米曲霉GX0011_果糖基转移酶的分离纯化_覃益民

第21卷第4期高校化学工程学报No.4 V ol.21 2007 年 8 月 Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities Aug. 2007文章编号：1003-9015(2007)04-0710-05米曲霉GX0011 β-果糖基转移酶的分离纯化覃益民1, 苏加坤1, 唐江涛1, 王机1, 姚评佳2, 魏远安2(1. 广西大学化学化工学院, 广西南宁 530004;2. 广西大学生命科学与技术学院广西南宁 530005)摘要：通过热变性、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sephadex A-50(柱1)、Octyl-Sepharose CL-4B、Sephacryl S-300、DEAE-Sephadex A-50(柱2)层析等分离纯化步骤对本实验室自行筛选诱变的米曲霉GX0011来源的β-果糖基转移酶进行了分离纯化，并通过SDS-PAGE检测了该酶的纯度和亚基分子量。

结果表明电泳一条带，亚基表观分子量为5.1×104，小于多数文献报道的结果。

纯化倍数为121.7，比活和活力回收分别为1975U⋅mg−1和17％。

酶活测定表明该酶只起到转果糖基的作用而无水解活性。

关键词：低聚果糖；米曲霉；β -果糖基转移酶；分离纯化中图分类号：Q814.1 文献标识码：ASeparation and Purification of β-fructosyltransferase from Aspergillus oryzae GX0011QIN Yi-min1, SU Jia-kun1, TANG Jiang-tao1, WANG Ji1, YAO Ping-jia2, WEI Yuan-an2(1. School of Chemistry and Chemical Engineering , Guangxi University, Nanning 530004, China;2. College of Life Science &Technology, Guangxi University, Nanning 530005, China)Abstract: The β-fructosyltransferase was separated and purified from the Aspergillus oryzae GX0011 which was mutated and screened in the lab by using a successive procedure including heat-denaturing, ammonium sulphate precipitation, column chromatography separation by DEAE-Sephadex A50 (column 1), Octyl-Sepharose CL-4B, Sephacryl S-300 and DEAE- Sephadex A50 (column 2), respectively. The purified enzyme was confirmed to be homogeneous by SDS-PAGE and its molecular weight was estimated to be 5.1×104, which is smaller than that reported in literature. The final purified fold, specific activity and the yield of the purified enzyme are 121.7, 1975 U⋅mg−1 and 17％, respectively. The obtained β-fructosyltransferase exhibits the catalytic activity of fructosyl transfer only and does not show any hydrolytic activity.Key words: fructooligosaccharides; Aspergillus oryzae; β-fructosyltransferase; separation and purification1 引言低聚果糖(Fructooligosaccharides，FOS)因其具有高效增殖双歧杆菌、排毒洁肠、提高人体免疫力和改善脂质代谢(降血脂及胆固醇)等优异性能，逐渐受到消费者的青睐[1~3]。

天然植物存在和从微生物酶法得到的低聚果糖几乎都是直链状，是在蔗糖(GF)分子上以β-1,2糖苷键与1~3个果糖基结合而成蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的混合物，属于果糖和葡萄糖构成的直链杂低聚糖。

合成FOS的酶系有两种来源：一是来自植物[4,5]，二是来自微生物[6,7]，而工业生产主要用微生物的酶源[8~10]。

当以蔗糖为原料采用酶法生产低聚果糖时，除得到低聚果糖，还有少量的果糖产生，有学者[11]认为这是由于起催化作用的β-果糖基转移酶(β-fructosyltransferase, EC 2.4.1.9，FTS)是双功能酶，不仅有催化收稿日期：2006-07-22；修订日期：2006-11-10。

基金项目：国家自然科学基金资助项目(29772096)；广西高校博士点建设资金资助。

作者简介：覃益民(1962-)，男，广西平南人，广西大学副教授，在读博士生。

通讯联系人：苏加坤，E-mail：sujiakun@第21卷第4期覃益民等：米曲霉GX0011 β -果糖基转移酶的分离纯化711转移果糖基连到蔗糖上产生低聚果糖的作用，还有催化转移果糖基连到水分子上产生果糖的作用，从而降低了低聚果糖的含量。

也有学者[1]认为这两种作用分属两种酶完成，即FTS催化产生低聚果糖，另一种酶β- D-呋喃果糖苷酶(β-D-fructofuranosidase，EC 3.2. 1.26，FFS)水解蔗糖和低聚果糖产生果糖。

