双倒数作图法米氏方程
米氏方程
1米氏学说的提出20世纪初就发现酶被底物饱和的现象，而这种现象在非酶促反应中则是不存在的。
后来发现底物浓度的改变对酶反应速度的影响非常复杂。
在一定的酶浓度下，如将初速度（v）对底物浓度（[S]）作图，可以看到当底物浓度较低时，反应速度与底物浓度呈正比，表现为一级反应（first order reaction）；随着底物浓度的增加，反应速度不再按正比升高，在这一段，反应表现为混合级反应（mixed order reaction）。
如果继续加大底物浓度，曲线表现为零级反应（zero order reaction），此时，尽管底物浓度不断加大，反应速度却不再上升，趋向一个极限，说明酶已被底物饱和（saturation）。
所有的酶都有此饱和现象，但各自达到饱和时所需的底物浓度并不相同，甚至差异很大。
曾有各种假说来解释上述现象，其中比较合理的是“中间产物”学说。
按此学说认为：酶与底物先络合成一个络合物，此中间产物亦被人们看作为稳定的过渡态物质。
然后络合物再进一步分解，成为产物和游离态酶。
1913年前后Michaelis和Menten在前人工作基础上作了大量的定量研究，积累了足够的实验证据，从而提出了酶促动力学的基本原理，并归纳了一个数学式加以表达：这个式子称为米氏方程，它的前提是酶与底物反应的“快速平衡说”——开始，两者反应速度较快，迅速地建立平衡。
米氏方程表明了底物浓度与酶反应速度间的定量关系。
这就使“中间产物”假说得到了普遍承认，现在一般称为“米氏学说”。
2米氏常数的意义（一）当酶促反应处于v=Vmax/2的特殊情况时，有[S]=Km；由此可以看出Km的物理意义，即Km值是当酶反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，它的单位是摩尔/升，与底物浓度的单位一样；（二）Km值是酶的特征性常数。
Km值的大小，只与酶的性质有关，与酶的浓度无关。
酶的种类不同，Km值不同，同一种酶与不同底物作用时，Km值也不同。
生物化学名词解释
生物化学名词解释《生物化学》——名词解释氨基酸（amino acids）:是含有一个碱性氨基和一个酸性羧基的有机化合物，氨基一般连接在α-碳上。
氨基酸是肽和蛋白质的构件分子。
必需氨基酸（essential amino acids）：指人（或其它脊椎动物）自己不能合成，需要从饮食中获得的氨基酸，例如赖氨酸、苏氨酸等氨基酸。
非必需氨基酸（nonessential amino acids）：指人（或其它脊椎动物）自己能由简单的前体合成的，不需要由饮食供给的氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸等氨基酸。
等电点（pI，isoelectric point）：使分子处于兼性分子状态，在电场中不迁移（分子的净电荷为零）的pH值。
茚三酮反应（ninhydrin reaction）：在加热条件下，氨基酸或肽与茚三酮反应生成紫色（与脯氨酸反应生成黄色）化合物的反应。
肽键（peptide bond）：一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基缩合，除去一分子水形成的酰胺键。
肽（peptides）：两个或两个以上氨基酸通过肽键共价连接形成的聚合物。
蛋白质一级结构(primary structure)：指蛋白质中共价连接的氨基酸残基的排列顺序。
层析(chromatography)：按照在移动相（可以是气体或液体）和固定相（可以是液体或固体）之间的分配比例将混合成分分开的技术。
离子交换层析(ion-exchange column chromatography)：使用带有固定的带电基团的聚合树脂或凝胶层析柱分离离子化合物的层析方法。
透析（dialysis）：通过小分子经半透膜扩散到水（或缓冲液）的原理将小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术。
凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)：也叫做分子排阻层析（molecular-exclusion chromatography）。
一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。
Lineweaver-Burk 双倒数作图
