《PCR法支原体检测试剂盒》选购注意事项
支原体污染检测试剂盒(PCR法)
Taq DNA Polymerase 0.5 μL
ddH2O up to 50 μL
（3）．轻轻混匀，2000rpm离心20s；
（4）．进行PCR扩增
PCR扩增条件：
94°C，5min；
94°C，30 sec；55°C，2min；72°C，1 min；32 Cycles；
Taq DNA Polymerase 0.5 μL
ddH2O up to 50 μL
（3）．轻轻混匀，2000rpm离心20s；
（4）．进行PCR扩增
PCR扩增条件：
94°C，5min；
94°C，30 sec；55°C，2min；72°C，1 min；32 Cycles；
2.PCR反应
第一步PCR：
50μL体系PCR反应（如客户需要使用更小量的反应体系，试剂加样量按比例进行减少）：
（1）．使用前每个组份轻轻混匀，然后2000rpm离心20s；
（2）．取灭过菌的0.2mL离心管，在冰上依次加入
10×Taq Buffer 5 μL
72°C，10 min，
第二步PCR：
50μL体系PCR反应（如客户需要使用更小量的反应体系，试剂加样量按比例进行减少）：
（1）．使用前每个组份轻轻混匀，然后2000rpm离心20s；
（2）．取灭过菌的0.2mL离心管，在冰上依次加入
10×Taq Buffer 5 μL
பைடு நூலகம்72°C，10 min，
3.反应结束后，取反应液10μL进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR反应产物。如果此PCR产物需用于以后实验，应将PCR产物冷冻保存。
4.根据感染支原体类型的不同，扩增产物大小有所不同，第一步PCR产物在350～700bp 之间，第二步PCR产物在150～250bp之间。
支原体 PCR 检测试剂盒使用说明书
支原体 PCR 检测试剂盒使用说明书Product Name: Mycoplasma PCR Detection KitIntended Use:The Mycoplasma PCR Detection Kit is intended for the qualitative detection of Mycoplasma spp. in cell cultures and other biological samples by PCR amplification.Kit Components:- PCR amplification reaction mix and enzyme mix- Positive control DNA template- Negative control DNA template- PCR tubes and caps- User manualStorage:The kit should be stored at -20°C. Thaw the kit components at room temperature before use.Sample Preparation:1. Collect the cell culture sample or other biological sample.2. Extract the DNA from the sample using a DNA extraction kit of your choice.3. Dilute the DNA extract as necessary in molecular grade water or buffer to achieve the optimal concentration for PCR amplification (typically between 10-100 ng/µL).PCR Amplification:1. Prepare the PCR reaction mix (in a sterile tube or plate) by adding the PCR amplification reaction mix, enzyme mix, andtemplate DNA to the appropriate volumes as specified in the table below.Component Volume per Reaction (20 µL)PCR amplification reaction mix 10 µLEnzyme mix 1 µLTemplate DNA 1-5 µLMolecular grade water/buffer To 20 µL2. Close the PCR tubes with the caps provided and mix the contents well by vortexing or pipetting.3. Place the tubes in a thermal cycler and perform PCR amplification according to the following conditions:Initial denaturation: 95°C for 5 minutesDenaturation: 95°C for 30 secondsAnnealing: 55°C for 30 secondsExtension: 72°C for 1 minuteFinal extension: 72°C for 5 minutesHold at 4°C4. Analyze the PCR products by gel electrophoresis or other methods as appropriate.Interpretation of Results:- Positive Result: A distinct band is observed in the gel at the expected size for Mycoplasma spp. This indicates the presence of Mycoplasma DNA in the sample.