DNA提取方法对苎麻脱胶菌群PCR_DGGE结果偏移的影响_黄鹏

基因组学与应用生物学，2010年，第29卷，第6期，第1184－1191页
Genomics and Applied Biology,2010,Vol.29,No.6,1184－1191
技术改进
Upgrated Technology
DNA提取方法对苎麻脱胶菌群PCR-DGGE结果偏移的影响
黄鹏陈洪高*饶维桥曾庆福
武汉纺织大学纺织印染清洁生产教育部工程中心,武汉,430071
*通讯作者,honggao_chen@
摘要为筛选和优化出较适宜的苎麻脱胶菌群DNA提取方法，本文分别以来自苎麻沤麻环境的6种纯培养菌等丰度混合物和苎麻自然沤麻菌群为材料，研究“溶菌酶－SDS”法、“超声波－溶菌酶－SDS”法、“蛋白酶K－SDS”法以及“冻融－蛋白酶K－SDS”法4种DNA提取方法对菌群16S rDNA基因PCR-DGGE偏移结果的影响。

结果表明，4种方法均能从2类材料中提取出了超过1600ng/μL的DNA，不同方法之间DNA 产率略有差异，经过超声波处理或反复冻融处理的DNA有明显的降解，但4种方法提供的DNA模板均扩增出了450bp的16S rDNA基因片段。

4种DNA提取方法对DGGE结果有明显影响，且只有“冻融－蛋白酶K－SDS”法检测到了纯培养菌混合物中的全部6种细菌，4种方法获得的自然沤麻菌群的DGGE指纹图谱也明显不同，最多产生17条带(“冻融－蛋白酶K－SDS”法)，最少只有9条带(“溶菌酶－SDS”法)，增加超声波或冻融等物理处理可以使部分弱带变强。

因此，组合应用物理、生物和化学等细胞裂解方法可以提供更有代表性的DNA，可减少PCR-DGGE结果的偏移。

关键词苎麻脱胶菌群,DNA提取方法,DGGE指纹,偏移
On the Influence of DNA Extraction from Ramie Retting Microbial Commu-nity for Bias of PCR-DGGE Result
Huang Peng Chen Honggao*Rao Weiqiao Zeng Qingfu
Engineering Research Center for Cleaner Production of Textile Dyeing and Printing Ministry of Education,Wuhan Textile University,Wuhan,430071 *Corresponding author,honggao_chen@
DOI:10.3969/gab.029.001184
Abstract In order to screen and optimize better DNA extraction methods for ramie retting community,in this pa-per,we collected a composite bacterial group mixed by six bacterial species and a natural microbial group from ramie retting environment to investigate the possible bias of the PCR-DGGE fingerprint in16S rDNA by4DNA extraction methods including“lysozyme/SDS”,“ultrasound/lysozyme/SDS”,“proteinase K/SDS”and“freez-ing-thawing/proteinase K/SDS”,respectively.The results showed that the concentrations of extracted DNA by four methods from two materials were all more than1600ng/μL with a little discrepancy for DNA yield among the four methods.However,DNA tails were observed obviously when ultrasonic or repeated freezing-thawing were used in DNA extracting process,and the expected fragments about450bp were obtained from DNA models extracted by four methods from the two materials.The results also displayed that there was significant effect on DGGE by the four DNA extraction methods,but only one composite bacterial group DGGE fingerprints generated from genomic DNA model provided by“freezing-thawing/proteinase K/SDS”method showed6bands expected,and the DGGE fingerprints of natural ramie retting microbial group acquired by four methods were also substaintially different, such as,17bands was the most by“freezing-thawing/proteinase K/SDS”method,while the least one was9bands generated by“lysozyme/SDS”method.Moreover,some weak bands could become legible by increasing the treat-ment of ultrasonic or repeated freezing-thawing.In conclusion,the bias of DGGE fingerprint could be avoided in
基金项目：本研究由“十一五”国家科技支撑计划项目(2006BAC02A00)和湖北省教育厅重点项目(D2*******)共同资助
great extent through combining and using cell disruption method such as physical,biological and chemical. Keywords Ramie retting community,DNA extraction methods,DGGE fingerprints,Bias
随着石油资源的日益枯竭和棉花价格的不断上涨，世界以化纤为主导的纺织原料格局正在发生着重大变化，麻类等植物韧皮纤维越来越受到重视。

