁力搅拌器，否则易破碎，使 流速下降和分离效果降低。
根据实验中遇到的各种问题，总结做好本实验的经验 与教训，完成实验报告。 比较几种蛋白质分离方法的特点。
实验八__凝胶 过滤法分离蛋 白质
二．原理
分子筛层析molecular-sieve chromatography
凝胶过滤层析gel-filtration chromatography 分子排阻层析molecular exclusion chromatography
《凝胶层析法》课件
改进方向
提高分离速度
通过改进凝胶介质或优化操作条件，提高凝 胶层析法的分离速度。
减少小分子物质的损失
研究新型的凝胶介质和操作条件，减少小分 子物质的损失。
增强对大分子的分离效果
开发新型凝胶介质，提高对大分子物质的分 辨率。
提高温度稳定性
通过改进凝胶介质或优化操作条件，提高凝 胶层析法对温度变化的稳定性。
装柱
将凝胶颗粒装入层析柱中，确 保填充均匀。
上样
将待分离样品加入层析柱的顶 部，确保样品与凝胶颗粒充分 接触。
检测
对洗脱液进行检测，观察分离 效果。
结果分析
对收集到的洗脱液进行定性和定量分 析，确定各组分的含量和纯度。
比较实验结果与预期结果，分析实验 误差和影响因素，总结实验结论。
03
CATALOGUE
告撰写非常重要。
采用适当的统计方法处理数据
对于实验数据，应采用适当的统计方法进行处理和分析， 以得出可靠的结论。
备份实验数据
为了防止数据丢失，应将实验数据备份并保存在安全的地 方。
04
CATALOGUE
凝胶层析法实验案例
实验一：分离蛋白质
总结词
通过凝胶层析法分离蛋白质，可以获得高纯度的蛋白质样品，为后续的生化分析提供高 质量的原料。
原理
基于分子大小和形状差异，利用凝胶孔径对不同大小分子进行选择性分离，大 分子不能进入凝胶孔洞，而小分子可以进入凝胶孔洞，从而实现大小分子的分 离。
发展历程
起源
现状
凝胶层析法起源于20世纪40年代，最 初用于蛋白质的分离。
目前，凝胶层析法已成为一种广泛应 用于分离纯化技术领域的进和分离技术 的提高，凝胶层析法逐渐应用于更多 领域，如生物技术、制药、环境科学 等。
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质PPT讲稿
• 制备：
• 将干胶颗粒悬浮于5 ~ 10倍的蒸馏水或洗脱液
中
• 充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去
3. 凝胶装柱
• ①柱固定于架子上，垂直放置，关住出口 • ②自顶部缓缓加入葡聚糖悬液，使G-50 开始下沉， • 至1 ~2cm时，打开出口 • ③凝胶逐层上升，至顶部 2-3cm时，关闭出口
名称
操作形式
柱层析法
固定相装于层析柱内，使样品沿着一个方 向前移而达分离的层析法，包括一般柱层 析法、毛细管层析法和微粒填充柱层析法
平面层析法 层析过程在固定相构成的平面层内进行的 层析法，包括纸层析法、薄层层析法和薄 膜层析法
（3）层析技术的优点
分离效率高 分析速度快 具有极高的灵敏度 应用范围广
注意点：
垂直放置 防止气泡产生 防止柱的分层
4. 平衡
• 放置一段时间，约40分钟（使凝胶更好的压实）
注意：
防止床面干涸，可适当补充蒸馏水
5. 加样
• ① 加样前打开出口，使床面的蒸馏水流出，正好
露
• 出床面时，立即关闭出口（将干未干） • ② 用滴管将混合样品(0.6ml，即血红蛋白和溶菌酶 • 各0.3ml)缓缓沿柱内壁小心加于床表面 • ③ 打开出口，使样品进入床内，直到床面重新露
出,
• 立即加入1~2倍于样品体积的蒸馏水
6. 洗脱
① 当此少量蒸馏水接近流干时，反复多次加入蒸
•
馏水，进行洗脱，直到两带分开
② 检查Hb在层析床中色带位置，待Hb洗脱完后，
•
用试管分步收集洗脱液
• ③ 10d/管，每管加NaOH 2d，CuSO4 2d • ④ 检查溶菌酶洗脱情况，若为紫色，则为（+）
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质PPT课件
＜40℃ 4.5- 9.0 工作的下限是葡聚糖凝胶工作的上限, 用于大分子物质的分离
19
C. 聚丙烯酰胺凝胶
商品名: Bio – gel – P（生物胶P）
20
三、实验操作
1. 柱的选择 直径： 1~5 cm 一般长度：直径 = 10：1 ~ 20：1 本实验玻柱： 直径0.8~ 1.5cm 长度 17~ 20cm
7
（1）层析系统的基本组成
固定相 + 流动相
固体物质 / 固定于固体物质的成分
可以流动的物质： 如水和各种固定相
