免疫组化及特殊染色
免疫组化染色和特殊染色对显示幽门螺杆菌的检验分析
·影像学及诊断检验·医学食疗与健康 2021年7月第19卷第14期151免疫组化染色和特殊染色对显示幽门螺杆菌的检验分析邓士杰 喻朝霞△（安徽医科大学附属安庆市第一人民医院，安徽 安庆 246000）【摘要】目的：探讨分析免疫组化染色和特殊染色对显示幽门螺杆菌的检验情况。
方法：2018年1月至2021年1月收集本院60例幽门螺杆菌感染患者，所有患者均取病理活检，对组织进行免疫组化染色和特殊染色，分析两种方法的幽门螺杆菌阳性率、灵敏度和特异性。
结果：相比特殊染色，免疫组化染色幽门螺杆菌阳性率高（P ＜0.05），灵敏度和特异性高（P ＜0.05）。
结论：相比特殊染色，免疫组化染色显示幽门螺杆菌的检验的效果更佳，阳性率高，漏诊率低，灵敏度和特异性高，具有临床价值。
【关键词】特殊染色；免疫组化染色；幽门螺杆菌；灵敏度；特异性【中图分类号】R446.【文献标识码】A.【文章编号】2096-5249（2021）14-0151-02作者简介：邓士杰(1987.08-)，男，研究生，主管技师，研究方向为特殊染色在幽门螺旋杆菌检测应用△通讯作者：喻朝霞(1968.06-)，女，本科，主任医师，研究方向为妇科肿瘤的诊断与研究，邮箱**************幽门螺杆菌（HP ）是一种生长条件严格的螺旋状微厌氧菌。
1983年首次从慢性活动性胃炎患者的胃黏膜活检中分离出来，是唯一能在人胃中存活的微生物种类[1]。
在世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单中，幽门螺杆菌被列入Ⅰ类致癌物清单[2]。
研究指出，幽门螺杆菌生活在人体胃的幽门部分，是最常见的细菌病原体之一，5岁以下的感染率高达50%[3]。
这种细菌感染首先引起慢性胃炎，进而导致胃溃疡和胃萎缩。
在严重的情况下，它会发展成胃癌。
据统计，首先感染幽门螺杆菌的人群，萎缩性胃炎和胃癌的发病率较高[4]。
幽门螺杆菌感染与胃癌的死亡率是平行的。
幽门螺杆菌寄生于胃黏膜，67%~80%的胃溃疡和95%的十二指肠溃疡是由幽门螺杆菌引起的[5]。
特殊染色联合免疫组化技术在肿瘤病理诊断中的应用
特殊染色联合免疫组化技术在肿瘤病理诊断中的应用摘要:目的:本临床研究主要是讨论特殊染色联合免疫组化技术在肿瘤病理诊断中的功效。
方法：选择2020年1月至2020年6月在我院肿瘤科接受治疗的76例肿瘤病人做为此次临床研究的观察目标。
依据不一样的诊治方式，将76例病人随机分成实验组和对照组。
对照组病人选用免疫组化技术完成诊断，实验组病人选用特殊染色联合免疫组化技术完成诊断。
比较为2组肿瘤的阳性诊断率。
结果：特殊染色联合免疫组化技术诊断：呈阳性35例，呈阴性3例，检出率为92.1%。
实验组92.1%的呈阳性诊断率显著高过对照组的65.5%。
两组结论差别明显，具备明显统计学意义(p＜0.01)。
结论：结果显示，特殊染色与免疫组化技术对肿瘤的病理诊断有良好的实际效果，可做为肿瘤疾病诊断的根据，对疾病诊断有较准确的指导作用。
关键词:特殊染色;肿瘤病理诊断;联合免疫组化技术伴随着我们生活水平的不断提升，尤其是近些年，人们的人均寿命不断地增加，但是社会负担也在持续提升，这促使肿瘤的患病率也呈上涨的发展趋势。
由于肿瘤患者早期症状不明显，多数患者确诊时疾病已经进入中晚期，因而，造成肿瘤的最佳医治时间点延长，使很多肿瘤病人只能通过长期化疗、放疗等方式控制病情[1]。
很多研究表明，病理诊断是临床医学专业肿瘤诊断中最经常使用的诊断方式，因为创伤性诊断方式，病人的诊断配合度较低。
而常规的磁共振、CT 等诊断方法中又存在误诊率高的不足。
因此，对更准确、更简单的诊断方法进行研究是临床研究的重点。