- Negative Result: No band or only faint bands are observed in thegel. This indicates the absence of Mycoplasma DNA in the sample. - Invalid Result: No bands or smear are observed in the gel or the band size is incorrect. Repeat the experiment with fresh controls and follow the instructions carefully.Limitations:1. This assay is designed for research use only and is not intended for diagnostic purposes.2. False negative results may occur due to low level or degraded Mycoplasma DNA in the sample, PCR inhibitors, or other factors.3. The presence of PCR inhibitors in the DNA extraction and amplification process may affect the sensitivity and reproducibility of the assay.4. The kit components must not be used beyond the expiry date.5. The Mycoplasma PCR Detection Kit may only be used by trained personnel.。
支原体试检测剂盒使用说明书(中文版)
支原体检测试剂盒使用说明书1.试剂：支原体检测试剂盒由武汉源深生物科技有限公司提供。
2.实验方法:巢式PCR的方法检测支原体污染：A.待检细胞汇合率在90％以上时取100 µL细胞上清液到离心管内B.95o C孵育5分钟C.短暂高速离心15秒钟左右D.试剂盒里的组份：引物混合物(Primer Mix) 20 µL阳性对照DNA (Positive Control DNA) 15 µL阴性对照(Internal Control DNA) 20 µL巢式PCR一共需要做2轮PCR，本检测方法不受其他来源（如所培养细胞）DNA的影响，不但提高了检测的灵敏度，同时也提高了特异性。
(1)第一轮PCR:PCR 混合物：向0.2 mL PCR薄壁管中依次加入以下组分，盖紧管盖，轻弹管壁混匀，稍加离心。
E.热循环程序：将准备好的PCR管放入PCR仪，运行如下程序。
PCR 混合物：向0.2 mL PCR薄壁管中依次加入以下组分，盖紧管盖，轻弹管壁混匀，稍加离心。
F. 热循环程序：将准备好的PCR 管放入PCR 仪，运行如下程序。
试验结果：2％ 琼脂糖凝胶电泳，TBE 缓冲液，PCR 产物及Marker 均点样10µL ，于50V 下电泳1hr ，EB 染色15min ，紫外灯下观察。
电泳结果见下图：图中泳道M 为DNA Marker ，1和2为待检测细胞系的第一轮PCR 产物 (1st )，3和4为待检测细胞系的第二轮PCR 产物 (2nd ), 其中1、3为阳性对照管PCR 产物，2、4为阴性对照PCR 产物。
阳性对照管在200bp 左右，和300-400 bp 处各有一条带，证明本次实验准确可靠 (不同的支原体Mycoplasma, such as M. fermentans, M. hyorhinis, M. arginini, M. orale, M. hominis, M. arthritidis, M. hyopneumoniae and Acholeplasma laidlawii 的保守区的片段长度不一，大概在200-400 bp 之间)。
如何选择PCR试剂和试剂盒
PCR试剂和试剂盒PCR即聚合酶链式反应，几乎是每个分子生物学实验室的支柱技术。
这种方法简单、易用，可将DNA特定片段扩增几个数量级。
我们针对各种PCR、qPCR和RT-PCR应用提供贯穿整个PCR流程的专用试剂盒。
此外，我们还提供全面的PCR相关资源，包括PCR标准实验方案和PCR预混液计算工具。
热启动PCR热启动PCR技术可在反应构建过程中抑制热启动Taq聚合酶活性或修饰dNTP聚合，直至热激活步骤启动。
热启动PCR允许室温构建反应，不会出现非特异性扩增和引物二聚体形成。
浏览我们丰富的热启动PCR酶选择，包括KOD、FastStart™、JumpStart™和AptaTaq。
更多有关热启动PCR、产品和实验方案的信息，请访问默克sigma-aldrich ®的PCR选择指南，并根据您的研究需要选择对应的产品。
罗氏PCR、QPCR、RT-PCR和RT-QPCR试剂、实验方案和资源为推动分子生物学研究进展，必须最大限度提高基因组学、蛋白质组学和细胞分析等多个领域的工作流程效率。
作为基因组学和PCR技术的开创者，罗氏提供经反复优化的齐全试剂和试剂盒产品，减少实验室实操时间、加快数据采集和关键工具开发，可针对最复杂的生物学假设开展检验。