苎麻(Boehmeria nivea L.Gaud.)为荨麻科(Urtica-ceae)苎麻属(Bochmeria)多年生宿根性植物，是我国特有的传统纺织材料，其纤维被称为“天然纤维之王”。

脱胶是麻类纤维纺纱之前的必经工序，传统的化学脱胶由于能耗高，用水量大，环境污染严重，正逐渐被淘汰，生物脱胶技术利用微生物及其所分泌的胞外酶在较温和的条件下降解胶质并分离纤维，节水节能，是重点研发的麻类纤维清洁生产技术之一(成雄伟,2007)。

高效的脱胶微生物是生物脱胶技术的核心，利用传统分离培养技术，选育出了胡萝卜欧文氏软腐菌T85－260(彭源德等,1995;刘正初等,2001,纺织学报,22(2):91-93)、嗜碱芽孢杆菌(Zheng et al.,2001)和枯草芽孢杆菌(李德舜等,2006)等一批重要的苎麻生物脱胶菌，以这些脱胶菌为基础的生物－化学联合脱胶技术，在一定程度上降低了化学脱胶的酸碱用量和环境污染。

然而，由于菌种产酶种类和数量有限，部分菌种不产半纤维素酶，导致生物脱胶酶用量大，成本高，胶质去除不彻底，不能在生产上完全替代化学脱胶。

现代分子生态技术研究表明(Mun-shi and Chattoo,2008;Zhang et al.,2008)，自然沤麻过程存在大量的微生物协同作用，但是由于无法知道每个微生物的具体分离培养条件，传统的培养分离技术只分离和鉴定出其中的少数(Ali,1958;Rosem-berg,1965;Donaghy et al.,1990)，许多相似的微生物往往被重复筛选，而大量对脱胶有重要贡献的微生物则无法分离(江云飞等,2008)。

基于微生物群落总DNA的变性凝胶梯度电泳技术(denaturing gradi-dent gel electrophoresis,PCR-DGGE)不依赖于对微生物的分离培养，在分析微生物群落结构、功能及动态检测研究中，比传统培养技术更具优势(Ercolini, 2004)，如果结合宏基因组学和基因克隆技术，还可以直接从分子水平上开发利用未培养微生物的脱胶基因资源(Morimoto and Fujii,2009)。

利用PCR-DGGE 技术，Munshi和Chattoo(2008)以及Ahmad(1963)发现了大量新的有潜在利用价值的黄麻脱胶微生物；凌宏志等(2009)发现泛菌属细菌和非培养微生物对亚麻脱胶过程有重要贡献。

然而，苎麻脱胶菌的研究一直沿用传统的纯培养技术，至今还没有关于利用PCR-DGGE技术研究苎麻脱胶菌群的报道。

PCR-DGGE技术结果的准确性首先取决于微生物宏基因组DNA的完整性和代表性，微生物DNA的完整性和代表性又常常与DNA提取方法有关。

DNA 提取的难点在于细胞的破碎和低丰度菌株DNA的回收，而且至今没有一种对所有的微生物样品都通用DNA提取方法(Feinstein et al.,2009)。

采用PCR-DGGE技术分析苎麻脱胶微生物群落结构，旨在探寻新的苎麻脱胶微生物或脱胶酶基因。

本文比较分析了4种物理、化学和生物细胞破碎方法及其组合使用提取DNA对苎麻脱胶菌群PCR-DGGE结果的影响，筛选和优化出了较适宜的DNA提取方法。

1结果与分析
1.1DNA产量和质量
4种方法都能从样品中提取浓度超过1600ng/μL 的DNA(表1)，在“溶菌酶－SDS”法(方法A)的基础上，增加超声波处理(方法B)后，DNA产率略有提高，“蛋白酶K－SDS”法(方法C)的DNA提取效率略次于“溶菌酶－SDS”法，但在“蛋白酶K－SDS”法的基础上，增加2次反复冻融过程(方法D)后，DNA产率超过了“溶菌酶－SDS－超声波”法。