与这二种方式不一样，特殊染色联合免疫组化技术是诊断率高的诊断技术，在世界各地取得了广泛应用。
世界各地的很多研究表明，特殊染色联合免疫组化技术对肿瘤有很高的诊断意义。
因而，本分析关键搜集我院肿瘤科2020年1月至2020年6月的76例肿瘤患者做为此次临床研究的研究目标，重点讨论特殊染色联合免疫组化技术在肿瘤病理学诊断中的实际效果。
科学研究如下所示。
免疫组化染色技术
[分享] 免疫组织化学染色技术法医学院官大威第一节常规组织学染色技术概述宏观微观超微结构基因水平组织形态学研究技术的种类：一、病理大体组织标本的染色方法在标本制作中，为了某种特殊目的，突出显示标本的重要部分，借助组织切片的特殊染色方法对标本进行染色，将病变器官及不同组织成分用染料染成不同的颜色，以便于区分大体标本的不同成分和病变特点，如：目的：主要用于心、肝、肾脂肪变性，动脉粥样硬化大体标本的染色试剂：苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ结果：病变处脂肪组织呈橙黄色目的：显示早期心肌梗死的区域试剂：0.1% NBT(硝基四唑蓝) / 0.2 mol / L PBS(pH 7.6)方法：将2-3 mm 厚新鲜心肌大片放入试剂中，37 °C 孵育20 min。
结果：正常心肌呈蓝色，早期心肌梗死区、纤维结缔组织、瘢痕组织呈浅蓝色或不显色。
注意：新鲜标本，尸检心肌不超过6小时。
二、光学显微镜下的组织学染色方法.常规HE染色（hematoxylin and eosin staining）.组织学特殊染色1. Mallory 三染色、Masson三染色2. 神经纤维的镀银染色3. 其他的特殊染色，包括钙、铁、铅、铜、黑色素和脂褐素、细胞DNA和RNA的染色等上述的各种染色方法只能在细胞水平上显示组织结构的形态改变。
三、超微结构的观察.光线波长的限制，光学显微镜的分辨率极限为0.2μm有效放大倍数最高不超过2000倍。
电镜的分辨率最佳可达0.14nm，放大倍率最高可达100万倍。
第二节免疫组织化学染色技术Immunohistochemical technique由于该技术主要是用于研究和观察细胞中的某些结构或分子物质和组织细胞间的成分，因此现又称为免疫细胞化学技术。
根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为：1. 免疫荧光细胞化学技术2. 免疫酶细胞化学技术3. 免疫铁蛋白技术4. 免疫金-银细胞化学技术5. 免疫电子显微镜技术一、免疫组织化学染色方法的原理.抗原（antigen）1. 定义：是一类在适合条件下能激发机体免疫系统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物质（抗体和效应细胞）在体内或体外发生特异性结合反应的物质。
特殊染色名词解释
特殊染色名词解释随着科技的不断进步，染色技术也在不断地发展和创新。
特殊染色技术是一种高级的染色技术，可以为细胞、组织和生物分子等提供非常详细的信息。
在这篇文章中，我们将介绍几种常见的特殊染色技术和它们的应用。
1. 免疫组化染色免疫组化染色是一种利用抗体与特定抗原结合的染色技术。
这种技术可以用来检测细胞和组织中的特定蛋白质，从而帮助诊断和治疗疾病。
免疫组化染色可以用来检测癌细胞、细菌、病毒等，因此在肿瘤学、微生物学和免疫学等领域有广泛的应用。
2. 原位杂交染色原位杂交染色是一种用来检测DNA或RNA序列的染色技术。
这种技术可以用来检测基因突变、染色体重排和基因表达等。
原位杂交染色可以用来诊断遗传性疾病、肿瘤和病毒感染等，因此在医学和生物学领域有重要的应用。
3. 荧光染色荧光染色是一种利用荧光染料与细胞或分子结合的染色技术。
这种技术可以用来检测细胞和分子的位置、数量和活性等。
