酵母基因工程(正)
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第十五章--酵母基因工程
2
15.1.2 发展现状
o 在酵母基因工程中发展和应用较多的酵母: 酿酒酵母 乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis） 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris） 多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha） 烷烃利用型降脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica） 粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe） o 应用:改造酵母本身用以提高发酵性能和表达异源 蛋白两方面。
15.1.3 发展趋势
1．解决酵母基因工程中还存在的缺陷 2．在人类基因组计划中的应用研究是一个重要的 发展方向 3．利用酵母基因工程筛选更多的新药 4．改造酿酒酵母自身，降低生产酒精的成本 5．酵母的生理承受极限研究将引起人们的关注
4
15.2 酵母表达系统
15.2.1 酵母表达载体
典型的酵母表达载体均为大肠杆菌和酵母菌的穿梭 质粒。 o 原核部分：大肠杆菌中ori和抗生素抗性序列。 o 酵母部分：维持复制的元件，如附加型的2μm质 粒复制起点序列，或染色体的自主复制序列 （auto-replication sequence, ARS），或整合 型载体的整合介导区；酵母转化子的筛选组分以 及编码特定蛋白的基因启动子和终止子序列。 o 分泌型表达载体还要带有信号肽序列
5
② 整合型载体
o 整合在酵母细胞染色体基因组DNA上，稳定性高, 但拷贝数量低。 o 不含酵母的复制起始区，而是含与受体菌株基 因组有某种程度同源性的一段DNA序列，能有效 介导载体与宿主染色体之间发生同源重组，使 载体整合到宿主染色体上并随同酵母染色体一 起复制。
外源基因整合靶位点—酵母rDNA单元 o 酵母rDNA单元大小为9.1kb，每个单元包含 有35S rRNA前体和5S rRNA基因，这两个转 录单元之间有非翻译区（NTS），在非翻译 区含有DNA复制原点，如图15-1所示。 o 在rDNA单元中有两个HOT区（激活rDNA间的 重组）和一个TOP区（抑制rDNA间的重组）。 o 如果所取rDNA片段只有HOT区，就容易发生 重组，整合拷贝就容易丢失。 o 如果所取的rDNA片段既有HOT区，又有TOP 区，或者两者都不存在，整合拷贝间就不 容易重组，整合拷贝就很稳定。
酵母菌在基因工程中的应用
酵母菌在基因工程中的应用酵母菌是一类单细胞真核生物，是生物科学研究中的一种常见模式生物。
它们普遍存在于自然界中，可以在发酵食品的制备以及生命科学研究领域发挥着重要的作用。
在基因工程领域中，酵母菌更是被广泛应用，成为了基因工程领域的重要工具之一。
下面我们就来看看，酵母菌在基因工程领域中都有哪些应用吧。
一. 酵母菌作为表达宿主酵母菌是一类常见的蛋白表达宿主，能够快速高效地表达蛋白质，是一种常见的蛋白质产生工具。
一般来说，通过基因工程手段将需要表达的蛋白质的基因导入酵母菌中，利用其自身繁殖特性，迅速高效地表达出需要的蛋白质。
此外，在表达蛋白质的过程中，酵母菌的生长条件相对简单，可以通过温度、氧气、营养等因素的控制来实现高效的表达。
二. 酵母菌在药物研究中的应用当前，越来越多的药物研发都依赖于基因工程技术，而酵母菌则成为了药物研发中的重要工具之一。
通过将需要研发的靶点基因导入酵母菌中，可以模拟药物对生物体内靶点的作用过程。
此外，还可以通过酵母菌对药物副作用的研究，为药物的准确作用机制提供参考。
三. 酵母菌在癌症研究中的应用对于癌症的研究一直以来都是生物学家们所关注的重要问题之一。
而酵母菌则成为了癌症研究中的重要研究工具之一。
通过将癌症相关基因导入到酵母菌中，并通过对其复制、修复和细胞凋亡等过程的研究，可以更好地理解癌症的发生机制和治疗过程，为癌症的诊断和治疗提供更好的参考。