米氏方程（Michaelis-Menten Equation）或米曼氏动力学（Michaelis-Menten kinetics）是由Leonor Michaelis和Maud Menten 在1913年提出，是酶学中极为重要的可以描述多种非变异构酶动力学现象、表示一个酶促反应的起始速度V（有些资料中也称为V o）与底物浓度[S]关系的速度方的方程，米氏方程形式如下：
其中，Vmax表示酶被底物饱和时的反应速度，Km值称为米氏常数，是酶促反应速度V为最大酶促反应速度值一半时的底物浓度。
在酶促反应中，底物情况在低浓度下，反应相对于底物是一级反应（first order reaction）；而当底物浓度处于中间范围时，反应（相对于底物）是混合级反应（mixed order reaction）；当底物浓度增加时，反应由一级反应向零级反应（zero order reaction）过渡；当底物浓度[S]逐渐增大时，速度V相对于[S]的曲线为一双曲线。
下图为米氏方程的模拟
作图：
酶促反应中的米氏常数的测定和Vmax的测定有多种方法。
比如固定反应中的酶浓度，然后测试几种不同底物浓度下的起始速度，即可获得Km和Vmax值。
但直接从起始速度对底物浓度的图中确定Km 或Vmax值是很困难的，因为曲线接近Vmax时是个渐进过程。
因此，通常情况下，我们都是通过米氏方程的双倒数形式来测定，即Lineweaver-Burk plot，也可称为双倒数方程(double-reciprocal plot)：
将1/V 对1/[S]作图，即可得到一条直线，该直线在Y轴的截距即为1/Vmax，在X轴上的截距即为1/Km的绝对值。
示意图如下：。
基础生物化学实验-米氏常数Km
0.4
-1/Km
0.2
1/Vmax
0.0 -4 -2 0 2 4
-1
6பைடு நூலகம்
8
10
1/[S](1/m m ol.L )
实验器材
1、37℃恒温水浴 2、量筒 3、三角瓶 4、碱式滴定管（注意：排尽管内气泡） 5、试管
试剂
1．5% 酪蛋白溶液（pH8.5） 2．4%胰蛋白酶溶液 3．甲醛溶液 (自己稀释) 4．酚酞 5．0.1N NaOH（自己稀释）
注意事项
1、甲醛要稀释 2、酶促反应的时间要精确控制 3、滴定过程中要不断晃动锥形瓶 4、滴定终点的判断：30s内不褪色可视为稳 定。
操作
1、用配好的5%的酪蛋白原液配制7个浓度的酪蛋白 2、4%胰蛋白酶及酪蛋白37℃保温10min 3、取7个三角瓶，每个三角瓶加入甲醛5ml及酚酞10滴 4、酪蛋白试管1反应：加1ml胰蛋白酶混匀，反应5分 钟，将反应液转入三角瓶中，用0.1N的NaOH滴定， 直到获得稳定的粉红色为止。 试管2-7反应同上，计算NaOH量 5、以NaOH消耗的毫升数代表在每种底物浓度下的 V，以1/V对1/［S］作图，求出胰蛋白酶的米氏常数 Km和最大速度Vmax
生物化学实验
Biochemical Experiment 胰蛋白酶米氏常数 （Km）的测定 ——甲醛滴定法
目的要求
z掌握用滴定法测胰蛋白酶的米氏常数 z掌握双倒数作图法计算Km和Vmax
原理
z 本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白为例，采用双倒数 作图法测定Km值。 z 胰蛋白酶是胰液中的一个酶，它催化蛋白质中碱 性氨基酸（L-精氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成 的肽键水解。水解时生成自由氨基。 z 常温下，甲醛能迅速与氨基酸上的氨基结合，形 成羟甲基衍生物，使N+H3上的H+游离出来，使溶液 的酸度增加，这样就可以用碱滴定N+H3放出H+，滴 定终点在酚酞的变色域内(pH9.0左右)。因此，可 用酚酞作指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定。
酶促反应动力学实验报告
酶促反应动力学实验报告14301050154 杨恩原实验目的：1.观察底物浓度对酶促反应速度的影响2.观察抑制剂对酶促反应速度的影响3.掌握用双倒数作图法测定碱性磷酸酶的Km值实验原理：一、底物浓度对酶促反应速度的影响在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶的催化作用有很大的影响。
在一般情况下，当底物浓度很低时，酶促反应的速度(v)随底物浓度[S]的增加而迅速增加，但当底物浓度继续增加时，反应速度的增加率就比较小，当底物浓度增加到某种程度时反应速度达到一个极限值(即最大速度Vmax)。
底物浓度和反应速度的这种关系可用米氏方程式来表示(Michaelis-Menten方程)即：式中Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数，[S]为底物浓度当v=Vmax/2时，则Km=[S]，Km是酶的特征性常数，测定Km是研究酶的一种重要方法。