荧光染色可以用来检测细胞分裂、DNA复制、蛋白质交互作用等，因此在生物学和医学领域有广泛的应用。
4. 电镜染色电镜染色是一种利用染料和金属膜结合的染色技术。
这种技术可以用来增强电镜图像的对比度和清晰度。
电镜染色可以用来检测细胞内部结构、病毒和细菌等，因此在微生物学和细胞生物学等领域有广泛的应用。
5. 石蜡切片染色石蜡切片染色是一种利用染料和石蜡组织切片结合的染色技术。
这种技术可以用来检测组织和细胞的结构、形态和病理变化等。
石蜡切片染色可以用来诊断肿瘤、炎症和感染等，因此在病理学和生物学领域有广泛的应用。
总结特殊染色技术是一种高级的染色技术，可以为细胞、组织和生物分子等提供非常详细的信息。
免疫组化染色、原位杂交染色、荧光染色、电镜染色和石蜡切片染色是几种常见的特殊染色技术，它们在医学和生物学领域有广泛的应用。
特殊染色技术的不断发展和创新将为人类的健康和生命科学研究带来更多的帮助和突破。
医院病理科免疫组化及特殊染色工作制度
病理科免疫组化及特殊染色工作制度
1.免疫组化和特殊染色已经成为现代病理学中不可或缺的重要工具，准确的免疫组化和特殊染色可极大地帮助病理诊断，或提供准确的分子治疗靶标；而不准确的免疫组化和特殊染色反而产生误导，造成误诊。
因此必须对影响免疫组化和特殊染色的各个环节进行严格的质控，对技术人员和病理医师进行培训，保证准确的染色结果和正确的结果判读。
2.免疫组和特殊化染色是特殊的技术，相关操作人员必须经过专门的培训；每一批次的免疫组化和特殊染色必须设阳性和阴性对照，可利用组织中的内对照；
3.必须建立本实验室每种免疫组化和特殊染色的操作规程，并根据染色效果及时更新；
4.更换抗体或试剂后，需要用阳性和阴性组织对新试剂进行有效性验证，并有相应的文字记录和染色切片档案，相
关档案保留2年；
5.免疫组化和特殊染色过程中产生的有毒液体应专门回收，严禁随处倾倒；病理医师必须熟悉各种抗体染色结果和特殊染色结果，阳性信号表达部位、其诊断应用范围，以期做到正确的结果判读；
6.免疫组化和特殊染色结果不能作为最终诊断，必须由病理医师结合形态学综合判断，并将染色结果写到病理报告中。
7.按免疫组化和特殊染色工作单要求，及时制片，一般要在1～2日出结果。
实验室的各种仪器设备，由专人保管和使用，未经保管人允许或主任批准禁止他人使用，精密贵重仪器由专人负责，操作按程序，不得违章操作。
8.认真做好本实验室文字资料的记录、登记工作，加强各种资料的保管，防止资料丢失。
统计报表及时。
免疫组化及特殊染色
根据组织中蛋白质的降解程度 ，通过免疫组化染色可以推断 死亡时间，有助于法医学中的 死亡时间推断。
05
技术发展与展望
免疫组化技术的发展趋势
自动化与智能化
01
随着科技的进步，免疫组化技术正朝着自动化和智能化的方向
发展，以提高检测的准确性和效率。
多指标并行检测
02
通过多指标并行检测，能够更全面地揭示疾病的发生、发展机
80%
疾病预测
对特定蛋白的免疫组化染色可以 预测疾病的发病风险和进展趋势 ，有助于疾病的早期预防和治疗 。
法医学鉴定中的应用
死亡原因鉴定
通过免疫组化染色，可以检测 死者体内相关蛋白的表达水平 ，有助于推断死亡原因和死因 调查。
致伤工具推断
通过检测创口组织中特定蛋白 的表达，可以推断致伤工具的 类型和作用方式，为法医学鉴 定提供依据。
03
免疫组化与特殊染色的比较
技术特点比较
免疫组化
利用抗原-抗体反应原理，通过标记抗 体对组织或细胞内的抗原进行定位和 定性分析。具有高特异性和高敏感性。
特殊染色
利用不同化学染料对组织或细胞的不 同成分进行染色，以便观察组织或细 胞的形态和结构。具有简单易行、成 本低廉等优点。
应用范围比较
免疫组化
主要用于肿瘤诊断、鉴别诊断、预后评估等方面，也可用于某些感染性疾病、自身免疫性疾病等的诊 断。
特殊染色
广泛应用于病理学、组织学等领域，如观察细胞形态、鉴别细胞类型、检测组织内化学成分等。