我们秉持共同的产品质量追求和科学卓越理念与罗氏建立合作关系——可应您的研究所需，全程提供罗氏产品解决方案。
访问罗氏产品和分子学解决方案资源页面，浏览所有罗氏PCR相关试剂盒和实验方案。
定量PCR(QPCR)试剂定量PCR(qPCR)利用DNA扩增的线性原理，测定样品中已知序列的绝对或相对量。
此类反应使用荧光报告基团，可以实时测定DNA产量。
qPCR会监测每个PCR循环中的DNA扩增。
当DNA处于对数线性扩增阶段时，荧光量相对于背景增加。
荧光积累至可测的那一点称为阈值循环(CT)或交叉点。
通过使用已知量的标准DNA的多次稀释，可以产生对比CT的对数浓度的标准曲线。
支原体检测说明书
SaveIt系列产品——支原体检测试剂盒说明书一、产品简介支原体（mycoplasma）：又称霉形体，为目前发现的最小的最简单的原核生物。
支原体的侵染会引起细胞功能和基因表达的严重改变，并造成持续危害。
由于支原体污染会严重影响实验结果的可靠性、重复性和一致性，对支原体的常规检测非常重要。
针对细胞、培养基以及动物血清的支原体检测，我们推出了Myco-PCR-TEST快速支原体检测试剂盒。
本试剂盒基于PCR检测原理，根据支原体高度保守的16和23SrRNA区域设计的特异性引物，经过简单快速的PCR，从而迅速准确判断支原体污染是否被清除。
汉恒生物（）推出的SaveIt TM抗支原体试剂能够在不影响细胞状态的前提下能够有效的清除支原体污染，从而使一些珍贵的细胞受到支原体污染之后能够得到挽救。
二、产品包装产品规格见标签三、使用说明使用Trizol 法抽提待检测细胞的RNA，反转录为CDNA 后，加入支原体检测引物，进行PCR 检测细胞支原体污染情况。
四、操作步骤4.1样品处理1、A：培养贴壁细胞：不须胰酶消化，可直接用Trizol进行消化、裂解，Trizol体积按10cm2/ml 比例加入。
B：悬浮细胞可直接收集、裂解，每1ml Trizol可裂解5×106动物、植物或酵母细胞，或107细菌细胞。
2、细胞加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。
注：此时可放入-70℃长期保持。
3、12,000rpm 离心5min，弃沉淀。
4、按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。
注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。
5、4℃ 12,000g离心15min。
6、吸取上层水相，至另一离心管中。
注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。
7、按0.5ml 异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇混匀，室温放置5-10min 。
检测中心荧光定量PCR检测试剂盒验收细则
检测中心荧光定量PCR检测试剂盒验收细则
一、科学选材
1.测序级合成核苷酸：合成产品应经全长光谱比色检测，确认无肽键
断和错义残基；
2.反应相关试剂：应经分子生物学检测，确认无污染情况；
3.其他活性物质：无反应性活性物质，可保证活性物质以及荧光活性
物质的稳定性；
4.荧光活性物质：其荧光活性物质的滴度必须稳定，没有偏离正常谱
线的情况；
5.合成核苷酸扩增片段：应确保试剂盒所使用的合成核苷酸扩增片段
的序列准确性及效率；
6.唯一性：检测试剂中所用活性物质的唯一性，比如它的荧光量子产
量在一些符合的范围内，可保证检测试剂的性能稳定，可以准确检测出检
测物质；
二、检测实验
1.合成核苷酸的检测：应在实验所用的检测试剂中检测它的质量，通
过GC/MS、全长光谱比色法，检测出来的结果要符合产品质量要求；
2.反应相关试剂的检测：通过分子生物学检测，检测每种试剂的活性，并定量测定；
3.荧光活性物质的检测：确保各种荧光活性物质的谱线分布正常，以
及它们的滴度稳定，没有异常偏移的情况；
4.核苷酸扩增片段的检测：通过质控检测，确保序列的准确性和扩增片段的效率；。
PCR试剂盒的选用和质检
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逆转录酶、DNA聚合酶
酶的浓度 酶的活性
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核酸扩增方法
PCR RT－PCR 转录依赖的扩增（TMA） 连接酶链反应（LCR） 链替代扩增（SDA）等
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影响PCR试剂盒质量的因素： 核酸提取
核酸提取的有效性 核酸提取的简便性
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影响PCR试剂盒质量的因素： 产物检测
杂交固相 特异探针及其标记物
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影响PCR试剂盒质量的因素
内在因素: 原材料、核酸提取方法、方法 学设计
外在因素：试剂盒的运输和贮存外在因 素：试剂盒的运输和贮存
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试剂盒的运输和贮存
PCR试剂盒的有效期一般为6个月，这是 指在适当的贮存温度下。核酸扩增部分 的试剂一般要贮存于-20℃下；产物检测 部分试剂则贮存于2～8℃。
质检内容：测定的重复性 测定范围 抗干扰能力
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技术验收 依据：