但是在一般情况下，根据实验结果绘制成的是直角双曲线，难以准确求得Km和Vmax。
若将米氏方程变形为双倒数方程(Lineweaver-Burk方程)，则此方程为直角方程，即:以1/V和1/[S]分别为横坐标和纵坐标。
将各点连线，在横轴截距为-1/Km，据此可算出Km值。
本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同浓度底物时的酶活性，再根据1/v和1/[S]的倒数作图，计算出其Km值。
二、抑制剂对酶促反映的影响凡能降低酶的活性，甚至使酶完全丧失活性的物质，成为酶的抑制剂。
酶的特异性抑制剂大致上分为可逆性和不可逆性两类。
可逆性抑制又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制等。
竞争性抑制剂的作用特点是使该酶的Km值增大，但对酶促反映的最大速度Vmax值无影响。
非竞争性抑制剂的作用特点是不影响[S]与酶的结合，故其Km值不变，然而却能降低其最大速度Vmax。
本实验选取Na2HPO4作为碱性磷酸酶的抑制物，确定其抑制作用属于哪种类型。
实验步骤：实验一:底物浓度对酶促反应速度的影响1.取试管9支，将0.01mol/L基质液稀释成下列不同浓度：管号试剂2.另取9支试管编号，做酶促反应：管号试剂3.混匀，37 ℃水浴保温5分钟左右。
教材.教案--发酵工程与设备 教材
发酵工程与设备第一章绪论生物技术作为21世纪高新技术的核心，对人类面临的食品、资源、健康、环境等重大问题发挥越来越大的作用。
大力发展生物技术及其产业已成为世界各国经济发展的战略重点。
一．发酵工程的主要内容发酵工程（Fermentation Engineering）属于生物技术的范畴，生物技术又称生物工艺学，最初是由一位匈牙利工程师Karl.Ereky于1917年提出的。
当时他提出的生物技术这一名词的涵义是指甜菜作为饲料进行大规模养猪，即利用生物将原料转化为产品。
现在的生物技术的定义为：生物技术是应用自然科学及工程学原理依靠生物催化剂的作用将物料进行加工以提供产品或社会服务的技术。
因此，生物技术是一门综合性多学科技术，他涉及的基础学科有生物学、化学和工程学。
下图为生物技术与基础学科关系的示意图。
它逐渐成为与生物学、生物化学、化学工程等多学科密切相关的综合性边缘学科。
现代生物技术作为一门新兴的高科技术产业，它的生命力在于他对社会经济和发展的各个方面都带来了极大冲击和影响。
发酵工程是指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的技术。
发酵工程由于涉及到生物催化剂，因而与化学反应有关。
由于生物技术的最终目标是建立工业生产过程为社会服务，因而该生产过程可称为生物反应过程（亦称为生化反应过程）。
在发酵技术中一般包括微生物细胞或动植物细胞的悬浮培养，或利用固定化酶，固定化细胞所做的反应器加工底物（即有生化催化剂参加），以及培养加工后产物大规模的分离提取等工艺。
主要是在生物反应过程中提供各种所需的最适环境条件。
如酸碱度、湿度、底物浓度、通气量以及保证无菌状态等研究内容。
二、发酵工程的发展历史生物技术的发展和利用可以追溯到1000多年（甚至4000多年）以前如酒类的酿造。
而人类有意识地利用酵母进行大规模发酵生产是在19世纪。
当时进行大规模生产的发酵产品有乳酸、酒精、面包酵母、柠檬酸和蛋白酶等初级代谢产物。
Km与双倒数方程
米氏方程（Michaelis-Menten Equation）或米曼氏动力学（Michaelis-Menten kinetics）是由Leonor Michaelis和Maud Menten在1913年提出，是酶学中极为重要的可以描述多种非变异构酶动力学现象、表示一个酶促反应的起始速度V（有些资料中也称为Vo）与底物浓度[S]关系的速度方的方程，米氏方程形式如下：其中，Vmax表示酶被底物饱和时的反应速度，Km值称为米氏常数，是酶促反应速度V为最大酶促反应速度值一半时的底物浓度。
在酶促反应中，底物情况在低浓度下，反应相对于底物是一级反应（first order reaction）；而当底物浓度处于中间范围时，反应（相对于底物）是混合级反应（mixed order reaction）；当底物浓度增加时，反应由一级反应向零级反应（zero order reaction）过渡；当底物浓度[S]逐渐增大时，速度V相对于[S]的曲线为一双曲线。