优缺点比较
免疫组化
优点在于高特异性和敏感性，能够准确定位和定性分析组织或细胞内的抗原。缺点是操作复杂、成本较高，需要 专业技术人员操作。
药物研发与疗效评估
免疫组化诊断不仅仅是棕色显色
免疫组化诊断不仅仅是棕色显色——沈勤根据2016年福州会议陈国璋教授讲稿编译，未经授权，不得转载。
一、免疫组化显色的解释1.阳性或者阴性均有重要意义。
2.染色定位对于评判真假阳性同样重要；有些抗体/蛋白（如P120 catenin，β-catenin）着色部位改变提示特定的病理意义。
二、免疫组化染色模式可提供额外线索一些免疫染色，着色的特定分布可为诊断提供额外的线索和标准，如：胞浆含量、细胞形态、阳性细胞分布或排列方式、阳性细胞比率、阳性着色强度。
三、Cytokeratin1.显示肿瘤细胞内胞浆物质含量小细胞癌胞浆稀少，免疫染色呈特殊改变，棕色着色纤细、不完整环绕核周或仅位于核旁点状，而非小细胞癌因胞浆丰富则着色宽阔、并完整环绕胞核。
尽管小细胞癌还可表达Syn，但不总是表达。
因此Cytokeratin染色含量可助区分小细胞癌和非小细胞癌。
2.粘膜部位病变，观察Cytokeratin显色的分布和模式可助识别微小癌灶鼻咽部粘膜活检，粘膜下Cytokeratin着色的细胞分布紊乱、失去正常组织结构，再仔细观察细胞形态，更确认为癌。
胃粘膜活检，固有层内细胞弥漫生长、失去正常腺体结构，需要鉴别印戒细胞癌和组织细胞，若pan-Cytokeratin表达呈印戒细胞样或条索状，则诊断为印戒细胞癌。
四、CK201.尿路上皮CK20表达增多/异常分布，提示异型增生和原位癌。
2.正常尿路上皮均浅表覆盖的伞细胞表达CK20；若基底层或上皮全层均着色，提示异型增生或原位癌。
五、p161.p16染色真阳性的界定包括阳性细胞的分布和方式。
2.与肛门生殖器部位感染HPV有关；不同部位癌的HPV 感染率不同，宫颈癌（～100%），肛管（70-100%），阴道癌（60%），外阴癌（50%），阴茎癌（35%）。
3.p16是周期依赖激酶抑制因子，免疫着色定位于胞核+/-胞浆。
在适当的背景下，p16阳性说明肿瘤内高危型HPV 转录活性强。
免疫组化 HE染色 FISH ISH
HE染色
苏木精 — 伊红染色法 ( hematoxylin-eosin staining ，HE)是石蜡 切片技术里常用的染色法之一 。HE染色法是组织学、胚胎学、病理 学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法。 HE染色的原理：脱氧核糖核酸（DNA）两条链上的磷酸基向外，带 负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键结合 而被染色。伊红是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷 的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使胞浆染成红色或粉 红色，与蓝色的细胞核形成鲜明对比。
• 3、5-10% 正常山羊血清封闭，室温孵育10-30min。倾去血清，勿洗。 • 4、滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1-2小时或4℃
过夜。 • 5、PBS冲洗，5min×3次。 • 6、滴加适当比例稀释的生物素标记二抗，37℃孵育10-30min；或滴
加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10-20min。 • 7、PBS冲洗，5min×3次。 • 8、滴加SABC-FITC,37℃孵育10-30min，PBS冲洗5min×3次。 • 9、抗荧光萃灭封片液 封片，荧光显微镜观察。
