1,2改良CTAB法提取番石榴叶片总DNA
CTAB法提取植物总DNA改良版
CTAB法提取植物基因组DNA这种方法是由Murray 和Thompson（1980）修改而成的简便方法。
CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。
最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。
一、材料新鲜的组织材料或-80℃冻存的材料二、试剂1、2×CTAB溶液：CTAB (W/V) 2%,Tris-HCl 100 mM（pH8.0）EDTA 20 mM（pH8.0）NaCl 1.4MPVP 1%巯基乙醇 0.2%配制时先不加巯基乙醇，将其它五种加热搅拌混匀灭菌后再加入巯基乙醇。
2、乙醇 70%3、酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）或氯仿-异戊醇（24:1）体积比4、RNaseA 10mg/ml5、乙醇或异丙醇三、方法步骤：1、取适量CTAB于60℃预热30min.2、取0.2g新鲜叶片蒸馏水洗净用吸水纸吸干至于液氮遇冷的灭菌研钵，液氮迅速研磨成粉末;3、取一预冷灭菌1.5ml EP管，将粉末装入后加入0.7ml CTAB，迅速振荡混匀后置60℃水浴30 min ;4、加入0.7 ml 酚-氯仿-异戊醇（25:24:1），颠倒摇匀（10次以下）;5、室温下（>15℃）12000 rpm 离心10 min;6、上清移至新EP管中，加等体积酚-氯仿-异戊醇（25:24:1），颠倒摇匀（10次以下）；7、室温下（>15℃）12000 rpm 离心10 min;8、移上清至一预先加入0.8倍体积异丙醇的新1.5 ml EP管中，平放旋转混匀（动作要轻柔，防止DNA断链），冰浴20 min；9、12000 rpm 4℃离心10 min10、弃上清，用滤纸吸干壁上水，不能碰到沉淀；11、加1ml 70%乙醇洗沉淀12000 rpm 4℃离心3 min,尽弃乙醇，再12000rpm 4℃离心1 min,尽弃残余乙醇，超净台吹干;12、用30~50 ul dd H2O溶解-20℃存贮。
改良CTAB法提取大戟属药用植物叶片总DNA试验
改良CTAB法提取大戟属药用植物叶片总DNA试验摘要:由于大戟属(Euphorbia Linn)植物叶片中含大量的多糖､酚类等次生代谢物质,严重影响总DNA的提取,因此,以大戟属药用植物叶片为材料,对常用的CTAB(Hexadecyltrimethy ammonium bromide)法进行了改良,并通过琼脂凝胶电泳法对所提DNA样品进行了检测｡结果表明,改良CTAB法提取的植物总DNA纯度很高,较适合提取大戟属植物的总DNA｡关键词:大戟属;药用植物;CTAB法;总DNA提取A Modified CTAB Method for Total DNA Extraction from the Medicinal Herb Leaves of Euphorbia LinnAbstract: The cells in Euphorbia Linn leaves were rich in amylose and hydroxybenzene. These substances provided some seriously adverse effects on extraction of DNA from Euphorbia. Using the leaves of Euphorbia as material, the DNA were extracted by a modified CTAB(Hexadecyltrimethy ammonium bromide) method and detected by means of agarose gel electrophoresis. The results showed that the modified CTAB method was suitable for extraction of its’ DNA and it was a goodmethod for total DNA extraction from Euphorbia.Key words: Euphorbia Linn; medicinal herb; hexadecyltrimethy ammonium bromide(CTAB) method; total DNA extractionDNA的提取与纯化是进行分子标记试验最关键的一步,获得高质量的DNA样品是进行PCR扩增的首要步骤[1]｡