四. 酵母菌在基因组研究中的应用对于生命科学研究而言，基因组研究是一项重要的研究领域。
而目前，酵母菌的基因组研究也在不断地发展。
利用酵母菌基因组研究这一工具，可以揭示基因与生物型之间的关系，探寻基因突变造成遗传性疾病的可能机制，还可以帮助人们更好地理解基因间相互作用，促进基因工程技术的发展。
总之，随着基因工程技术的不断发展，酵母菌作为一种常见的模式生物，也在越来越多的领域中发挥着重要的作用。
通过其快速高效的蛋白表达能力以及对生物学过程的模拟研究，酵母菌为人们揭示了生物世界中的许多秘密。
基因工程在酵母菌中的应用
基因工程在酵母菌中的应用酵母菌是一种非常常见的单细胞真菌，被广泛应用在工业生产、基因工程、生物学研究等领域。
其中，基因工程在酵母菌中的应用越来越受到关注，因为它可以通过改变酵母菌的基因来产生更高效、更安全、更低成本的产品。
一、酵母菌的基因工程基因工程（Genetic Engineering）、也称基因修饰（Genetic Modification），是指人工干预生物基因的技术。
通过将外源基因从别的物种引入到酵母菌中，或者利用已有技术将酵母菌原有的基因进行修改，来达到目的。
以酿酒酵母为例，使用基因工程技术可以让酵母在发酵过程中增强种类芳香、味道、颜色等方面的特性，减少酒类生产中对添加剂的依赖。
此外，基因工程还可以增强酵母在生产生物质和生产酶等方面的能力，提高生产效益和质量。
二、基因工程在生物药品中的应用随着基因工程技术的发展，越来越多的药品开始使用酵母菌系统进行生产，因为酵母菌可以产生大量的复杂蛋白，在药品生产中发挥重要作用。
1. 重组蛋白重组蛋白是由酵母菌制造的人造蛋白质，它由通过DNA技术人工合成的基因进行控制。
重组蛋白可以用于治疗多种疾病，如肿瘤、结缔组织疾病、感染症等。
2. 抗生素一些抗生素是由酿酒酵母制造的，包括属于毒素类的青霉素、链霉素和司云生素等。
这些抗生素可以用于治疗许多细菌感染病，如耳炎、肺炎、中耳炎、胃肠炎等。
三、基因工程在生物燃料中的应用生物燃料是使用生物质或燃料酒精等生物产物，进行发电或其他能源生产的一种新型能源，基因工程在此方面的应用也十分广泛。
1. 生物酒精将酿酒酵母与一种名为琼脂糖的发酵物混合后，然后加入蔗糖，在发酵的过程中，酵母细胞可以将蔗糖转化成酒精。
用于生产生物酒精的酿酒酵母与市面上的酿酒酵母相比，有着更高的酒精浓度和收率，可以使得生产效益更高。
2. 生物柴油利用基因工程技术获得的淀粉酵母株，可以将淀粉直接转化成脂肪酸甲酯（生物柴油）；利用酿酒酵母株，在发酵过程中将纤维素分解为糖分，再将糖分转化成脂肪酸甲酯，生产生物柴油。
外源基因在酵母体系中表达
C.albicans hyphal n.r cell wall Ag
Spinach
2
phosphoribulokinase
S/Mut+ Halaas, et al (1995)
Shiba, et al (1995)
S/Mut+
S/Mut+, S/MutS( 30,000 copies/c ell) S/MutS
fragment C
Pertusis
3
antigen P69
Mouse EGF 0.45
Aprotinin 0.8
Kunitz
1
protease
inhibitor (A-
beta-PP)
Human
4
serum
albumin(HS
A)
HIV-1
1.25
gp120
and
0.02
I/Mut+ and Muts I/Muts S/Muts S/Mut+/Muts S/Mut+
第一代酵母基因工程表达系统是以酿酒酵 母表达系统为典型代表。
第二代酵母基因工程表达系统的典型代表 就是近年来倍受关注的毕赤酵母表达系统 等为代表的甲醇酵母表达系统：
1987年Cregg等首次报道甲醇营养型毕 赤酵母(Methy1otrophic Pichia pastoris)表达 外源蛋白以来，由于它具有表达效率高， 遗传稳定，产物可分泌表达等优点，己成 为近年来极受青睐的真核基因表达系统。
S:284
ds Fv (di-sulfide-bonded n.r S/n.r Luo, et al (1995), J.
