传统发酵泡菜优势微生物及其代谢特性_熊涛

Changes and Metabolic Characteristics of Main Microorganisms during Chinese Sauerkraut Fermentation
XIONG Tao, PENG Fei, LI Xiao, LI Junbo, GUAN Qianqian (State Key Laboratory of Food Science and Technology, College of Life Science and Food Engineering, Nanchang University,
saccharomycetes and mycete. The pH was reduced from 5.7 to 3.2 after 7 days of fermentation. The utilization of sucrose
during the fermentation was strong, as indicated by a reduction from 74.4 to 18.4 mmol/L. However, glucose and fructose
※生物工程
食品科学
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对泡白菜卤水中乳酸菌、酵母菌、霉菌和肠杆菌等优势 微生物进行了分离鉴定和抗菌特性的研究；张伟[5]研究了 自然发酵泡菜过程中主要化学成分的变化以及乳酸菌、 酵母菌、霉菌等微生物菌落长势变化；陈功等[6]对四川泡 菜的挥发性成分和主体风味物质进行了分析研究。从已 有的研究成果来看，对传统发酵泡菜的微生物动态变化 的研究多见于乳酸菌，酵母菌和霉菌则较少，且未发现 对泡菜中的醋酸菌进行分离计数的研究；而在代谢物分 析方面，已有的研究主要集中在对自然发酵泡菜的还原 糖和总酸含量的变化进行监测及对挥发性风味物质进行 分析。本实验利用不同的选择性培养基及鉴定方法，对 我国传统发酵泡菜发酵过程中优势微生物（乳酸菌、酵 母菌、醋酸菌和霉菌）进行平板分离计数，并使用高效 液相色谱技术（high performance liquid chromatography， HPLC），对发酵过程中的多种糖类及有机酸变化进行分 析，从而明确泡菜在自然发酵过程中优势微生物的菌系 变化、代谢底物和代谢产物的含量变化，为进一步揭示 我国传统发酵泡菜发酵过程中多菌种协同发酵的机理提 供科学的理论依据。
传统泡菜的配方见表1，其制作工艺如下：
圆白菜→清洗→沥干→切分→装坛→密封→发酵
（20 ℃）→成品
↑
盐水（花椒等辅料）
表 1 泡菜配方 Table 1 Formulation of Chinese sauerkraut
配料
大蒜 花椒 辣椒 生姜 冰糖 碘盐
添加量/（g/100 mL水） 3 1.5 4
氯化钠、氢氧化钠、碳酸钙、无水乙醇、氯化铁、 浓硫酸（均为分析纯） 上海国药集团化学试剂公 司；蔗糖、葡萄糖、果糖、乙醇、柠檬酸、苹果酸、乳 酸、乙酸、琥珀酸、丙酮酸（均为分析标准品） 美国 Sigma公司。 1.2 仪器与设备
Agilent 1260型高效液相色谱仪 美国安捷伦公 司；Aminex-87H色谱柱 美国伯乐公司、TG-16W微 量高速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司； YXQ-LS-50SⅡ/75SⅡ立式压力蒸汽灭菌器 上海博 迅实业有限公司医疗设备厂；DNP-9272型生化培养箱 上海精宏实验设备有限公司；Airtech生物安全柜 苏净 集团安泰公司；PHS-25型pH计 上海精密科学仪器有 限公司。 1.3 方法 1.3.1 传统泡菜的制作工艺及配方
谢产物和多种挥发性风味物质，从而得到风味良好的成 熟泡菜。对泡菜发酵过程中的优势微生物和代谢物质进 行分析，是深入研究我国传统发酵泡菜的必经之路。国 内外不少研究学者对自然发酵泡菜中的乳酸菌进行了分 离鉴定及特性研究[2]。国内有学者对泡菜环境中的菌株进 行了分离且采用分子生物学技术进行鉴定[3]：燕平梅等[4]
of ethanol and acetic acid increased in the early stage of the fermentation process.