为了进一步弄清这些问题，本文就本实验室自行诱变筛选的米曲霉GX0011进行了相关酶的分离纯化研究。

2 材料与方法2.1 材料和仪器考马斯亮蓝G-250(Fluka进口分装)，牛血清白蛋白(中科院上海生化所、电泳纯)，凝胶DEAE-Sephadex A-50、Octyl-Sepharose Cl-4B、Sephacryl S-300 均为Pharmacia，其它均为分析纯试剂。

高效液相色谱仪(配示差折光检测器、美国Waters)，NH2 column (4.6 mm×250 mm、日本 GL Sciences)，高速冷冻离心机(J-20XPI型、美国Beckman)；紫外可见分光光度计(UC1700型、日本岛津)，Vivaflow 50超滤器(德国 Sartorius)，自动液相色谱分离层析仪(MC99-3、上海青浦沪西仪器厂)。

2.2 菌种和培养条件米曲霉GX0011为本实验室自行筛选诱变。

培养基组成(g⋅L−1)：蔗糖24，酵母膏5，K2SO4 1。

接种量为3%，装液量为250 mL培养液，于500 mL摇瓶中在pH 6.5、28℃，150 r⋅min−1摇床培养32 h。

2.3 酶活测定用pH 5.5、50 mmol⋅L−1 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液配制10% (w/v) 的蔗糖溶液作底物, 加入适量的酶液(控制三糖最终生成量小于10％)，40℃水浴振荡反应40 min 后, 立即于100℃沸水浴中15 min, 终止反应，离心，取上清液测定各糖组分含量。

酶活定义如下：在上述反应条件下, 每分钟产生1 µmol 蔗果三糖所需酶量为转移酶1个活力单位(U)。

2.4 糖组分测定用HPLC 法测定，流动相为乙腈/水(75:25，v/v)，流速1.0 mL⋅min−1，35℃柱温下，待葡萄糖、蔗糖和蔗果三糖出峰后，用峰面积归一化法计算各糖组分含量。

2.5 蛋白质含量的测定以牛血清白蛋白作标准，用Bradford法[13]测定。

2.6 电泳分析SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳按文献[14]进行。

2.7 酶的分离纯化[15,16]2.7.1 粗酶液的提取用4-6层纱布把发酵培养的菌体过滤、洗涤、拧干，收集菌丝体。

将菌丝体悬浮于pH 7.050 mmol⋅L−1磷酸缓冲液中，用珠磨机破碎，破碎液以10000 r⋅min−1 4℃离心60 min，去除细胞碎片，得到粗酶液。

2.7.2 热变性将上述离心粗酶液置于50℃水浴热变性50 min，随后10000r⋅min−1 4℃离心60 min取上清液。

2.7.3 硫酸铵分级沉淀在4℃下，把硫酸铵缓慢加入变性后的粗酶液至55％饱和度，后用1 mol⋅L−1 NaOH调pH至7.0，4℃沉淀8 h，10000 r⋅min−1 4℃离心60 min，取上清液，按上述方法继续沉淀至95％饱和度。

过夜，10000 r⋅min−1 4℃ 60 min离心弃上清，以少许pH 7.0 50 mmol⋅L−1磷酸缓冲液溶解沉淀，将溶解液装于透析袋中在pH7.0 50 mmol⋅L−1磷酸缓冲体系透析脱盐24 h，10000 r⋅min−1 4℃ 60 min离心取上清液备用。

2.7.4 DEAE-Sephadex A-50柱层析(1)以pH 7.0 50 mmol⋅L−1磷酸缓冲液三个床体积平衡DEAE-Sephadex A-50离子交换柱(16 mm×300 mm)。

上述酶液先用超滤器浓缩，上样。

用两个床体积平衡液将未被吸附的杂蛋白洗去，随后用含0.0~1.0 mol⋅L−1的NaCl平衡液进行线性梯度洗脱，流速1.5 mL⋅min−1，收集酶活部分，酶液再用截留分子量为10000 (下同)712 高 校 化 学 工 程 学 报 2007年8月Fig.1 The course of heat denaturation的超滤器浓缩。

2.7.5 Octyl-Sepharose CL-4B 柱层析用PH 7.0 50 mmol ⋅L −1磷酸缓冲溶液配制的2 mol ⋅L −1 (NH 4)2SO 4充分平衡Octyl-Sepharose Cl-4B 疏水柱(φ16 mm×300 mm)，向上述浓缩酶液中加入(NH 4)2SO 4粉末，至其浓度为2 mol ⋅L −1，上样。

用两个床体积平衡液将未被吸附的杂蛋白洗去，随后用含2.0~0.0 mol ⋅L −1 的(NH 4)2SO 4洗脱液进行线性梯度洗脱，流速1.0 mL ⋅min −1, 收集酶活部分, 如上超滤浓缩。