从植物材料中提取基因组DNA的质量受到多种因素的影响,在不同植物或同种植物不同时期组织中存在着不同数量的多糖､色素以及种类繁多的次生物质,特别是多糖､酚类在提取过程中可与DNA产生沉淀,形成包裹DNA的黏稠胶状物,其难以溶解或产生褐变,使得DNA提取质量较低,获得的DNA溶液常常黏度大乃至呈胶状,这些物质如果清除不净则会影响后续的试验研究[2-4]｡大戟属(Euphorbia Linn)为大戟科(Euphorbiaceaec)植物中最大的一属,全世界有2 000余种[5],其中不少种具有很高的药用价值,李忠国[6]调查发现,安徽省琅琊山药用植物资源中有22种大戟科药用植物;李惠等[7]通过研究华东地区大戟属药用植物资源后,整理出了26种大戟属药用植物,并且药用部位明确,疗效确切,具有较高的药用价值｡大戟属药用植物的医药价值使得其研究开发成为了热点,尤其是对大戟属药用植物在分子水平上的探讨方兴未艾｡目前在大戟属药用植物进行分子标记试验中,由于本属植物具有白色或黄白色乳汁,含酚类､黄酮类等次生物质较多,若提取方法不当,不仅提取出来的DNA容易降解,而且会影响PCR扩增反应的稳定性和重复性｡因此,如何高效简便地去除多糖､多酚等次生物质,对提取纯化大戟属植物DNA至关重要｡目前,大戟属药用植物总DNA提取方法的研究在国内外尚未见报道,所以在前期研究的基础上[8,9],结合本属植物特点,以经典提取植物DNA的CTAB(十六烷基三乙基溴化铵,Hexadecyltrimethy ammonium bromide)法为基础[10],并加以改进,筛选出一种比较适合大戟属植物DNA提取的方法,为大戟属药用植物进一步开发利用提供技术支持｡1材料与方法1.1材料1.1.1供试材料试验所用植物材料为采自安徽省琅琊山的大戟(E. pekinensis Rupr.)､月腺大戟(E. ebracteolata Hayata);采自芜湖市的乳浆大戟(E. esula L.)､斑地锦(E. supina Rafin)､地锦(E. humifusa Willd.)､一品红(E. pulcherrima Willd. et Klotzsch.),原植物均经安徽师范大学周守标教授鉴定｡用于提取DNA的材料为各供试植物的新鲜叶片,采后迅速置于冰盒中,带回实验室后,除去主叶脉,在电子天平上精确称取0.5 g,于-20 ℃冰箱保存3 d｡1.1.2主要试剂①DNA抽提缓冲液,NaCl 500 mmol/L,Tris-HCl 100 mmol/L､pH 值8.0和EDTA 20 mmol/L､pH值8.0｡②DNA裂解缓冲液,NaCl 700 mmol/L, Tris-HCl 50 mmol/L､pH值8.0和EDTA 20 mmol/L､pH值8.0,CTAB 5%(m/V),β-巯基乙醇1%(用前加)[11]｡③TE 缓冲液,Tris-HCl 10 mmol/L､pH值8.0和EDTA 1 mmol/L､pH值8.0｡④50×TAE缓冲液,Tris 242 g,冰乙酸57.1 mL,EDTA(0.5 mol/L､pH值8.0)100 mL｡⑤氯仿-异戊醇混合液(体积比为24∶1,下同)｡配制药品用的水均为双蒸馏水｡将以上缓冲液分装后,密封､灭菌,置于冰箱4℃保存｡1.1.3主要仪器试验中的主要仪器有凝胶成像仪､微波炉､离心机､超低温冰箱､电泳槽､电泳仪､手掌型离心机､恒温水浴锅､电热恒温鼓风干燥箱､超净工作台等｡1.2方法1.2.1改良CTAB法提取植物总DNA①提取前将裂解缓冲液放至65 ℃水浴中｡②称取0.5 g植物材料,用液氮速冻后,迅速研磨成细粉,分装于1.5 mL的Eppendorf 管中｡③在Eppendorf管中加入1 mL DNA提取缓冲液,用力摇动使其充分混匀后,于15 ℃､8 000 g离心5 min｡④静止后弃上清,再加入1 mL DNA提取缓冲液,充分混匀,于15 ℃､8 000 g离心5 min｡⑤静止后弃上清,加入1 mL 65 ℃预热的DNA提取缓冲液,悬浮沉淀,充分混匀,放入65 ℃水浴30 min｡⑥于15 ℃､12 000 g离心5 min,取上清,加入等体积的氯仿-异戊醇混合液,轻轻颠倒混匀,静置10 min｡⑦于15 ℃､12 000 g 离心5 min,取上清,加入等体积的异丙醇,充分混匀,4 ℃静置30 min ｡⑧于15 ℃､12 000 g离心10 min,静止后弃上清,加入75 %(V/V)乙醇洗数次｡⑨于15 ℃､12 000 g离心3 min,静止后弃上清,自然风干直至无酒精味｡