Key words: Chinese sauerkraut; lactic acid bacteria; fermentation; metabolism
1.3.4 发酵液中糖和有机酸的分析 发酵液经离心（12 000 r/min，10 min）后，取上清
液过0.22 μm滤膜，得到滤液用于高效液相色谱分析。色 谱条件：进样量20 μL，流动相为6 mmol/L硫酸溶液， 流速为0.5 mL/min，温度45 ℃，紫外检测器检测波长 205 nm。以保留时间定性，以峰面积定量。示差折光检 测器检测糖醇（蔗糖、葡萄糖、果糖、乙醇）含量，紫
中图分类号：TS201.3
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）03-0158-04
doi:10.7506/spkx1002-6630-201503030
泡菜是我国传统特色发酵食品的典型代表之一，距 今已有3 000多年的历史[1]。我国传统发酵泡菜的加工方 式多以自然发酵为主，即利用附着在蔬菜表面的微生物 进行发酵。在盐水浸泡环境中，蔬菜本身携带的多种微 生物（以乳酸菌为主）迅速繁殖，并利用以糖类为主的 碳水化合物进行代谢活动，生成乳酸、乙醇、乙酸等代
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食品科学
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泡菜发酵启动后，圆白菜中的苹果酸和柠檬酸等有 机酸渗出到卤水中，同时肠膜明串珠菌、粪肠球菌等乳 酸球菌迅速繁殖并代谢产酸，造成了pH值在发酵初期的 快速下降。乳球菌的代谢活动会因低pH值环境的影响而 受到抑制[8]，从而导致菌数和产酸量的减少，推测这是造 成发酵第2天pH值下降速率变缓的主要原因。发酵进入第 3天后，乳杆菌大量繁殖并产酸，使得泡菜发酵液pH值进 一步降低。在整个发酵期内，乳酸菌代谢产生的有机酸 是发酵液pH值下降的主要原因。 2.2 发酵期内优势微生物的动态变化
1 材料与方法
1.1 材料、培养基与试剂 圆白菜、食盐、冰糖、生姜、大蒜、干辣椒、花椒
等购于当地市场。 乳酸菌分离计数培养基：MRS培养基，配制方法参
照GB 4789.35—2010《食品卫生微生物学检验 食品中 乳酸菌检验》。酵母菌及霉菌分离计数培养基：虎红琼 脂，购于北京奥博星公司。醋酸菌分离计数培养基：醋 酸菌固体培养基[7]。
Nanchang 330047, China)
Abstract: Laboratory scale fermentations of Chinese sauerkraut were performed to investigate the changes in
microorganisms, the pH of the brine, the substrates and the metabolic products. The main microorganisms were monitored
using selective agar medium. The substrates and the metabolic products were analyzed by high performance liquid
chromatography. The results evidenced that the main microorganisms included lactic acid bacteria, acetic bacteria,
收稿日期：2014-04-09 基金项目：“赣鄱英才555工程”领军人才培养计划项目（18000063）；江西省教育厅高校科技落地计划项目（赣财教
[2011]243号）；国家重点实验室自由探索课题（SKLF-ZZB-201309）；国家高技术研究发展计划（863计划） 项目（2011AA100904） 作者简介：熊涛（1970—），男，教授，博士，研究方向为益生菌及大宗果蔬高值化利用。E-mail：xiongtao0907@
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圆白菜 50
1.3.2 取样 泡菜入坛后，0～7 d内，每隔12 h，取发酵液进行代
谢产物、pH值的测定以及优势微生物的分离计数。
1.3.3 优势微生物的分离计数 无菌条件下，取1 mL发酵液于装有9 mL无菌生理盐
水的试管中，充分摇匀，制成1∶10稀释菌悬液，然后按 照每级10 倍的次序梯度稀释。选择3 个合适梯度，分别 涂布于MRS培养基置于37 ℃培养48 h、虎红培养基和醋 酸菌固体培养基置于30 ℃培养3～5 d后计数，每个梯度 做2 个平行样。
外检测器检测有机酸（柠檬酸、苹果酸、乳酸、乙酸）
含量。
2 结果与分析
2.1 发酵期内发酵液pH值的变化
pH
6 5 4 3 2 1 0
0
Fig.1
1234567 ਁ䞥ᰦ䰤/d
图 1 发酵过程中pH值的变化
Changes in pH during the fermentation
由图1可知，传统发酵泡菜发酵过程中pH值呈下降趋 势。发酵前24 h，pH值即由5.7迅速降至4.2；发酵第2天 pH值下降速率放缓，从4.2降至3.9；发酵进入第3天，pH 值持续下降，并在进入第5天后趋于平稳，发酵结束时pH 值降至3.2。
respectively) were observed after 24 and 12 h of fermentation followed by a decline until reaching a plateau. As the major
metabolic product, lactic acid was steadily increased from 5.6 to 149.6 mmol/L during the fermentation; moreover, the levels