由于理化性质差异，与两相发生相互作用（吸附、 溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含 量对比）不同
与固定相相互作用力越弱的组分，随流动相移动时 受到的阻滞作用小，移动速度快
27
6. 洗脱
① 当此少量蒸馏水接近流干时，反复多次加入蒸 馏水，进行洗脱，直到两带分开
② 检查Hb在层析床中色带位置，待Hb洗脱完后， 用试管分步收集洗脱液
③ 10d/管，每管加NaOH 2d，CuSO4 2d ④ 检查溶菌酶洗脱情况，若为紫色，则为（+）
28
缩二脲反应 （双缩脲反应）
O
O
H2N - C - NH - C - NH2
生物化学与分子生物学实验
带教: 张学礼、戴薇薇 龚张斌、黎志萍
1
实验课要求
试剂用后及时归位 及时记录实验结果 按时完成实验报告 离开时做好清洁工作
2
实验报告的书写
标题日期 一、实验目的 二、实验原理 三、操作步骤 四、实验结果 五、分析讨论
3
实验基本操作
一、玻璃仪器的洗涤 二、吸量管及微量取样器的使用 三、溶液的混匀 四、离心机的使用
19
C. 聚丙烯酰胺凝胶
商品名: Bio – gel – P（生物胶P）
20
三、实验操作
1. 柱的选择 直径： 1~5 cm 一般长度：直径 = 10：1 ~ 20：1 本实验玻柱： 直径0.8~ 1.5cm 长度 17~ 20cm
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（1）层析系统的基本组成
固定相 + 流动相
固体物质 / 固定于固体物质的成分
可以流动的物质： 如水和各种固定相
由于理化性质差异，与两相发生相互作用（吸附、 溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含 量对比）不同
与固定相相互作用力越弱的组分，随流动相移动时 受到的阻滞作用小，移动速度快
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6. 洗脱
① 当此少量蒸馏水接近流干时，反复多次加入蒸 馏水，进行洗脱，直到两带分开
② 检查Hb在层析床中色带位置，待Hb洗脱完后， 用试管分步收集洗脱液
③ 10d/管，每管加NaOH 2d，CuSO4 2d ④ 检查溶菌酶洗脱情况，若为紫色，则为（+）
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缩二脲反应 （双缩脲反应）
O
O
H2N - C - NH - C - NH2
生物化学与分子生物学实验
带教: 张学礼、戴薇薇 龚张斌、黎志萍
1
实验课要求
试剂用后及时归位 及时记录实验结果 按时完成实验报告 离开时做好清洁工作
2
实验报告的书写
标题日期 一、实验目的 二、实验原理 三、操作步骤 四、实验结果 五、分析讨论
3
实验基本操作
一、玻璃仪器的洗涤 二、吸量管及微量取样器的使用 三、溶液的混匀 四、离心机的使用
SDSPAGE测定蛋白质的相对分子质量pptPowe
SDS-PAGE测定蛋白质 的相对分子质量ppt-
Powe
2020/11/6
SDSPAGE测定蛋白质的相对分子质 量pptPowe
实验目的
n 了解SDS-PAGE垂直板型电泳法的基本原 理及操作技术。
n 学习并掌握SDS－PAGE法测定蛋白质相对 分子量的技术。
SDSPAGE测定蛋白质的相对分子质 量pptPowe
n 2．配胶：根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜 的分离胶浓度。本实验采用SDS-PAGE不连续系统， 按下表的配制分离胶和浓缩胶。
SDSPAGE测定蛋白质的相对分子质 量pptPowe
试剂名称
分离胶贮液 （30%Acr-0.8%Bis) 分离胶缓冲液 （pH8.9Tris-HCl） 浓缩胶贮液 （10%Acr-0.5%Bis） 浓缩胶缓冲液 （pH6.7 Tris-HCl） 10% SDS
SDSPAGE测定蛋白质的相对分子质 量pptPowe
SDSPAGE测定蛋白质的相对分子质 量pptPowe
仪器、原料和试剂
n 仪器：垂直板型电泳槽；直流稳压电源；50或100μl微量 注射器、玻璃板、水浴锅，染色槽；烧杯；吸量管；常 头滴管等。
n 原料：低分子量标准蛋白质按照每种蛋白0.5~1mg·ml-1 样品溶解液配制。可配制成单一蛋白质标准液，也可配 成混合蛋白质标准液。
SDSPAGE测定蛋白质的相对分子质 量pptPowe
演讲完毕，谢谢听讲!