⑩加入100 μL TE缓冲液,放入4 ℃环境待用,或-20 ℃储存｡1.2.2电泳检测对所提取的DNA取3~5 μL于0.8%的琼脂糖凝胶上,以5 V/cm电泳1 h左右,EB染色20~25 min,在凝胶成像系统(AlphaImager)中观察和拍照｡2结果与分析2.1DNA电泳结果将叶片各部位提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳,检测结果见图1｡DNA电泳结果显示,改良CTAB法所提取的大戟属植物叶片的DNA为一条清晰完整的条带,DNA片段大小较一致,条带后面没有明显的拖尾,证明所提叶片的总DNA含杂质较少｡2.2总DNA纯化加入等体积的氯仿-异戊醇混合液,轻缓颠倒混匀,室温静置10~15 min;于12 000 g离心10 min;重复前面步骤｡取上清液,加入终浓度0. 2~0. 4 mol/L的NaAc､12倍体积的无水乙醇,放置1 h｡12 000 g离心10 min,弃上清液｡用70 %乙醇洗涤沉淀2~3次,自然干燥后,溶于50~100 μL TE中,-20 ℃保存备用｡3讨论虽然植物DNA的提取是一项常规的分子生物学实验技术,但由于大戟属植物组织细胞中含有大量的酚类､多糖及其他次生代谢产物,使得用传统的CTAB方法难以分离出高质量的DNA,如果提取方法选择不当,会干扰后续的操作｡作者对大戟属植物叶片总DNA的提取过程经过反复的改进,最后提取出了质量较高的总DNA,并在提取中总结出以下操作事项,以期为大戟属药用植物的分子生物学研究提供技术支撑｡1)首先,用于DNA提取的植物材料是从远离实验室的野外采集获得,新鲜材料在旅途中容易枯萎､腐烂,特别是一些离体材料极易受到DNA酶的作用,导致DNA的降解｡因此采集后必须迅速置于冰盒中,带回实验室｡2)植物材料在研磨时,一定要使材料处于低温状态,而且所用研钵应该是预先在-20 ℃冰箱冷冻过夜､待其彻底冷却后再放入植物材料｡在研磨过程中,确保不要让液氮挥发干净,以防止植物材料回温,否则会造成DNA的严重降解;研磨叶片时,粉末研得越细越好,研磨好的材料非常容易变褐,宜迅速转入Eppendorf管中,不要使之融化,以免造成DNA的降解｡3)在提取DNA的过程中,所有的操作均需要动作轻柔,避免剧烈振动,以免DNA 断裂降解｡4)在用氯仿-异戊醇混合液抽提时,离心温度应保持不低于15 ℃;若温度太低,可能导致CTAB沉淀,从而损失DNA;在离心前增加氯仿-异戊醇混合液和提取缓冲液的接触时间,让杂质更好地被分离,减少用氯仿-异戊醇混合液的抽提次数,避免操作过程中DNA的污染｡5)CTAB是一种阳离子去污剂,既能有效裂解植物的细胞壁,又能去除多糖类物质,还可以溶解细胞膜,较好去除多糖的干扰｡在加入CTAB缓冲液进行温浴时,将时间延长至2 h能更好地处理多糖､酚类及其他杂质,所获得的DNA质量也将较高｡6)在提取过程中,采用常规CTAB法常出现多酚类物质的褐化现象,使DNA溶液颜色产生浑浊｡β-巯基乙醇具有抗氧化作用,在改良CTAB法中,提取液中加入1% β-巯基乙醇可以有效地去除植物组织内的多糖物质和多酚类物质,防止酚类物质造成褐化现象｡7)PCR技术对DNA样品量和纯度的要求均不高,但因PCR具有很高的灵敏度,为防止试剂交叉污染,应尽量减少提取步骤;采用改良的CTAB法提取大戟属植物DNA,能够获得高质量的DNA样品｡8)在DNA提取过程中,用异丙醇沉淀时,若异丙醇未挥发尽,会直接影响Taq DNA聚合酶的活性,试验中应该让异丙醇沉淀离心后充分挥发｡9)在DNA提取过程中,氯仿是蛋白的有效沉淀剂,对Taq DNA聚合酶有变性作用｡10)DNA沉淀出现后,絮状沉淀不一定全是DNA沉淀,判断絮状沉淀的标准是看其是否易溶于TE,若易溶则说明其杂质含量较少,若难溶则说明其杂质含量较高,纯度较差｡而TE溶解是一个比较缓慢的过程,为了充分溶解,通常在4℃条件下溶解1 d｡参考文献:[1] 刘塔斯,林丽美,龚力民,等. 分子标记中植物DNA提取方法的研究进展[J]. 中南药学,2005,3(6):370-373.[2] 黄晓丹,张云贵,应铁进. 高质量植物基因组DNA的提取[J]. 植物生理学通讯,2006,4(2):311-314.[3] 周凤,张东旭,吕洪飞. 4种金丝桃属植物基因组DNA提取及RAPD分析[J]. 山西大同大学学报(自然科学版),2001,26(4):64-67.[4] 桂腾琴,乔爱民,孙敏. 果梅基因组DNA提取方法的比较及ISSR分析[J]. 北方园艺, 2008(4):212-215.[5] 钱啸虎. 安徽植物志(第三卷)[M]. 