single chain antibodies) n.r
第七章 酵母基因工程
第七章 酵母菌的基因工程
Dividing Saccharomyces cerevisiae (baker’s yeast) cells
一. 酵母克隆载体
① 能在E.coli中克隆和扩增。 Ori ②有大肠杆菌的选择标记 Ampr、Tetr。 ③ 有酵母的选择标记 Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+;
如pYF92:
pBR322 2m 酵母his 3+
2m质粒： 酿酒酵母的内源质粒，长度是2m 。含有自主 复制起始区ori和STB序列（使质粒在供体中维 持稳定）。
特点：
①很高的转化活性（103-105转化子/微克 DNA）. ②拷贝数多（25-100分子/细胞）。 ③比YRp稳定。
YEp24
亮氨酸lue2—β-异丙基苹果酸脱 氢酶
• 该酶是把丙酮酸转化成亮氨酸的代谢酶之 一．只要使用亮氨酸lue2突变的营养缺陷型 酵母作受体，载体上带有亮氨酸lue2基因就 能在不含亮氨酸的培养基上实现转化克隆 的筛选（书１７０页图）．
四. 酵母表达系统的特点
（1）优点 ①对其遗传学和生理学的研究比较深入。 ②小量培养和大规模反应器中都能生长。 ③已经分离出很强的启动子。 ④有翻译后的加工。 ⑤本身自然分泌很少，便于胞外蛋白的纯 化。 ⑥安全性高（FDA确认的安全生物），不 需要宿主的安全性检验。
④不稳定，容易丢失。
（3）着丝粒质粒(YCp) 在YRp质粒中插入酵母染色体的着丝粒 区。 YRp质粒 酵母着丝粒 特点： ①行为像染色体，能稳定遗传。 ②单拷贝存在。
③不易从细胞中提取。
（4）附加体型载体(YEp) 由大肠杆菌质粒、2m质粒及酵母染色体 DNA选择标记构成。 大肠杆菌质粒 2m质粒 酵母选择标记
Dividing Saccharomyces cerevisiae (baker’s yeast) cells
一. 酵母克隆载体
① 能在E.coli中克隆和扩增。 Ori ②有大肠杆菌的选择标记 Ampr、Tetr。 ③ 有酵母的选择标记 Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+;
如pYF92:
pBR322 2m 酵母his 3+
2m质粒： 酿酒酵母的内源质粒，长度是2m 。含有自主 复制起始区ori和STB序列（使质粒在供体中维 持稳定）。
特点：
①很高的转化活性（103-105转化子/微克 DNA）. ②拷贝数多（25-100分子/细胞）。 ③比YRp稳定。
YEp24
亮氨酸lue2—β-异丙基苹果酸脱 氢酶
• 该酶是把丙酮酸转化成亮氨酸的代谢酶之 一．只要使用亮氨酸lue2突变的营养缺陷型 酵母作受体，载体上带有亮氨酸lue2基因就 能在不含亮氨酸的培养基上实现转化克隆 的筛选（书１７０页图）．
四. 酵母表达系统的特点
（1）优点 ①对其遗传学和生理学的研究比较深入。 ②小量培养和大规模反应器中都能生长。 ③已经分离出很强的启动子。 ④有翻译后的加工。 ⑤本身自然分泌很少，便于胞外蛋白的纯 化。 ⑥安全性高（FDA确认的安全生物），不 需要宿主的安全性检验。
④不稳定，容易丢失。
（3）着丝粒质粒(YCp) 在YRp质粒中插入酵母染色体的着丝粒 区。 YRp质粒 酵母着丝粒 特点： ①行为像染色体，能稳定遗传。 ②单拷贝存在。
③不易从细胞中提取。
（4）附加体型载体(YEp) 由大肠杆菌质粒、2m质粒及酵母染色体 DNA选择标记构成。 大肠杆菌质粒 2m质粒 酵母选择标记
第十五章：酵母菌基因工程选编
③易进行载体DNA的导入。DNA转化技 术的不断发展优化，多数酵母菌可 以取得较高的转化率；
④培养条件简单，容易进行高密度 发酵；
⑤能将外源基因表达产物分泌到培 养基中；
⑥有类似高等真核生物的蛋白质翻 译后的修饰功能。
2.缺陷在于：
①表达效率相对低； ②酵母常有密码子偏爱性，真核基
因在其中表达时需要人工修正。
2.含有ARS的YRp和YEp质粒及其构建
