细胞生物学实验报告——动物细胞融合

山东大学细胞生物学实验报告
聚乙二醇（PEG ）法诱导的动物细胞融合实验
2012/9/11
实验目的：
了解细胞融合技术的发展过程和主要方法的基本原理，用聚乙二醇(PEG)化学诱导法进行鸡血红细胞的融合实验，掌握实验的基本操作，观察鸡血红细胞融合的不同时期。

实验原理：
1. 细胞融合的概念
两个或两个以上的细胞或原生质体在自然或人为诱导的情况下细胞质膜相互融合，细胞质相互混合成为一个整体杂合细胞的现象被称为细胞融合。

细胞融合可以发生在同种细胞之间也可以在不同物种间实现。

2. 细胞人工融合的主要方法及基本原理
细胞体外融合的主要方法分为病毒诱导，化学诱导和物
理诱导。

1953年，M. Kuroya 在临床中第一次分离到仙台
病毒（HVJ ）[1]。

1958年，日本学者Okada 发现仙台病毒
（HVJ ）能诱导动物细胞融合[2]，其基本原理是仙台病毒
的衣壳上有细胞表面受体的结合位点，可以诱导不同细
胞凝集，最终使不同细胞的细胞膜相互融合。

1974年，加拿大学者高国楠发明了细胞的聚乙二醇
（Polyethyleneglycol ，PEG ）化学融合法，由于该方法对
实验条件要求极低，试剂易得，操作简单，成为应用最广泛
的细胞融合方法。

化学诱导细胞融合的基本原理是PEG 等化
学物质能够诱导细胞膜磷脂分子的极性基团发生结构重
排，相互接触的细胞在细胞膜恢复过程中借助磷脂分子的亲和作用和表面张力实现融合。

比之于仙台病毒诱导法，PEG 诱导法的效率提高了几百倍。

80年代，科学家发明了细胞电融合法[4, 5]
，电融合法将细胞融合的产率提高到了50%-80%。

电融合法的建立是基于细胞膜表面带电荷的性质。

当在细胞悬液周围加入特定方向的电场时，细胞表面会发生极化现象，相邻的细胞将吸附在一起。

这时突然提高电场强度，细胞间彼此接触的细胞膜会被击穿，细胞膜修复时受到磷脂分子间的亲和作用和细胞膜表面张力的作用将会发生融合。

图2. 以电融合方法得到的3T3-C2融合细胞 （引自J. Teissie 等，1982 )。

图1. 仙台病毒示意图。

a 和b 是病毒套膜，c 为糖蛋白，d 为类染色体。

3. 细胞融合的应用
细胞融合最成功的应用是实现了大量制备单克隆抗体（Kohler& Milstein，1975）。

图3. 以细胞融合技术制备单克隆抗体的流程示意图。

1975年，G. Kohler和C. Milstein首次成功使用细胞融合技术制备了抗绵羊血红细胞（SRBC）的抗体。

他们首先用灭活的仙台病毒（HVJ）诱导小鼠对羊血红细胞免疫的脾细胞与小鼠多发性骨髓瘤细胞发生融合，然后以选择培养基（HAT）选择出杂交细胞，进而以SRBC作为免疫原筛选产生特异抗羊血红细胞的杂交细胞，最终获得了既能产生特异抗体又能无限增殖的杂交瘤细胞[3]。

此外，细胞融合技术在种质资源开发、膜蛋白研究等领域也有重要应用。

材料试剂：
新鲜鸡血，GKN 缓冲液，Alsever抗凝液，0.85% NaCL溶液，0.5ml 50%聚乙二醇（PEG，4000Da）溶液仪器：
离心机，普通光学显微镜，玻璃刻度离心管，5ml注射器，胶头吸管，普通玻片
实验步骤：
1.用注射器在公鸡翼下静脉处抽取新鲜鸡血2ml，加入8ml 抗凝剂Alsever溶液，混匀得细胞悬液。

2.取1ml上述悬液加入4ml 0.85% NaCL溶液，以约1000r/ min 离心5min，弃上清后加入5ml 0.85% NaCL
溶液再次以约1000r/ min 离心5min。