北京:中国展望出版社,1988.256-257.[6] 李国忠. 安徽琅琊山药用植物资源调查[J]. 中草药,1997,28(8):495-499.[7] 李惠,赵志礼,倪梁红. 华东地区大戟属药用植物资源调查研究[J]. 时珍国医国药, 2010,21(4):990-991.[8] 蒋继宏, 孟娜, 曹小迎. 苏皖产大戟属药用植物rDNA的ITS序列分析[J]. 中草药, 2005,36(6):900-902.[9] 孟娜,周守标,蒋继宏. 五种大戟属植物nrDNA的ITS序列分析及其叶的比较解剖学研究[J]. 广西植物,2006,26(1):18-21.[10] AUSUBEL F M,BRENT R, KINGSTON R E, et al. 精编分子生物学实验指南[M]. 颜子颖,王海林,译. 北京:科学出版社, 2002. 37-38.[11] 黄小英,刘瑛,赖小萍. 用CTAB法提取苎麻总DNA试验[J]. 江西农业学报,2001,13(4):40-42.。
改良CTAB法用于提取红麻成熟叶片高质量DNA的研究
１５８中国麻业科学ＰＬＡＮＴＦＩＢＥＲＳＣＩＥＮＣＥＳＩＮＣＨＩＮＡ２００７年第２９卷第３期文章编号：１６７３－７６３６（２００７）０３－０１５８－０５改良ＣＴＡＢ法用于提取红麻成熟叶片高质量ＤＮＡ的研究白凤虎，谢晓美，李德芳，陈安国，唐慧娟，李辉（中国农业科学院麻类研究所，湖南长沙４１０２０５）摘要：红麻处于光合高峰期的成熟叶片中的次生物质含量很高，给ＤＮＡ的提取造成很大的困难。
ＣＴＡＢ法能有效去除多糖杂质，但普通ＣＴＡＢ法用于红麻的ＤＮＡ提取效果很不理想，为使ＣＴＡＢ法能更好地用于红麻的ＤＮＡ提取，我们对此方法进行了改进，通过前处理除去大部分的杂质，减小了后续操作的难度。
为了验证前处理是否会损失ＤＮＡ，研究了液氮研磨对材料细胞的破碎程度问题，还讨论了ＤＮＡ提取中的其它一些相关问题。
关键词：改良ＣＴＡＢ法；去除多糖杂质中图分类号：Ｓ５６３．５文献标志码：Ａ随着分子生物学的发展，ＤＮＡ的提取与纯化成为基因克隆、分子标记等分子生物学研究的重要工作，因此，可以说ＤＮＡ的提取与纯化是分子生物学研究中非常重要也是非常基本的实验操作，ＤＮＡ提取的质量是分子生物学实验成败的关键因素之一。
ＤＮＡ的提取方法有多种（如ＣＴＡＢ法、ＳＤＳ法、高盐低ｐＨ法等），实验材料的选取也有多种，我们可以选择更适合的方法，也可以选择更容易成功的实验材料，从实验材料的选取方面入手降低实验的难度，但有时由于实验的需要必须使用那些富含杂质的材料，所以找到一种能够从“困难”植物中获取高质量ＤＮＡ的方法还是必须的。
由于相关实验的需要，必须提取红麻扦插苗的叶片ＤＮＡ，由于其处于光合高峰期，叶片组织细胞中含有大量的多糖、多酚、果胶、单宁等杂质，给基因组ＤＮＡ提取带来了很大的困难，用普通方法很难将这些杂质去除干净，用普通ＣＴＡＢ法提取红麻成熟叶片ＤＮＡ时会有如下现象：６５℃温浴时有褐变现象；氯仿／异戊醇抽提２－３次后所得上清液依然非常粘；所得ＤＮＡ很难用ＴＥ溶解且降解较严重。
CTAB法提取DNA简要步骤
1，取超低温保存的叶片样本，研钵磨碎后加入2.0ml离心管中(加入的叶片粉末量没过2.0ml 离心管的底部的尖端即可)。
2，迅速加入65℃预热过的CTAB 800μl（2%CTAB，使用前加入0.5-1% β-巯基乙醇），混合均匀后放入65℃水浴一小时。
每十分钟摇动一次，使CTAB与叶片样本充分混匀。
3，取出离心管至常温，放置2分钟后加入800μl氯仿/异戊醇（24:1）混合液，将混合液与CTAB混匀后缓缓摇动1-2分钟，使CTAB与氯仿充分接触。
4，12000rpm离心5-10分钟，小心吸取上清液至新的2.0ml离心管中，再次加入700μl氯仿/异戊醇混合液，缓缓混匀1-2分钟后，再次离心，吸取上清液至1.5ml离心管中。
5，迅速向1.5ml离心管中加入等体积的-20℃预冷过的异丙醇，混匀，-20℃放置2小时左右。
6，将-20℃保存的离心管取出，12000rpm离心5-10分钟，弃去液体，DNA应沉淀在离心管底部。
7，加入1ml 70%乙醇洗涤DNA沉淀（甩一下离心管让DNA沉淀飘起来就行），洗涤两次。
8，将乙醇洗涤过的DNA风干（超净工作台吹一下或者真空浓缩仪）。
9，风干后用50-80μl ddH2O溶解，待用。
本步骤一定不要多加水，SNP需要较高浓度DNA。
改进的CTAB提取植物DNA方法
ｗｈｅａｔ［Ｊ］．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，２００６，１５１：２５１－２６１．