①ARS为酵母菌中的自主复制序列，大 小在0.8-1.5Kb,染色体上每30-40bp 就有一个ARS元件。
②由染色体ARS构成的质粒称为YRp，而 由2μ质粒构建的杂合质粒为YEp。
③上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数 最高可达200个，但是经过几代培养 后，质粒丢失率达50%-70%，主要由 于分配不均匀所致。
三．抑制超糖基化作用的突变宿主菌
许多真核生物的蛋白质在其天门冬 酰胺侧链上接有寡糖基团，常常影 响蛋白质的生物活性。整个糖单位 由糖基核心和外侧糖链两部分组成。
酵母菌普遍拥有完整的糖基化系统，酿 酒酵母细胞内的天门冬酰胺侧链糖基修 饰和加工系统对来自高等动物和人的异 源蛋白活性表达是极为有利的，但野生 型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很 难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖基 化缺陷菌株非常重要。
②YAC载体的装载量建
①YIP 载体由大肠杆菌质粒和酵母的 DNA 片段组成，可与受体或宿主的染色体 DNA 同源重组，整合进入宿主染色体中，酵母 片段只提供选择性标志，没有复制起点。
②转化率低（只有1-10转化子/微克DNA）， 但转化子遗传性稳定，多用于遗传分析。
一．广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
目前已广泛用于外源基因表达的研究的酵母菌包括：
基因工程：第四章-酵母基因工程
UBC4-UBC5双突变型：
UBC4-UBC5双突变型能大幅度削弱泛
素介导的蛋白降解。
7个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白 降解作用同样有效。
6、内源性蛋白酶缺陷型的突变宿主菌
酿酒酵母具有20多种蛋白酶 空泡蛋白酶基因PEP4野生型和
pep4-3突变株
B-半乳糖苷酶活性明显升高
（三） 酵母菌的载体系统
酵母基因工程
酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征 酵母菌的宿主系统 酵母菌的载体系统 酵母菌的转化系统 酵母菌的表达系统 利用重组酵母生产乙肝疫苗
1974 Clarck-Walker和Miklos发现在多数酿酒酵母 中存在质粒。
1978 Hinnen将来自一株酿酒酵母的leu2基因导入 另一株酿酒酵母，弥补了后者leu2的缺陷， 标志着酵母表达系统建立。
酵母菌有4个泛素编码基因：
UBI1 编码泛素-羧基延伸蛋白52 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI2 编码泛素-羧基延伸蛋白52 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI3 编码泛素-羧基延伸蛋白76 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI4 编码泛素五聚体
对数生长期关闭 稳定期表达
酵母菌有7个泛素连接酶基因：
UBC1、UBC2、UBC3、UBC4、UBC5、UBC6、UBC7
酵母菌表达外源基因的优势： 全基因组测序，基因表达调控机理清楚，遗传 操作简便。 具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。 能将外源基因表达产物分泌至培养基中。 大规模发酵工艺简单、成本低廉。
不含特异性病毒、不产毒素，被美国FDA认定为 安全的基因工程受体系统。
酵母菌表达外源基因的缺点：
表达产物的糖基化位点和结构特点 与高等真核生物有差距。
特点：
美国克雷格·文特尔研究所利用基因工程成功培育出新型微生物
及斑马鱼胚胎 中特定基因 ， 现在正用 于人 体临床试验 以治疗 艾滋病 。利用此项技术成功 进行 哺乳 动物基 因编 辑 尚属首