再见，see you again
2020/11/6
SDSPAGE测定蛋白质的10.20
8.54
2.00
2.00
5.20
4.60
混匀后，置真空干燥器中，抽气10min
0.10 0.10
Powe
2020/11/6
SDSPAGE测定蛋白质的相对分子质 量pptPowe
实验目的
n 了解SDS-PAGE垂直板型电泳法的基本原 理及操作技术。
n 学习并掌握SDS－PAGE法测定蛋白质相对 分子量的技术。
SDSPAGE测定蛋白质的相对分子质 量pptPowe
n 2．配胶：根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜 的分离胶浓度。本实验采用SDS-PAGE不连续系统， 按下表的配制分离胶和浓缩胶。
SDSPAGE测定蛋白质的相对分子质 量pptPowe
试剂名称
分离胶贮液 （30%Acr-0.8%Bis) 分离胶缓冲液 （pH8.9Tris-HCl） 浓缩胶贮液 （10%Acr-0.5%Bis） 浓缩胶缓冲液 （pH6.7 Tris-HCl） 10% SDS
SDSPAGE测定蛋白质的相对分子质 量pptPowe
SDSPAGE测定蛋白质的相对分子质 量pptPowe
仪器、原料和试剂
n 仪器：垂直板型电泳槽；直流稳压电源；50或100μl微量 注射器、玻璃板、水浴锅，染色槽；烧杯；吸量管；常 头滴管等。
n 原料：低分子量标准蛋白质按照每种蛋白0.5~1mg·ml-1 样品溶解液配制。可配制成单一蛋白质标准液，也可配 成混合蛋白质标准液。
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SDSPAGE测定蛋白质的10.20
8.54
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混匀后，置真空干燥器中，抽气10min
0.10 0.10
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凝胶层析法测定蛋白质 相对分子质量-
PowerPoint
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2020/11/14
凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量 PowerPoint
实验目的
n 掌握凝胶层析的基本原理。 n 学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质
量的实验技能。
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凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量 PowerPoint
如果假定蛋白质分子近于球形，同时没有显著的水合 作用，则不同大小分子量的蛋白质，在洗脱时峰的位置和 该物质相对分子质量有直接的定量的关系。在一根凝胶柱 中，凝胶颗粒间空隙所含水相体积为外水体积VＯ，不能 进入凝胶孔径的那些大分子，当洗脱体积为时VＯ，出现 洗脱峰。
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凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量 PowerPoint
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仪器和试剂
n 仪器：层析柱、恒流泵、紫外检测仪、自动部分 收集器
n 试剂
n 待测样品：胰岛素、牛血清白蛋白 n 蓝色葡聚糖2000；Sephardex G-75；洗脱剂
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凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量 PowerPoint
实验步骤
n 1．凝胶溶胀
凝胶颗粒要求大小比较均匀 ，可流速稳定， 结果较好。
取葡聚糖Sephardex G-75干粉，加过量的蒸馏 水室温充分溶胀一天（溶胀时间因凝胶交联度不 同而不同），或沸水浴中溶胀3小时，这样可大大 缩短溶胀时间，而且可以杀死细菌和霉菌，并可 排出凝胶内气泡。溶胀过程中注意不要过分搅拌， 以防颗粒破碎。待溶胀平衡后用倾泻法除去不易 沉下的细小颗粒，最后凝胶经减压抽气除去气泡， 即可准备装柱。
凝胶颗粒内部孔穴的总体积为内水体积Vi，能全部渗 入凝胶的那些小分子，当洗脱体积为VＯ+Vi时，出现洗脱 峰。
利用Andrews的实验经验式：
lgMr = a/b—Ve/bVo 式中，Ve为洗脱体积。它是自加样品开始到该组分的 洗脱峰（峰顶）出现时所流出的体积。Vo为外水体积， Mr为相对分子质量，a和b为常数。 葡聚糖凝胶有不同的型号，用于分离不同相对分子质 量大小的物质。例如Sephardex G-75的分级范围是300080000的球形分子。在本实验中用于分离胰岛素（Mr为 6000）和牛血清蛋白（Mr75000）。
将洗脱剂与恒流泵相连，恒流泵出口端与层析 柱相连。通过2—3倍柱床容积的洗脱液使柱床 平衡，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤 布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保 持凝胶上端有一段液体。
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n 3. 上样与洗脱
样品上柱是实验成败的关键之一，若样品稀释 或上柱不均，会使区带扩散，影响层析效果。 上样时应尽量保持床面的稳定。先打开柱的出 口，待柱中洗脱液流至距床表面1～2mm时，关 闭出口，用滴管将1ml样品慢慢地加至柱床表面， 应避免将床面凝胶冲起，打开出口并开始计算 流出体积，当样品滲入床中接近床表面1mm时 关闭出口。按加样操作，用少量（约1ml）洗脱 液冲洗管壁2次。最后加入少量洗脱液于凝胶上， 使高出床表面3～5cm，旋紧上口螺丝帽，柱进 水口连通恒流泵，调好流速，以每管3ml/10min 流速开始洗脱。上样的体积，分析用量为柱床 容积的1—2%；制备用量为柱床容积的 20%~30%。
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计算
分子量的测定和计算，一般都采用标准曲线 法。只要测得几种标准蛋白质相对分子质 量的Ve，并以它们的相对分子质量的对数 (logMr)对Ve作图得一直线，再测出待测样 品的Ve，即可从图中确定它的相对分子质 量。