下图为米氏方程的模拟作图：酶促反应中的米氏常数的测定和Vmax的测定有多种方法。
比如固定反应中的酶浓度，然后测试几种不同底物浓度下的起始速度，即可获得Km和Vmax值。
但直接从起始速度对底物浓度的图中确定Km 或Vmax值是很困难的，因为曲线接近Vmax时是个渐进过程。
因此，通常情况下，我们都是通过米氏方程的双倒数形式来测定，即Lineweaver-Burk plot，也可称为双倒数方程(double-reciprocal plot)：将1/V 对1/[S]作图，即可得到一条直线，该直线在Y轴的截距即为1/Vmax，在X轴上的截距即为1/Km的绝对值。
示意图如下：酶浓度[E]一定，则对特定底物Vmax为一常数。
催化常数kcat 又称酶的转化数，数值上与k3同，为酶被底物饱和时，每秒钟每个酶分子转换底物的分子数。
大多数酶的kcat 为1~104/sec，见P322 表8-2，为每秒钟酶促反应每微摩尔酶分子转换底物的微摩尔数。
酶的反应动力学
双倒数作图法
（二）双底物的反应
双底物反应的动力学
1 乒乓反应动力学
v
Vm axAB
2、〔S〕 >> 〔E〕,[S]-[ES] ≈[S]
3、反应系统处于稳态平衡状态，即〔ES〕的形成速度等于〔ES〕 的分解速度：d〔ES〕/dt＝－d〔ES〕/dt
ES的形成速度： d〔ES〕/ dt＝k1〔E〕〔S〕
ES的分解速度： －d〔ES〕/ dt＝（k2＋k3）〔ES〕
稳态平衡下， k1〔E〕〔S〕 ＝（k2＋k3）〔ES〕
（2）特点：
① 抑制剂I与底物S在化学结构上相似，能与 底物S竞争酶E分子活性中心的结合基团.
例如，丙二酸、苹果酸及草酰乙酸皆和琥珀酸 的结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。
②抑制程度取决于抑制剂与底物的浓度比、 〔ES〕和〔EI〕的相对稳定性；
③加大底物浓度，可使抑制作用减弱甚至消除。
（3）竞争性抑制剂的动力学方程
（一）不可逆性抑制作用
不可逆性抑制作用的抑制剂，通常以共 价键方式与酶的必需基团进行不可逆结合 而使 酶丧失活性。常见的不可逆抑制剂如下图 所 示。按其作用特点，又分专一性及非专一 性两种。
1.非专一性不可逆抑制
抑制剂与酶分子中一类或几类基团作用，不论 是必需基团与否，皆可共价结合，由于其中必需基 团也被抑制剂结合，从而导致酶的抑制失活。某些 重金 属(Pb++、Cu++、Hg++)及对氯汞苯甲酸等，能与酶分 子的巯基进行不可逆适合，许多以巯基作为必需基 团 的酶(通称巯基酶)，会因此而遭受抑制，属于此种 类型。用二巯基丙醇(british anti lewisite,BAL)或二巯基丁二酸钠等含巯基的化合 物可使酶复活。
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米氏方程与双倒数作图法(Lineweaver-Burk plot)
米氏方程（Michaelis-Menten Equation）或米曼氏动力学（Michaelis-Menten kinetics）是由Leonor Michaelis和Maud Menten在1913年提出，是酶学中极为重要的可以描述多种非变异构酶动力学现象、表示一个酶促反应的起始速度V（有些资料中也称为Vo）与底物浓度[S]关系的速度方的方程，米氏方程形式如下：
其中，Vmax表示酶被底物饱和时的反应速度，Km值称为米氏常数，是酶促反应速度V为最大酶促反应速度值一半时的底物浓度。
在酶促反应中，底物情况在低浓度下，反应相对于底物是一级反应（first order reaction）；而当底物浓度处于中间范围时，反应（相对于底物）是混合级反应（mixed order reaction）；当底物浓度增加时，反应由一级反应向零级反应（zero order reaction）过渡；当底物浓度[S]逐渐增大时，速度V相对于[S]的曲线为一双曲线。
下图为米氏方程的模拟作图：
酶促反应中的米氏常数的测定和Vmax的测定有多种方法。
比如固定反应中的酶浓度，然后测试几种不同底物浓度下的起始速度，即可获得Km和Vmax值。
但直接从起始速度对底物浓度的图中确定Km或Vmax值是很困难的，因为曲线接近Vmax时是个渐进过程。
因此，通常情况下，我们都是通过米氏方程的双倒数形式来测定，即Lineweaver-Burk plot，也可称为双倒数方程(double-reciprocal plot)：
将1/V 对1/[S]作图，即可得到一条直线，该直线在Y轴的截距即为1/Vmax，在X轴上的截距即为1/Km的绝对值。
示意图如下：。