次。
Ｄ Ａ错拼 ， Ｎ 如单核 苷酸多态 性变异 （ Ｎ Ｓ 以及基 因序 列 的 ＳＰ ） 插入和删除 。研究人员采用 多步分类检 测法 ， 滤去 普通变异
他研究单 位合作 ， 成功地证 明了使用外显子测 序方法确 定罕 见致病基 因的可行性 和应用价值 。他们 的相关 研究 成果 发
表 于 ８月 １ ６日《自然》 杂志网络版。 公告 称 ， 研究人员选取 了 １ 为研究对象 ， ２人 对他们 的外 显 子进 行了测序 。这 １ ２人 中的 ８人 （ ４个 非洲 约鲁 巴人 、 ２
据东方网 ２ ０ ０９年 ８月 ２ ６日援 引《 科技 日报》 消息 ， 科 ＜ 学》 杂志 网络版上最新发表的一篇美 国克雷格 － 文特 尔研 究
所的研究报告说 ， 科研人员将丝状支 原体 的基因组植入酵 母
中， 利用酵母基因工程方法改造了该支原体的遗传物质。然
后， 研究 人员将这个 改性基 因组植入 山羊霉浆 菌（ 和丝状 支
线粒体 异常相关疾病 的母 亲生育健康 的后代 。不过 ， 也有专
家认 为 ， 不同来源的细胞核 Ｄ Ａ和线粒体 Ｄ Ａ不 一定 总是 Ｎ Ｎ 相容 ， 存在冲突的危险。更 有伦理学 家批 评说 ， 是滑向“ 这 混
合 儿童时代” 的一步 ， 将玷污生命 的圣 洁。
美 法 科 学 家 利 用锌 指核 酸 酶 胚 胎 微 量 注 射 技 术 成功培育基因靶标 剔除大鼠
・
７ ・ ６
生 物学教 学 ２１ ｇ（ ３ 卷） 期 ０ ０ ｇ ５ 第２
２０ ０ ７年 ， 该所 公布 了细菌基 因组 移植 的成果 ； 去年 该研究 所
次。
Ｄ Ａ错拼 ， Ｎ 如单核 苷酸多态 性变异 （ Ｎ Ｓ 以及基 因序 列 的 ＳＰ ） 插入和删除 。研究人员采用 多步分类检 测法 ， 滤去 普通变异
他研究单 位合作 ， 成功地证 明了使用外显子测 序方法确 定罕 见致病基 因的可行性 和应用价值 。他们 的相关 研究 成果 发
表 于 ８月 １ ６日《自然》 杂志网络版。 公告 称 ， 研究人员选取 了 １ 为研究对象 ， ２人 对他们 的外 显 子进 行了测序 。这 １ ２人 中的 ８人 （ ４个 非洲 约鲁 巴人 、 ２
据东方网 ２ ０ ０９年 ８月 ２ ６日援 引《 科技 日报》 消息 ， 科 ＜ 学》 杂志 网络版上最新发表的一篇美 国克雷格 － 文特 尔研 究
所的研究报告说 ， 科研人员将丝状支 原体 的基因组植入酵 母
中， 利用酵母基因工程方法改造了该支原体的遗传物质。然
后， 研究 人员将这个 改性基 因组植入 山羊霉浆 菌（ 和丝状 支
线粒体 异常相关疾病 的母 亲生育健康 的后代 。不过 ， 也有专
家认 为 ， 不同来源的细胞核 Ｄ Ａ和线粒体 Ｄ Ａ不 一定 总是 Ｎ Ｎ 相容 ， 存在冲突的危险。更 有伦理学 家批 评说 ， 是滑向“ 这 混
合 儿童时代” 的一步 ， 将玷污生命 的圣 洁。
美 法 科 学 家 利 用锌 指核 酸 酶 胚 胎 微 量 注 射 技 术 成功培育基因靶标 剔除大鼠
・
７ ・ ６
生 物学教 学 ２１ ｇ（ ３ 卷） 期 ０ ０ ｇ ５ 第２
２０ ０ ７年 ， 该所 公布 了细菌基 因组 移植 的成果 ； 去年 该研究 所
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C 酵母菌的载体系统
酵母菌中的野生型质粒 酵母菌克隆表达质粒的构建
酵母菌中的野生型质粒
1. 酿酒酵母中的2µ环状质粒
REP1 IR FLP
拷贝数达50-100个 IRs 反向重复序列，600 bp，重组 FLP 编码产物驱动IRs的同源重组 REP 编码产物控制质粒的稳定性 STB REP的结合位点
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
1. 泛素介导的蛋白质降解作用
泛素Ubiquitin ：76 aa
Leu-Arg-Gly-Gly