DNA在不同紫外波长下的吸光度及其比值常被用来衡量DNA的纯度，一般认为：OD
260
/OD280大约在1.8左右，大于1.9时，可能有RNA污染，小于1.6时，可能有蛋白质和酚等污染；OD260/OD230应大于2.0，小于2.0时，说明盐去除不充分。

本试验中，4
种方法提取的DNA样品，除绝大多数的OD
260
/OD280比值都在1.7~1.9之间，表明蛋白质和RNA去除得
比较干净，但B
3
样品OD
260
/OD280小于1.7，可能有蛋
白质或酚污染，A
3
和A
4
样品的OD
260
/OD280大于1.9，
可能有RNA没去除干净。

所有样品的OD
260
/OD230比值均小于2.0，表明样品中可能还含有少量盐。

琼脂糖凝胶电泳表明(图1)，
“溶菌酶－SDS”法(泳
道A
1
~A4)及“蛋白酶K－SDS”法(泳道C1~C4)的DNA 片段长度都大于15kb，没有明显的拖尾现象，表明DNA较完整，但泳道A3、A4和C3加样孔较亮，表明这些样品可能有多糖没去除干净。

“超声波－溶菌酶
－SDS”法(泳道B
1
~B4)和“冻融－蛋白酶K－SDS”法(泳
道D
1
~D4)提取的DNA，片段在15kb左右，有明显的
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主带，也有严重的拖尾，表明增加超声波处理和反复冻融等物理处理后，虽然DNA 产率有所提高，但也加速了DNA 的降解，产生了一些小分子DNA 片段。

1.2PCR 扩增细菌16S rRNA 基因片段
分别以4种方法提取的纯培养菌复合群体DNA 和自然沤麻菌群DNA 为模板，用引物对F968GC 和R1401进行PCR 扩增，PCR 产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，检测到了450bp 的片段(图2)，与细菌16S rRNA 基因V6~V8区的目标片段大小一致，说明尽
表1DNA 浓度测定和质量分析
Table 1Determination of DNA concentration and quality 方法Methods 溶菌酶－SDS 法Lysozyme/SDS
超声波－溶菌酶－SDS 法Ultrasound/lysozyme/SDS
蛋白酶K －SDS 法Proteinase K/SDS
冻融－蛋白酶K －SDS 法
Freezing-thawing/proteinase K/SDS
样品编号Sample No.A 1A 2A 3A 4
B 1B 2B 3B 4
C 1C 2C 3C 4
D 1
D 2D 3D 4
OD 260/OD 280
1.721.90
2.012.091.781.721.661.731.741.701.951.921.821.901.811.78
OD 260/OD 230
1.701.901.861.861.861.701.881.801.801.791.511.911.831.881.711.92
DNA 浓度(ng/μL)DNA concentration (ng/μL)1643.11700.81750.91763.42213.91895.72285.62163.71546.61471.51619.11568.63003.42525.22653.22
451.1
图1总DNA 的电泳检测
注:M:DL15000DNA Marker (TaKaRa);A 1和A 2,B 1和B 2,C 1和C 2,D 1和D 2:分别用A,B,C,D 四种方法提取的6种纯培养菌等丰度混合物的DNA (a,b);A 3和A 4,B 3和B 4,C 3和C 4,D 3和D 4:分别用A,B,C,D 方法提取的苎麻自然沤麻菌群的DNA (a,b)Figure 1Electrophoresis validation of total DNA
Note:M:DL15000DNA Marker (TaKaRa);A 1and A 2,B 1and B 2,C 1and C 2,D 1and D 2:Genome mixture DNA of 6bacterial species extracted by methods A,B,C and D,respectively (a,b);A 3and A 4,B 3and B 4,C 3and C 4,D 3and D 4:Metagenome DNA of natural ramie retting bacteria extracted by methods A,B,C and D,respectively (a,b)
图216S rRNA PCR 产物电泳检测
注:a:纯培养菌复合群体;b:自然沤麻菌群;M:DL2000DNA Marker (TaKaRa);A,B,C 和D:分别代表4种DNA 提取方法Figure 2Electrophoretic analysis on PCR result of 16S rRNA Note:a:The bacteria composite consortia;b:The natural ramie retting microbial group;M:DL2000DNA Marker (TaKaRa);A,B,C and D:Genome mixture DNA extracted by methods A,B,C and D,
respectively
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On the Influence of DNA Extraction from Ramie Retting Microbial Community for Bias of PCR-DGGE Result
管4种方法提取的DNA 在质量和数量上存在差异，但这些质量上的缺陷还不足以影响到PCR 扩增反应的进行。