《临床检验扩增检验实验室管理暂行办 法》 卫医发[2002]10号
《临床基因扩增检验实验室工作规范》
卫检字2002第8号
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技术验收内容
实验室设置和设备 设施和环境 人员 设备管理 检测方法 标本管理 记录 报告 质量控制 抱怨
•
设备和质控物（2）
每一台设备的档案内容包括： （a） 设备名称；（b）制造商名称、型号、序 号等；（c）接收日期和启用日期；（d ）目前放置地点；（e）接收时的状态； （f）仪器使用说明书有复印件；（g） 校准和/或检定的日期和结果及下次校准 和/或检定的日期；（h）迄今所进行的 维护和今后维护计划的细节；（i）损坏 、故障、改装或修理的历史。
肺炎支原体检测试剂盒
肺炎支原体检测试剂盒简介肺炎支原体是一种常见的革兰阴性细菌，是引起人类呼吸道感染的重要病因。
肺炎支原体感染可导致轻度到中度的上呼吸道感染、肺炎、气管支气管炎等疾病。
为了准确检测和诊断肺炎支原体感染，科学家们开发了肺炎支原体检测试剂盒，以便在临床诊断中使用。
检测试剂盒原理肺炎支原体检测试剂盒是一种基于分子生物学原理的检测工具。
它利用核酸扩增技术，特别是聚合酶链反应（PCR），可以从临床标本中扩增并检测肺炎支原体的核酸。
该检测试剂盒通常包含肺炎支原体特异性的引物和探针，并且还可能包含一些辅助试剂和储存缓冲液等。
在使用肺炎支原体检测试剂盒时，首先需要采集患者的呼吸道标本，如咽喉拭子、痰液等。
然后，将标本中的核酸提取出来，并与检测试剂盒中的引物和探针混合。
通过PCR反应，将肺炎支原体的核酸扩增成千倍。
如果在标本中存在肺炎支原体的核酸，那么PCR反应将在一定的温度条件下产生阳性信号，表明该患者可能感染了肺炎支原体。
检测结果解读肺炎支原体检测试剂盒可以提供两种结果：阳性和阴性。
阳性结果表示在患者的标本中检测到肺炎支原体的核酸，说明患者可能感染了肺炎支原体。
阴性结果则表示未检测到肺炎支原体的核酸，表明患者可能没有感染肺炎支原体。
请注意，肺炎支原体检测试剂盒并不能完全排除肺炎支原体感染的可能性。
在某些情况下，可能由于标本采集、核酸提取等环节的技术原因，导致结果的假阴性或假阳性。
因此，在进行结果解读时，仍需结合临床症状和其他检查结果进行综合分析。
应用领域肺炎支原体检测试剂盒主要应用于临床肺炎的诊断和流行病学调查。
通过及时检测和诊断肺炎支原体感染，可以采取有效的治疗措施，避免疾病的进一步发展和传播。
此外，肺炎支原体检测试剂盒还可用于研究肺炎支原体的流行病学特征，为疫情监测和预防控制提供重要依据。
注意事项使用肺炎支原体检测试剂盒时需要遵循以下注意事项：1.仅供专业人员使用：肺炎支原体检测试剂盒是一种专业的医疗设备，仅应由经过培训和具备相关专业知识的人员操作和解读结果。
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《PCR法支原体检测试剂盒》选购注意事项
（2016年10月16日）
目前，PCR法支原体检测仍然是支原体快速检测领域被客户选购最多的方法。
目前，商业化的PCR法支原体检测方法就有好几种，各优缺点分述如下：
●方法（1）：不带内参基因的普通PCR法支原体检测试剂盒。
该试剂盒含
有2条引物，不带内参基因。
通过30-35轮的普通PCR直接检测。
需要通过琼脂糖电泳分析检测结果，整个检测过程耗时3-4小时。
缺点：无法区分真阴性样品和由于细胞代谢产物抑制导致的假阴性样品（二者，支原体特异条带均为阴性）。
●方法（2）：带内参基因的普通PCR法支原体检测试剂盒。
该试剂盒含有
2条引物，带内参基因。
通过30-35轮的普通PCR直接检测。
需要通过琼脂糖电泳分析检测结果，整个检测过程耗时3-4小时。
优点：可以区分真阴性样品（内参条带为阳性而支原体特异条带为阴性）和由于细胞代谢产物抑制导致的假阴性样品（内参条带和支原体特异条带均为阴性）。
●方法（3）：巢式PCR法支原体检测试剂盒。
该试剂盒含有4条引物，一
般不带内参基因。
第一轮，用2条外引物通过30轮的PCR扩增后；第二轮，取少量第一轮的扩增产物作为模板，用2条内引物再进行30轮的PCR 扩增。
需要通过琼脂糖电泳分析检测结果，整个检测过程耗时6-8小时。
缺点：耗时太久，容易产生假阳性。
●方法（4）：定量PCR法支原体检测试剂盒。
该试剂盒含有2条引物，不
带内参基因。
通过40轮的定量PCR检测。
无需通过琼脂糖电泳分析检测结果，整个检测过程耗时2-3小时。
缺点：无法区分真阴性样品和由于细胞代谢产物抑制导致的假阴性样品（二者，均显示为没有扩增）。
由于PCR法支原体检测过程中，PCR的扩增可能会被细胞的代谢产物抑制的问题，是该方法的致命弱点。
Sigma公司的LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit（货号MP0035）的PCR法支原体检测试剂盒说明书中也特别提到了这点，说明这是一个PCR法支原体检测中经常遇到的问题，其强烈建议用试剂盒进行DNA提取后再进行鉴定。
上述4种PCR支原体检测方法中，只有方法（2）可以区分真阴性样品（内参条带为阳性而支原体特异条带为阴性）和由于细胞代谢产物抑制导致的假阴性样品（内参条带和支原体特异条带均为阴性）。
所以，大家选购各公司的PCR法支原体检测试剂盒时，尽量选取含内参基因的上述方法（2）类的支原体检测试剂盒，比如上海易色的《PCR法支原体检测试剂盒》（货号：PM008）和Sigma公司的LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit（货号：MP0035）。