Ｒ，ｅｔ ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｔｌａｓ ６６・ ｌｉｎｅｓ ｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇ ｉｎ
【８］Ｇｕｏ
Ｐ，Ｂａｉ
Ｇ，ｕ
ｄｅｒｉｖｅｄ
ｗｈｅａｔ ｎｅａｒ－ｉｓｏｇｅｎｉｃ
ａｌｕｍｉｎｕｍ（ＡＩ）ｔｏｌ・
第９期
李荣华，等：改进这一技术逐步改进， 如Ｓａｇｈａｉ—Ｍａｒｏｏｆ等研发出十六烷基三甲基溴化铵 （ＣＴＡＢ）法用于提取植物ＤＮＡ”１等，使得ＤＮＡ的提取 相对较为快捷，提取的质量提高。近几年来随着我校 对实验设备大量投入，一批适合于现代生命科学教学 和研究需要的仪器和设备能够满足要求。 在众多的ＤＮＡ提取方法中，发现ＣＴＡＢ法是一种 较为理想的提取植物ＤＮＡ的方法¨１。根据我院实验 室仪器设备的具体情况，我们多次使用ＣＴＡＢ法后发 现，这种方法还可以进一步的改进和完善。在多次指 导学生开展教学和研究活动过程中，总结出一种适合 于我院学生学习和开展研究活动的、操作简便且效果 好的ＤＮＡ提取方法，该方法可以使学生在较短时间获 得理想的实验效果，除了能直接观察到ＤＮＡ的丝状沉 淀外，在琼脂糖电泳中还可确定出所提取ＤＮＡ分子的 大小。
离心５ ｒａｉｎ，继续提取ＤＮＡ。
０００
ＤＮＡ提取缓冲液
根据ＣＴＡＢ提取ＤＮＡ的原理，配制如表１所示的 ＤＮＡ提取缓冲液。需要注意的是，ＣＴＡＢ和Ｂ一巯基乙 醇不能进行高温灭菌，因此，在配制提取缓冲液之前应 将其他成分进行高温灭菌，之后加入这２项试剂。
表１ ＤＮＡ提取缓冲液（１００ ｍＬ）的配制成分表
ＤＮＡ。
（１１）此步用于要求较高的科研中。一般来讲， ＲＮＡ不影响ＤＮＡ特性的分析，如想获得不含ＲＮＡ的
CTAB法分离总基因组DNA
实验一CTAB法分离植物总基因组DNA 本方法适用于从一系列的单子叶和双子叶植物中提取总DNA，产率一般为100－200μg/g鲜重组织。
药品试剂――液氮――2×CTAB缓冲液：100mmol/L Tris-HCL pH8.0,1.4mol/L NaCl,20mmol/L EDTA pH8.0, 2%CTAB, 0.7%(v/v) β－巯基乙醇（用前加入）――氯仿／异戊醇（24：1）――RNaseA：取100mg RNase溶于10ml含有10mmol/L Tris(pH7.5),15mmol/L NaCl的溶液中，配成10mg/ml的浓度，100℃热处理15min除去残留的DNase 活性，分装成小份-20℃保存。
――异丙醇Ac――76％乙醇＋10mMNH4――70％乙醇――TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCL，1mmol/L EDTA pH8.0仪器设备――天平――研钵和杵子――离心管――37℃、65℃、水浴――液氮――离心机（转速至少可达5000r）操作程序1、向装有700－800mg磨碎的干燥植物组织（最好是经去淀粉处理）的50ml聚丙烯离心管中加入20ml 65℃预热的1×CTAB提取缓冲液。
轻轻转动离心管使植物组织在提取缓冲液中均匀分散，65℃温育90min，并不时轻轻转动离心管。
或者，将10g经去淀粉处理的新鲜植物材料用液氮速冻，在研钵中将其磨碎，在化冻之前将粉末转移至一50ml聚丙烯离心管中，然后加入20－40ml预热至90℃的2×CTAB提取缓冲液。
轻轻转动离心管，混匀，然后置于65℃水浴放置60－90min。
2、混合物冷至室温后加入等体积的氯仿／异戊醇。
温和摇动15－40min使之充分混合。
室温下5000g离心10－15min分相。
3、将上清（水相）转移至一干净离心管中，加入1／100体积RNase贮液，颠倒混匀，37℃保温30min。
多种.植物总DNA提取方法及详细步骤
植物总DNA提取一、常用方法改良CTAB法（改良自精编分子生物学实验指南，原蓝猪耳实验方案，拟采用）植物基因工程，王关林，2002 SDS法（植物基因工程，王关林，2002）高盐低pH值法（邹喻萍，植物学报，1994）材料预处理：从野外采集的新鲜叶片若比较衰老，运回后可放在4℃的黑暗中饥饿1～2d，以消耗淀粉和其他多糖。
材料预处理：从野外采集的新鲜叶片若比较衰老，运回后可放在4℃的黑暗中饥饿1～2d，以消耗淀粉和其他多糖。
材料预处理：从野外采集的新鲜叶片若比较衰老，运回后可放在4℃的黑暗中饥饿1～2d，以消耗淀粉和其他多糖。
材料预处理：从野外采集的新鲜叶片若比较衰老，运回后可放在4℃的黑暗中饥饿1～2d，以消耗淀粉和其他多糖。