1.3DGGE 分离纯培养菌复合群体的16S rRNA 基因
片段
4种方法提取的6种细菌的基因组混合DNA ，经PCR 扩增和DGGE 分离后，共得到了6条清晰的带(图3)，平均每种微生物扩增出1条带，表明6种微生物的16S rRNA 基因片段均能被有效地扩增和分离出来，该技术能够用来分析未知菌群的群落组成。

然而，不同的DNA 提取方法，所扩增出的条带数目及带的强弱明显不同：“溶菌酶－SDS ”法提供的DNA 模板扩增出5条带(图3,泳道A)，3条明显，2条较弱(1号和4号带)，当增加超声波处理(图3,泳道B)后，1号弱带变得清晰可见，4号弱带变为了强带；“蛋白酶K －SDS ”法提供的DNA 模板也扩增出了5条带(图3,泳道C)，条带清晰，当增加反复冻融过程(图3,泳道D)之后，扩增产物分离出了6条强带。

4种DNA 提取方法中，只有“冻融－蛋白酶K －SDS ”法扩增出了6号带，表明在化学和生物技术破碎细胞的基础上，增加诸如超声波和冻融处理等物理措施，虽然带来了DNA 降解的风险，但也增加了难提取微生物DNA 的含量，减小了菌群数量的估计偏差。

1.4DGGE 分离自然沤麻菌群的16S rRNA 基因片段
用4种方法提取的自然沤麻菌群宏基因组
DNA 经PCR 扩增和DGGE 分离后，共得到20条可
图3纯培养菌复合群体的DGGE 指纹图
注:A,B,C 和D:4种不同的方法提取的6种细菌的基因组混合DNA;1~6:代表6种纯培养菌的DGGE 条带
Figure 3DGGE fingerprints of the six Bacteria composite con-sortia
Note:A,B,C and D:Genome mixture DNA of 6bacterial species extracted by 4different methods ;1~6:DGGE bands of 6bacteri-al
species
分辨的带(图4)，4种DNA 提取方法扩增条带数目依次为：“溶菌酶－SDS ”法(A 泳道,9条)＜“超声波－溶菌酶－SDS ”法(B 泳道,10条)＜“蛋白酶K －SDS ”法(C 泳道,14条)＜“反复冻融－蛋白酶K －SDS ”法(D 泳道,17条)，其中泳道A 分离出了1、2、3、6、13、14、16、18和20号带，泳道B 分离出了1、2、3、6、10、
13、14、16、17和20号带，C 泳道分离出了1、2、3、5、
6、9、11、12、13、14、15、16、18和19号带，泳道D 分离出了1、2、3、4、5、6、
7、
8、
9、11、12、13、14、15、16、17和18号带。

同生物酶与化学裂解法组合使用相比，增加物理措施处理后，扩增条带主要有如下三个方面变化：(1)强带更强，如2、9、13、14和16号带；(2)扩增出新带，如B 泳道比A 泳道多了10和17号带，D 泳道比C 泳道多了4、7、8和17号带；(3)弱带变化：部分弱带变强，如1、
6和14号带在A 泳道为弱带，在B 泳道中变为清晰可见的强带，3、9、12和18号带在C 泳道为弱带，在D 泳道中则变为了强带；部分弱带变化较小，如6、13和20号带在A 和B 泳道中均为弱带，1、5和15号带在C 和D 泳道均为弱带；极少数弱带变弱或消失，如在A 泳道出现18号带，在B 泳道没有出现，在C 泳道出现的的20号带，在D 泳道中更弱，C 泳道中出现的19号带，在D 泳道几乎无法辨认。