弃上清，加入5ml 0.85% NaCL溶液以约1000r/ min 离心7min，弃上清。

3.向细胞沉淀中加入1-2ml GKN缓冲液，得到约10%的鸡血红细胞悬液。

4.向上一步的悬液中加入约3ml GKN缓冲液使细胞悬液中鸡血红细胞的浓度达到1.5×107左右。

5.取上一步悬液0.5-1.0 ml，贴壁加入0.5ml 50%聚乙二醇（PEG），静置约3min，混匀，加入1ml GKN缓
冲液混匀静置约2min后涂片观察。

6. 将肺癌细胞悬液与第4步处理后的鸡血红细胞悬液等体积混合，充分混匀后进行第5步诱导处理，涂片
观察肺癌细胞与鸡血红细胞的融合情况。

实验结果：
图4. PEG诱导下鸡血红细胞发生细胞融合的过程（a，b，c）和肺癌细胞融合（d）。

a.两个相互接触的鸡血红细胞在PEG诱导下细胞膜开始发生融合。

b.发生部分细胞质融合的两个鸡血红细胞，此时两个细胞核尚未接触。

c.细胞融合接近完成的两个鸡血红细胞，两个细胞的细胞核开始融合。

d.在PEG诱导下开始发生细胞融合的两个肺癌细胞。

从实验照片（图4）中可以看到，实验中鸡血红细胞涂片上可以观察到细胞融合不同时期的血红细胞。

但是发生融合的细胞只占细胞总数的极小比例，寻找融合细胞的过程十分困难，这说明实验中细胞的实际融合率非常低。

由于实验条件所限，照片（图4）未标明比例尺，不同照片之间实际放大比例不一致，图d 中的肺癌细胞实际上比图a、b、c中的鸡血红细胞大很多。

讨论：
实验基本验证了PEG化学诱导法诱导动物细胞融合的全过程，但是实验中主要的问题是PEG诱导成功率太低。

对比PEG诱导的最适宜条件（PEG浓度40%-60%，诱导温度38-40℃），实际实验操作时的PEG 浓度最高只有约25%，而且融合温度不到30℃（较低的温度会使细胞膜流动性变差），这直接导致细胞融合率降低。

考虑到即使在使用最适宜条件的情况下，PEG诱导细胞融合的融合率也远远达不到30%，所以在本次实验的条件下，融合率极低是可以理解的。

保证实验中细胞的融合率还有一点就是在使用PEG处理的一步，PEG需要与血红细胞充分作用。

实际使用时发现，50%的PEG溶液密度相当大，加入离心管后会自动与红细胞悬液分层。

所以要使红细胞与PEG 充分接触，有必要在加完PEG后充分吹打或震荡，或者在加入PEG的同时震荡细胞悬液。

本次实验的观察条件相当不理想，这使区分融合细胞的工作变得有点艰难。

主要原因是显微镜设备陈旧且光源质量不高，很难使用高倍镜看清相互接触的两个细胞到底是发生了融合还是相互叠加。

所以如果条件允许，细胞融合的观察应使用相差显微镜，以求达到最好的观察效果。

参考文献：
[1].Kuroya M, Ishida N, Shiratorit. Newborn virus pneumonitis (type Sendai). II. The isolation of a new virus. Tohoku
J Exp Med [J]
. 58(1):62, Jun, 1953.
[2]. Y Okada, J Bikens. The introduction of cell fusion with non-activity Xitai virus. Nature, (1): 103-110, 1958.
[3]. G. Kohler, C. Milstein. Continuous cultures of fused cells secreting antibody predefined specificity. Nature Vol,
256, Aug, 1975.
[4]. Hollaender A. The method of cell fusion with the electric pulse [M]. New York: Plenum Press, 58-67, 1982.
[5]. J Teissie, VP Knutson, TY Tsong, Electric Pulse-Induced Fusion of 3T3 Cells in Monolayer Culture. Science Vol,
216, Jan, 1982.。