试剂：(1)2-巯基乙醇（2-ME）(2)CTAB抽提液(3)CTAB/ NaCl溶液(4)24：1（V/V）氯仿/异戊醇(5)CTAB沉淀液(6)高盐TE缓冲液(7)70％乙醇(8)TE缓冲液试剂：(1)2×CTAB提取缓冲液试剂：(1)提取缓冲液：100mmol/LTris·Cl（pH8.0）、50mmol/LEDTA（pH8.0）、500 mmol/LNaCl、10 mmol/L 2-巯基乙醇（2-ME）(2)10% SDS(3)5mol/L KAC试剂：(3)提取缓冲液：100mmol/LNaAC（pH 4.8）、50 mmol/LEDTA（pH 8.0）、500 mmol/LNaCl、1.4％SDS，此种介质刚好为pH 5.5。
(4) 2.5mol/L KAc（pH 4.8）操作：(1)称取样品0.2g，去除表面的DNA污染，置于研钵中与液氮共研成细粉。
(2)将冻粉转入2ml离心管中，立即加入1000µl（980＋20）预热至65℃的CTAB抽提操作：(1)2ml离心管中加入1ml提取缓冲液，65℃预热。
(2)取0.2g新鲜幼嫩叶片，于液氮中迅速研磨成粉。
一种番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法[发明专利]
![一种番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/048a8239ba68a98271fe910ef12d2af90242a8fb.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810678971.X(22)申请日 2018.06.27(71)申请人 中南大学湘雅二医院地址 410000 湖南省长沙市芙蓉区人民中路139号申请人 中南大学(72)发明人 申丽 谢志国 曾伟民 周智广 吴学玲 李交昆 余润兰 刘元东 胡芳 王俊俊 邱冠周 (74)专利代理机构 长沙朕扬知识产权代理事务所(普通合伙) 43213代理人 钱朝辉(51)Int.Cl.C12N 15/10(2006.01)(54)发明名称一种番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法(57)摘要一种番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：(1)将液氮中保存的番石榴叶片加入磷酸缓冲液中，再加无菌石英砂和玻璃珠，震荡后超声处理，离心得到含叶际微生物的混合液；(2)向含叶际微生物的混合液再加TENP 溶液，反复冻融处理后，加入溶菌酶和蛋白酶K，水浴，再加入SDS缓冲液，水浴，离心处理后得到沉淀a与上清液a；(3)向上清液a中加入氯仿与异戊醇，离心得到沉淀b与上清液b；(4)向上清液b 中加入PEG8000沉淀剂，冷冻保存后离心得到沉淀c与上清液c；(5)将沉淀c用乙醇洗涤，离心冷冻干燥后即得到番石榴叶际微生物基因组DNA。
本发明方法简单、提取率高，具有广阔的市场应用前景。
权利要求书1页 说明书7页CN 108866041 A 2018.11.23C N 108866041A1.一种番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将液氮中保存的番石榴叶片加入磷酸缓冲液中，再加无菌石英砂和玻璃珠，在可调漩涡混匀器上震荡，高强度漩涡震荡后进行超声处理后，离心去除番石榴叶片后得到含叶际微生物的混合液；(2)向步骤(1)中得到的含叶际微生物的混合液再加TENP溶液，反复冻融处理后，加入溶菌酶和蛋白酶K，水浴，再加入SDS缓冲液，水浴，离心处理后得到沉淀a与上清液a；(3)在步骤(2)中得到的上清液a中加入氯仿与异戊醇的混合溶液，静置后离心得到沉淀b与上清液b；(4)在步骤(3)中得到的上清液b中加入PEG8000沉淀剂，冷冻保存后离心得到沉淀c与上清液c；(5)将步骤(4)中得到的沉淀c用乙醇洗涤，离心冷冻干燥后即得到番石榴叶际微生物基因组DNA。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
9
91D
结果
G’E 质量
番石榴品种胭脂红 与 珍 珠 的 G’E 的 !9;K=> \ !9?K=> 值 为 D1?KY
D1BK"!9;K=> \ !9<K=> 值 约 91K" 说 明 提 取 的 G’E 基 本 去 除 了 蛋 白 质
酶 &<KY4K =@ G’E 模板 " 用无菌超纯水补至总体积为 94 !!( 反 应程序为 " 首先 BCJ 预变 性 4 >L=" 然 后 以 BCJ D >L= &49J "D14