4种方法中，“反复冻融－蛋白酶K －SDS ”法扩
增出的条带数最多，条带最清晰，因此，本实验中，
“反复冻融－蛋白酶K －SDS ”法提取的DNA 最适宜
图4自然沤麻菌群的DGGE 指纹图
注:A,B,C 和D:4种不同的方法提取的宏基因组DNA;1~20:代表自然沤麻菌群中不同细菌的DGGE 条带
Figure 4DGGE fingerprints of natural ramie retting bacteria Note:A,B,C and D:Samples which metagenomic DNA extracted with different methods;1~20:DGGE bands of different bacterial species from natural ramie retting
community
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于苎麻沤麻菌群分析。

2讨论
为了开发和利用自然微生物资源，常常需要了解特定环境中微生物群落的种群分布、遗传多样性、动态特征、群落稳定性和主要功能菌，由于培养基和培养条件的限制，加之共生菌群中微生物之间的相互作用和相互依赖，自然环境中大约99%的微生物不能通过纯培养技术分离和鉴定(Tringe et al.,2005)。

PCR-DGGE技术直接以群落总DNA为材料，绕过了微生物的分离培养过程，可同时比较和分析大批量样品，使之迅速发展成为微生物群落结构分析研究的主要手段之一(Ercolini,2004)。

然而，PCR-DGGE技术也有其缺陷，在某些情况下，DGGE的条带数并不能正确反映混合菌群中的实际微生物种类：(1)部分细胞壁难破碎的革兰氏阳性菌及低丰度(小于群体总数1%)微生物DNA很难有效提取出来，导致菌种的估计数量比实际低(Feinstein et al.,2009)；(2)电泳条件不适宜时，序列不同的DNA会共迁移，一条DGGE带可能代表几种菌，导致估计数量比实际低(Sekiguchi et al.,2001)；(3)由于某些种类16S rDNA的拷贝之间的异质性问题及异源核酸双链分子的检出，一种微生物中可扩增出多条DGGE带，导致估计结果比实际高(陈章宝等,2010)。

在本实验中，6种纯培养细菌人工混合菌群的16S rDNA片段经过PCR-DGGE分离后，得到了6条清晰的带，基本上每一条带可以代表一种微生物。

然而，尽管在提取DNA之前，严格保证了6种细菌足够并且相等的丰度，但在4种DNA提取方法中，有3种均只检测到了5种细菌，只有“反复冻融－蛋白酶K－SDS”法检测到了全部6种细菌，而且不同方法中的同一种菌，以及同一方法中的不同细菌，其DGGE条带的灰度也存在较大的差异，可能是由于：(1)不同的微生物，其细胞破碎难度不同，如4号菌较容易，6号菌则较难，导致同一方法中菌种之间存在条带有无或强弱差异；(2)不同的DNA提取方法，其破碎细胞的能力和DNA回收效率不同，导致不同方法间同一微生物条带存在有无或强弱的差异。

4种不同的DNA提取方法得到了4种截然不同苎麻自然沤麻菌群DGGE指纹图谱，由溶菌酶处理改为蛋白酶K处理，或在酶与化学组合处理的基础上增加超声波处理或反复冻融等物理处理来加强细胞破碎，可以使条带数目增加，大部分弱带变强，但也使少数弱变得更弱，甚至消失。

条带数目的增加及弱带的变强可能是由于物理或生物措施增强了DNA提取体系破碎细胞壁的能力，使部分丰度不十分低但较难破壁的细菌的DNA产率提高了，对于群体中丰度较低而DNA提取并不困难的微生物，通过增强破壁能力增加DNA产率的效果并不明显，甚至可能因为在强烈机械作用、反复的冻融或DNA纯化过程中的降解或损失，使这些菌的DNA回收率进一步下降，并可能导致其DGGE 条带的变弱或消失。