4、组织的固定：4%多聚甲醛固定一般1-2小时。固定后经充分的流水冲 洗后进行脱水包埋。
5、组织脱水：主要用不同梯度的酒精进行脱水。一般情况下，组织经过 70％，80％，90％，95％，以至无水酒精的脱水程序，即可达到脱 水的要求。但是为了能使大量的组织块同时进行脱水，则要求保持液 体的浓度以保证脱水的作用，最好是以两次95％酒精，两次100％酒 精重复进行脱水，以保证组织的水分脱净。
免疫组化切片组织前期处理
1、组织块大小应限于2cm×1.5cm×0.2cm 。 2、应用于光镜的免疫组织化学染色的切片厚度一般要求5μm左右，神经
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免疫组化及特殊染色
IHC方法
3 最新一代的免疫组化 Novolink Polymer法： 使用小分子聚合物（减少细胞薄膜硬脂的阻碍 ，比传统中的大分子聚合物染色更显著），信 号放大更强，还可以检测到组织中低浓度的抗 原。
免疫组化及特殊染色
IHC技术的基本操作流程
化 物
物 酶
酶
后
玻片干燥造成的“边缘效应”
免疫组化及特殊染色
石
冰
蜡
冻
切
切
片
片
假阴性：注意内对照
酒
福
精
尔
固
马
定
林
固
定
结肠，CEA 气 泡 影 响 抗 体 抗 体 反 应
胰腺，in
免疫组化及特殊染色 平滑肌肉瘤，SMA
假
蛋
阴
白 酶
性
未 处
理
蛋 白 酶 处 理 后
皮肤，IV胶原
微
微
波
波
未
处
处
70 、80年代多位科学家改良上述技术， 建立辣根过氧化物酶--抗过氧化物酶 （PAP）技术,抗生物素—生物素（ABC） 法使免疫组织化学进入了应用阶段。
免疫组化及特殊染色
2000年以后各种免疫组化技术更加成熟, 使免疫组化技术成为当今生物医学中形 态、功能代谢综合研究的一项有力工具。 其应用范围深达医学各个学科，是目前 生命科学工作者应该掌握的基本技术之 一。
DAB显色，蒸馏水中止反应
苏木素复染及封片
免疫组化及特殊染色
切片
烤片
脱蜡水化
H2O2处理
热修复
二抗 Enlivision试剂
DAB显色免疫组化及特殊染色
一抗 苏木素复染
IHC染色结果的判读原则
免疫组化及特殊染色
I. 注意影响IHC结果判读的因素
未
阻
阻
止
止
内
内
源
假
源 性
性 过
阳
过 氧
氧 化
性
EnliVision法的工作程序：
切片，烤片，脱蜡水化（使用防脱片处理的玻片：多聚赖氨酸， APES）
H2O2处理（—阻断内源性过氧化物酶），蒸馏水漂洗 组织切片的预处理（枸橼酸钠缓冲液中热修复，酶消化—暴露出
抗原决定簇），TBS漂洗
内源性过氧化物酶的阻断
一抗孵育，TBS漂洗
二抗孵育，TBS漂洗
同种异体抗原 动物免疫血清
免疫组化及特殊染色
抗体（antibody）指机体的免疫系统在 抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增 殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应 抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
免疫组化及特殊染色
世界著名抗体公司
Santa公司、Abcam公司、 Abgent公司、Proteintech Group、
将试剂抗原或试剂抗体用可以微量检测的标记物进行标记， 在与标本中的相应抗体或抗原反应后，可以不必测定抗原抗体 复合物本身，而测定复合物中的标记物，通过标记物的放大作 用，进一步提高了免疫技术的敏感性。
免疫组化及特殊染色