图D 改良 *#EF 法提取的番石榴 G’E 的电泳图谱 D ) 胭脂红 %9 ) 珍珠
>L= &39J D >L= 进 行 CK 个 循 环 " 最 后 39J 保 温 ? >L= ( 扩 增 产
! 基地 2 " 和中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所科研
!"#
>>/0 A ! "G#E $ 溶 解 " 加 入 4 >/0 A ! ’H*0 至 终 浓 度 为 2 >/0 A ! "
然后加入无水乙 醇 至 终 浓 度 为 9:I &>L=%94J &D? KKK M A >L= 离 心 4 >L=% 取 上 部 C A 4 体 积 的 溶液 " 加入等体积酚 N 氯仿 ’DND $" 上下轻轻颠倒混匀 "94J &D? KKK
!0<;’$5&’ "
EFG:&’(6:H
/: ScR=EWR X>6X d[E;>RU R:RE; 6SH:9>W +,- d[>W\;U V=:9 6[EeE ;SEeS?3
C:’D,@;H
/XS >9B=:eSb /XS
./-0 +,- ScR=EWR>:H 9SRX:b3 WSHR=ER>:H :V ,E.;3 I:;4-’;H
进行了改良 # 建立了一种从番石 榴 叶 片 中 快 速 提 取 核 总 +,- 的 方法 # 为番石榴资源的分子评价等奠定了基础 %
)535 99:; < ! D+/- #(35 9:; < ! ,E.; #4F 巯 基 乙 醇 ! 用 前 加 "(
中 #748 水 浴 (5G)5 9>H & 加 入 537 倍 体 积 的 氯 仿 # 上 下 轻 轻 颠 倒 混匀约 4 9>H &(48 $&C 555 = < 9>H 离心 49>H & 取上清 # 加入 537 倍体积的异丙醇 # 上下轻轻颠倒混匀 &(48 $4 555 = < 9>H 离心 4
P45)
! 文献标识码 "
0
!"#$%&’()* +,’%- ./0 1$,2 34565!!"#$%&’ (&)*)+) 78" 9:56:; <= >2?$,6:@ A+0B C:’D,@
,-./ 0%123)4E5 67 894:(2*&:E5 ;<= >%:2?)4M5 >7 @%2A&E
E3 QRERS TSU !EM:=ER:=U :V 0>:RWXH:;:6U V:= /=:B>WE; .=:B?Y ZH?R>R[RS :V /=:B>WE; 0>:RSWXH:;:6UY AE>\:[ ]L2252^ M3 ZH?R>R[RS :V Q:[RXS=H Q[MR=:B>WE; .=:B?Y _XEH‘>EH6 ]a15I2^ .X>HS?S -WEbS9U :V /=:B>WE; -6=>W[;R[=S QW>SHWS?^ .X>HE
/XS ?>;>W:H 6S;@b=>Sb 6[EeE ;SEeS? fS=S 6=:[Hb >H RXS b=U 9:=RE= f>RX:[R ;>d[>b ,a3 h?>H6 RXS >9B=:eSb ./-0 9SRX:bY
B:;U?EWWXE=>bS fE? 6:R =>b :V MU W:9M>HSb [?S :V X>6X W:HWSHR=ER>:H :V ./-0Y ;:f W:HWSHR=ER>:H :V SRXEH:; EHb X>6X W:Hg R:RE; +,- W:[;b MS >?:;ERSb V=:9 6[EeE ;SEeS? d[>W\;U3 /XS B:;U?EWX=>bS? EHb B=:RS>H >H RXS ;SEeS? W:[;b MS 6:R =>b :V SVV>W>SHR;U EHb RXS M=:fH>H6 :V R>??[S? W:[;b MS >HX>M>RSb b[=>H6 RXS ScR=EWR>:H B=:WS??3 B;ERS V:= N.O3 6[EeE ;SEeS?3
!K:= L,$@; "
+,- ScR=EWRSb MU RXS 9SRX:b W:[;b MS b>6S?RSb MU =S?R=>WR>:H SHiU9S? EHb [?Sb E? RS9g /XS >9B=:eSb ./-0 9SRX:b W:[;b MS [?Sb V:= >?:;ER>H6 R:RE; +,- f>RX X>6X d[E;>RU V=:9
生
物
技
术
通
讯
!D//DOQ Z, 0Zo/D.A,o!opq
r:;32s ,:3] QSB3Y a55t
!"!