总之，对于PCR-DGGE技术而言，DNA提取是其关键步骤，由于混合菌群中微生物之间存在细胞壁破碎难易不同和细胞丰度差异，为了最大限度地保证对菌群的无偏估计，针对具体材料，选择和优化DNA提取方法是非常必要的。

从本实验的结果看，组合应用物理技术、生物技术和化学技术来破碎细胞壁，能够促进细胞裂解和提高DNA的回收效率，提取的DNA更具有代表性，但物理措施的使用也加速了DNA的降解损失，因此，在操作过程中必须控制处理强度和时间，避免低丰度微生物DNA 的损失，才能保证同时获得混合菌群中的高丰度、低丰度和难提取微生物的DNA，避免DGGE结果的偏移。

3材料与方法
3.1供试微生物
本研究使用的6株纯培养菌，菌株编号为J
11
、J23、Z13、Z17、Y4和Y18，由武汉纺织大学纺织印染清洁生产教育部工程研究中心从苎麻自然沤麻液中分离，20%甘油中－70℃长期保藏，苎麻斜面培养基(在基础培养基基础上添加苎麻沤麻液提取物)短期保存，自然沤麻菌群取自湖北省咸宁市湖北新农生态麻业有限公司的沤麻池。

3.2试剂
溶菌酶、蛋白酶K(购自MERCK公司)；CTAB、SDS和去离子甲酰胺(购自BIOSHARP公司)；饱和酚(北京双翔达生化仪器厂)；无水乙醇、EDTA、氯仿、异戊醇(上海试剂一厂生产)；丙烯酰胺(科瑞生物)、甲叉双丙烯酰胺(武汉贝特生物)；RNase、Taq酶、dNTPs、引物(购自大连宝生物工程公司)和DNA Marker(TaK-aRa公司)；其它试剂为国产分析纯。

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3.3微生物培养与菌体收集
纯培养菌复合菌群：将6株细菌分别从斜面接种到含200mL培养液的三角瓶中，培养液组分为0.5%蛋白胨、2%苎麻粉、0.5%NaCl、0.2%CaCO3和0.1%酵母粉，42℃静置培养72h，用双层纱布过滤培养液，滤液4000r/min离心15min，弃沉淀，上清液12000r/min离心15min，沉淀用20mL无菌水清洗3次，再用5mL无菌水重悬，NanoDrop全波长分光光度计检测菌液浓度，以最低浓度管为参照，调整各管菌液浓度相等，从每管取5mL菌液混合均匀，平均分装至8个50mL离心管中，12000r/min离心15min，沉淀立即用于提取DNA。

自然沤麻菌群：从湖北新农生态麻业有限公司的沤麻池中取5L沤麻液作为接种体，带回实验室，立即接种到100L塑料桶中，桶内包含3kg原麻，45L 自来水，42℃培养至原麻分纤，取沤麻液500mL，用双层纱布过滤，滤液4000r/min离心15min，弃沉淀，上清液12000r/min离心15min，沉淀用50mL 无菌水清洗3次，再用20mL无菌水重悬，平均分装至8个10mL离心管中，12000r/min离心10min，沉淀立即用于提取DNA。

3.4DNA提取与质量检测
将以上16管菌体分为A、B、C和D4组，每组包含2管纯培养菌等比例混合菌体和2管共生菌群菌体，对应地采用A、B、C和D法提取DNA。

3.4.1“溶菌酶－SDS”法(方法A)
向离心管中加入3mL细胞裂解液(0.15mol/L NaCl,0.15mol/L Na2EDTA,15mg/mL溶菌酶,pH 8.0)，37℃水浴2h，再加入200μL23%SDS，60℃水浴30min，12000r/min，10℃离心10min，保留上清，沉淀加2mL裂解缓冲液(0.15mol/L NaCl,0.15mol/L Na2EDTA,pH8.0)重悬，混匀，12000r/min，10℃离心10min，集中2次离心的上清液，加等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混合液，混匀，12000r/min，10℃离心10min，上清液加入5mol/L NaCl至终浓度0.2mol/L，再加入等体积的异丙醇，室温放置1h，12000r/min，10℃离心20min，得到DNA沉淀，沉淀用70%乙醇洗涤2遍，室温风干，100μL TE(pH8.0)溶解，加入5μL RNase(10mg/mL)孵育1h(Clegg et al.,1997)。