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n 始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发， 凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量 气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变 坏，不得不重新装柱。
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2020/11/14
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n 2. 装柱与平衡
装柱前须将凝胶上面过多的溶液倾出，将层析 柱垂直装好。关闭出口，向柱管内加入约1/3柱 容积的洗脱液，然后在搅拌下，将浓浆状的凝 胶连续地倾入柱中，使之自然沉降，待凝胶沉 降约2—3cm后，打开柱的出口，调节合适的流 速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离 柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口。装 柱要求连续、均匀、无气泡、无“纹路”。
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n 4. 收集与鉴定
用自动部分收集器收集流出液，每管4ml， 紫外检测仪280nm波长处检测，最高的一 个OD值时的体积即为吸收峰的洗脱体积 Ve。
n 5．凝胶柱的处理
凝胶用过后，反复用蒸馏水洗后保存，如 果有颜色或比较脏，可用0.5mol/LNaCl洗 涤。短期可保存在水相中，加入防腐剂或 加热灭菌后于低温保存。建议长期用干燥 状态保存。
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凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量 PowerPoint
注意损， 否则造成漏气、漏液。注意恒压瓶内的排气管应 无液体，并随着柱下口溶液的流出不断有气泡产 生，则表示恒压瓶不漏气。操作过程中，层析柱 内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处， 应仔细检查并加以纠正。
实验原理
n 凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具 有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层 析技术。当混合物随流动相经过凝胶层析 柱时，其中各组分按其分子大小不同而被 分离的技术。该法设备简单、操作方便、 重复性好、样品回收率高。
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n 凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、 呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的 直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网 孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。当含有分子大 小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装 填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动 而发生移动。大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液 移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而 小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再 扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层 析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。 若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物 质，则居二者之间从柱中流出。总之，各种不同相 对分子质量的蛋白质分子，最终由于它们被排阻和 扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间 也不同，从而彼此可以分离开来。
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2020/11/14
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实验目的
n 掌握凝胶层析的基本原理。 n 学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质
量的实验技能。
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如果假定蛋白质分子近于球形，同时没有显著的水合 作用，则不同大小分子量的蛋白质，在洗脱时峰的位置和 该物质相对分子质量有直接的定量的关系。在一根凝胶柱 中，凝胶颗粒间空隙所含水相体积为外水体积VＯ，不能 进入凝胶孔径的那些大分子，当洗脱体积为时VＯ，出现 洗脱峰。
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仪器和试剂
n 仪器：层析柱、恒流泵、紫外检测仪、自动部分 收集器
n 试剂
n 待测样品：胰岛素、牛血清白蛋白 n 蓝色葡聚糖2000；Sephardex G-75；洗脱剂
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实验步骤
n 1．凝胶溶胀
凝胶颗粒要求大小比较均匀 ，可流速稳定， 结果较好。
取葡聚糖Sephardex G-75干粉，加过量的蒸馏 水室温充分溶胀一天（溶胀时间因凝胶交联度不 同而不同），或沸水浴中溶胀3小时，这样可大大 缩短溶胀时间，而且可以杀死细菌和霉菌，并可 排出凝胶内气泡。溶胀过程中注意不要过分搅拌， 以防颗粒破碎。待溶胀平衡后用倾泻法除去不易 沉下的细小颗粒，最后凝胶经减压抽气除去气泡， 即可准备装柱。
凝胶颗粒内部孔穴的总体积为内水体积Vi，能全部渗 入凝胶的那些小分子，当洗脱体积为VＯ+Vi时，出现洗脱 峰。
利用Andrews的实验经验式：