文章编号 !&55I@555(J(557K$4@$L4L@5)
技术方法
改良 ./-0 法提取番石榴叶片总 +,王家保 !! 杜中军 !! 雷新涛 "! 徐碧玉 !
中国热带农业科学院
E3 热带生物技术研究所 ! 热带作物生物技术国家重点实验室 ! 海南 海口 4L&&5&" M3 南亚热带作物
生
物
技
术
通
讯
!"##"$% &’ (&)#"*+’)!),-
./0123 ’/14 %5678 9::;
番石榴品种的总 G’E 质量检测结果相似 ! 数据未列出 $(
919
酶切及 T*$ 结果 经限制性内切酶 #$%$" 酶切后 "G’E 呈现相对分子质量 从
大到小的弥散状态 " 图 D 中完整的大分子 量 片 段 消 失 " 酶 切 完 全 ! 图 9 $" 说明提取的 G’E 去除 $’E 后可用于酶切 (
J,)&-4;(,)H
6[EeE JB"%$%&’ (&)*)+) !3j^ +,-^ ScR=EWR>:H 9SRX:b^ ./-0
番 石 榴 !!"#$%&’ (&)*)+) !" " 是 桃 金 娘 科 番 石 榴 属 植 物 # 在 我国已有近 #$$ 年的栽培历史 # 长期 的 栽 培 过 程 中 培 育 和 引 进 了许多优良品种 # 如胭脂红 $ 珍珠 $ 新世纪等 % 对 这 些 资 源 加 以
%&’
基地 ! 基地 ( "% 摘取幼叶或幼果 # 放入盛有足量硅胶的封口袋中 # 充分干燥 # 室温保存 % 先以胭脂红与珍珠等 ( 个品种为试材研究
+,- 提取方法 # 然后提取 24 个品种的番石榴的总 +,- 进行验
证%
收集整理并进行适当的评价 # 可为番石 榴 育 种 及 优 良 品 种 的 推 广奠定基础 % 已有若干研究者进行过番 石 榴 生 物 学 特 性 及 栽 培 技术的研究 %(#)*# 但从分子水平研究评价番石榴资源尚未见报道 % 提取高质量的核总 +,- 是进行分子生物学工作的前提 % 番 石 榴 叶 片 富 含 多 糖 $多 酚 $蛋 白 质 等 高 分 子 物 质 #影 响 着 提 取 的
C9? <::
图 < 改良 *#EF 法提取的 D4 个品种番石榴的 G’E 的 &%%$ZT*$ 图谱 ] )G!9KKK %D) 迷你 %9 ) 珍珠 %<) 鳄鱼皮 %C ) 新世纪 %4) 红肉 %; ) 胭脂红 %3 ) 水晶 %? ) 红番石榴 %B ) 迷你 %DK) 澳大利亚番石榴 % DD) 海南黄肉 %D9 ) 长形无籽 %D< ) 五爪无籽 %DC ) 海南红肉 %D4 ) 泰国番石榴 ( DY? 取自基地 D %BYD4 取自基地 9
表 D 改良 *#EF 法提取的 G’E 紫外检测结果及产率 品种 胭脂红 珍珠
!9<:=> :79BC :7D?C
!9;:=> :7;:4 :7<;C
!9?:=> :7<9< :7DB<
!9;:=> " !9?:=> D7?3 D7??
!9;:=> " !9<:=> 97:; D7B?