3.4.2“超声波－溶菌酶－SDS”法(方法B)
向离心管中加入3mL细胞裂解液，37℃水浴2h，再加入200μL23%SDS，超声波破碎15min(功率500W,工作1min,间隔10s,5min为一周期)，每次超声波处理后冰浴2min，处理完毕后60℃温浴30min，12000r/min，10℃离心10min，保留上清，沉淀加2mL裂解缓冲液(0.15mol/L NaCl,0.15mol/L Na2EDTA,pH8.0)重悬，混匀，12000r/min，10℃离心10min，集中2次离心的上清液，加等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混合液，混匀，12000r/min，10℃离心10min，上清液加入5mol/L NaCl至终浓度0.2mol/L，再加入等体积的异丙醇，室温放置1h，12000r/min，10℃离心20min，得到DNA沉淀，沉淀用70%乙醇洗涤2遍，室温风干，100μL TE(pH8.0)溶解，加入5μL RNase(10mg/mL)孵育1h(Robe et al.,2003)。

3.4.3“蛋白酶K－SDS”法(方法C)
向离心管中加入3mL SET缓冲液(0.1mol/L Tris-Cl,0.1mol/L NaCl,2%SDS,0.15mol/L Na2EDTA, pH7.5)悬浮细胞，加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)，55℃消化4h，然后12000r/min离心10min，将上清转入新的离心管中，加入等体积的饱和酚，将之混匀，12000r/min离心10min，取上清，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，混匀，12000r/min离心10min，上清液加入5mol/L NaCl至终浓度0.2mol/L，再加入等体积异丙醇，室温放置1h，然后12000r/min和10℃离心20min，沉淀用70%乙醇洗涤2次，室温风干，100μL TE(pH8.0)溶解，加入5μL RNase(10mg/mL)孵育1h(Roose-Amsaleg et al.,2001)。

3.4.4“冻融－蛋白酶K－SDS”法(方法D)
向离心管中加入3mL SET缓冲液(0.1mol/L Tris-Cl,0.1mol/L NaCl,2%SDS,0.15mol/L Na2EDTA, pH7.5)悬浮细胞，加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)，55℃消化4h，然后－80℃冷冻30min，60℃水浴解冻10min，相同的方法重复冻融一次，12000r/min，10℃离心10min，加等体积的酚/氯仿/异戊醇(25: 24:1)，混匀，12000r/min，10℃离心10min，上清液加入5mol/L NaCl至终浓度0.2mol/L，再加入等体积的异丙醇，室温放置1h，12000r/min，10℃离心20min，沉淀用70%乙醇洗涤2遍，室温风干，100μL TE(pH8.0)溶解，加入5μL RNase(10mg/mL)孵育1h(Schneegurt et al.,2003)。

3.5DNA质量检测
1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，点样量为
1189
基因组学与应用生物学Genomics and Applied Biology
4μL，电泳电压120V，EB染色检测。

NanoDrop全波长分光光度计检测DNA质量，读取A
230
nm、A260nm、A280nm、OD260/OD230nm、OD260/ OD280nm值。

3.6PCR扩增
用细菌16S rRNA基因V6~V8区通用引物对进行扩增，正向引物F968(5'－CGCCCGGGGCGCGCC CCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGAACGCGAA GAACCTTAC－3')带GC夹子，反向引物R1401(5'－G GTGTGTACAAGACCC－3')不带GC夹子。

PCR程序为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃再延伸10min。

扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

3.7变性梯度凝胶电泳(DGGE)
采用DCodeTM System(Bio-Rad)进行DGGE分析，聚丙烯酰胺胶浓度8%，变性剂梯度范围为30%~ 60%(100%的变性剂包含7mol/L尿素和40%去离子甲酰胺)，1×TAE缓冲液，120V电压，55℃恒温，电泳9.5h，银染，拍照。

致谢
本实验还得到了武汉纺织大学李海燕、王军、崔永明和王茜等老师的支持与协助，在此表示感谢！
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