抗原是指能够刺激机体产生（特异性） 免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和 致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫 效应（特异性反应）的物质。抗原的基 本特性有两种，一是诱导免疫应答的能 力，也就是免疫原性，二是与免疫应答 的产物发生反应，也就是抗原性
免疫组化及特殊染色
荧光素、酶
标 记
抗体
组织抗原 抗体 酶 荧光素
抗原
荧 光
阳性色彩
显微镜观察
免疫组化及特殊染色
三大系统 本技术是应用免疫学原理 来识别待测抗原，再通过酶和底物 的作用外加显色剂，将上述反应显 示出来。
免疫组化及特殊染色
免疫组 织化学
识别系统 联结系统
显示系统
免疫组化及特殊染色
识别系统是指特异性抗体识别组织 或细胞中的靶抗原。抗原抗体的特 异性结合是本技术的基本依据。
免疫组化及特殊染色
与人类有关的抗原
病原微生物 在医疗中将病原微生物制成疫苗进行 预防接种，可以提高人的免疫力。
嗜异性抗原 一类与种属特异性无关的、存在于人 以及某些动物、植物、微生物的性质相同的抗原。
肿瘤抗原 由物理的、化学的因素或某些病毒诱发 的实验动物肿瘤，其细胞中或细胞表面均出现特异性 抗原，称为肿瘤特异性抗原。已证实在某些人类肿瘤 中心存在着与病毒密切相关的抗原。
理
理
后
甲状旁腺，PTH
免疫组化及特殊染色
II. 染色的特异性判定
免疫组化及特殊染色
免疫组化及特殊染色
免疫组化及特殊染色
IHC方法
1 过去用过的方法——ABC法，SP法。——三步 法，使用生物素
2 目前最常用的方法——二步法： EnliVision 显色系统（即用型非生物素免疫组化 EnliVisionTM plus检测试剂盒 ）
将多个抗鼠和抗兔的IgG分子二抗与辣根过氧 化物酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个大 分子多聚体（polymer），直接放大信号40-50 倍。
免疫组化及特殊染色
联结系统由联结抗体构成。它的作 用是联接识别系统和显示系统。
免疫组化及特殊染色
显示系统的目的是使抗原抗体间的 特异性结合变为肉眼可见。因此显 示系统由标记酶，底物和显色剂组 成，以在靶抗原存在位点上形成有 色沉淀。
免疫组化及特殊染色
特点： 特异性强 灵敏度高 定位准确和简便快速等优点 又能够将形态、功能及代谢的研 究有机结合起来。
免疫组织化学技术 Immunohistochemistry
techniques
免疫组化及特殊染色
第一节 免疫组织化学 技术概述
免疫组化及特殊染色
（一）发展简史
1941年Coons首先用荧光素标记抗体检测 肺组织内的肺炎双球菌获得成功。
60年代Nakane建立酶标抗体技术运用铁 蛋白标记Ab技术
Cell Signaling Technology（CST）、 罗氏公司（Roche）
免疫组化及特殊染色
标记物
它借助于荧光素、酶等标记抗体 与组织切片或细胞涂片中相关抗原相 结合，由于荧光素所发荧光可用荧光 显微镜检出，而酶可经一定的显色处 理，呈现醒目的阳性色彩，从而可准 确定位欲测定的抗原物质。
免疫组化及特殊染色
（二）免疫组织化学的原理
定义:是应用免疫学基本原理—抗原抗体反应，即抗原与抗体 特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光 素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原（多 肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫 组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技 术(immunocytochemistry)。