lgMr = a/b—Ve/bVo 式中，Ve为洗脱体积。它是自加样品开始到该组分的 洗脱峰（峰顶）出现时所流出的体积。Vo为外水体积， Mr为相对分子质量，a和b为常数。 葡聚糖凝胶有不同的型号，用于分离不同相对分子质 量大小的物质。例如Sephardex G-75的分级范围是300080000的球形分子。在本实验中用于分离胰岛素（Mr为 6000）和牛血清蛋白（Mr75000）。
将洗脱剂与恒流泵相连，恒流泵出口端与层析 柱相连。通过2—3倍柱床容积的洗脱液使柱床 平衡，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤 布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保 持凝胶上端有一段液体。
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n 3. 上样与洗脱
样品上柱是实验成败的关键之一，若样品稀释 或上柱不均，会使区带扩散，影响层析效果。 上样时应尽量保持床面的稳定。先打开柱的出 口，待柱中洗脱液流至距床表面1～2mm时，关 闭出口，用滴管将1ml样品慢慢地加至柱床表面， 应避免将床面凝胶冲起，打开出口并开始计算 流出体积，当样品滲入床中接近床表面1mm时 关闭出口。按加样操作，用少量（约1ml）洗脱 液冲洗管壁2次。最后加入少量洗脱液于凝胶上， 使高出床表面3～5cm，旋紧上口螺丝帽，柱进 水口连通恒流泵，调好流速，以每管3ml/10min 流速开始洗脱。上样的体积，分析用量为柱床 容积的1—2%；制备用量为柱床容积的 20%~30%。
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计算
分子量的测定和计算，一般都采用标准曲线 法。只要测得几种标准蛋白质相对分子质 量的Ve，并以它们的相对分子质量的对数 (logMr)对Ve作图得一直线，再测出待测样 品的Ve，即可从图中确定它的相对分子质 量。
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n 始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发， 凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量 气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变 坏，不得不重新装柱。
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演讲完毕，谢谢听讲!
再见，see you again
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2020/11/14
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n 2. 装柱与平衡
装柱前须将凝胶上面过多的溶液倾出，将层析 柱垂直装好。关闭出口，向柱管内加入约1/3柱 容积的洗脱液，然后在搅拌下，将浓浆状的凝 胶连续地倾入柱中，使之自然沉降，待凝胶沉 降约2—3cm后，打开柱的出口，调节合适的流 速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离 柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口。装 柱要求连续、均匀、无气泡、无“纹路”。
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n 4. 收集与鉴定
用自动部分收集器收集流出液，每管4ml， 紫外检测仪280nm波长处检测，最高的一 个OD值时的体积即为吸收峰的洗脱体积 Ve。
n 5．凝胶柱的处理
凝胶用过后，反复用蒸馏水洗后保存，如 果有颜色或比较脏，可用0.5mol/LNaCl洗 涤。短期可保存在水相中，加入防腐剂或 加热灭菌后于低温保存。建议长期用干燥 状态保存。
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注意损， 否则造成漏气、漏液。注意恒压瓶内的排气管应 无液体，并随着柱下口溶液的流出不断有气泡产 生，则表示恒压瓶不漏气。操作过程中，层析柱 内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处， 应仔细检查并加以纠正。
实验原理
n 凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具 有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层 析技术。当混合物随流动相经过凝胶层析 柱时，其中各组分按其分子大小不同而被 分离的技术。该法设备简单、操作方便、 重复性好、样品回收率高。
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n 凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、 呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的 直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网 孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。当含有分子大 小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装 填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动 而发生移动。大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液 移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而 小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再 扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层 析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。 若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物 质，则居二者之间从柱中流出。总之，各种不同相 对分子质量的蛋白质分子，最终由于它们被排阻和 扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间 也不同，从而彼此可以分离开来。