E1： E1：泛素活化酶 E2： E2：泛素结合酶 E3： E3：泛素连接酶 26S蛋白酶体 26S蛋白酶体 基本过程： 基本过程： ① 靶蛋白的泛素化
泛素介导的蛋白酶体降解途径
上述两类质粒转化效率较高（103-4转化子/ugDNA ），但转化子不 稳定。虽然在酿酒酵母中拷贝数最高可达200个，但培养几代后，质粒 的丢失率高达50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。
2. 含有CEN的YCp质粒的构建
CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列，将CEN DNA插入到YRp质粒中，获得的新载体称为YCp。YCp质粒具有较高的有 丝分裂的稳定性，但拷贝数只有1 - 5个。
RAF STB
A ori IR 同源重组
6318bp
REP2
B
2. 乳酸克鲁维酵母中的线状质粒
乳酸克鲁维酵母中含有两种不同
DNA聚合酶 毒素蛋白αβ 免疫蛋白 γ 亚基
的双链线状质粒pGKL1和pGKL2， IRs 拷贝数为50-100个，分别携带K1 K2两种能使多种酵母菌致死的毒 素蛋白编码基因（α β γ）。
HIS4
Kan 3’AOX1
Linearized plasmid
aph cat dhfr cup1 suc2 ilv2
i. 氨基糖苷磷酸转移酶基因（APH）显性选择
氨基糖苷磷酸转移酶由大肠杆菌易位子Tn601(即Tn903) 的aph-I基因或Tn5的aph-II基因编码。它是氨基糖苷类抗生 素的抗性基因，编码的APH酶可以使G418失去活性，故转 化了APH基因的转化子具有对G418的抗性。
酵母菌表达外源基因的优势
i. 全基因组已测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便 ii. 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 iii. 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 iv. 能将外源基因表达产物分泌至培养基中 v. 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的 基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS） vi. 酵母菌是最简单的真核模式生物
2. a – α 型启动子：
酿酒酵母有a和α两种 单倍体，分别由MATa和 MATα两个等位基因决定。 α1因子决定α型细胞 特征表达，α2因子阻遏a 型细胞特征表达，a1-α2 阻遏α型细胞特征表达。 α2因子的基因突变型 hmlα2-102能产生α2变体 ，α2变体与a1蛋白交配时 丧失了对α1蛋白转录的阻 遏作用，同时α2变体阻遏 a型细胞特征表达。
酵母菌的转化程序
1. 酵母菌原生质体转化法
在Ca2+和PEG的存在下，酵母菌原生质体可有效地吸收质 粒DNA，转化细胞可达原生质体总数的1-2%。一个受体细胞可 同时接纳多个质粒分子。
2. 碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化法
酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+等）、PEG、热休克 处理后，也可高效吸收质粒DNA。 （1）吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA （2）共转化现象极为罕见
酵母菌质粒载体的种类：
整合型载体 （YIp） 自主复制型载体 （YEp、YCp、YAC） YRp
1. 含有ARS的YRp质粒及含有2µ Ori的YEP质粒的构建
以ARS（0.8-1.5kb）为复制子的质粒称为YRp，是酵母的 染色体复制型质粒。 以2µ质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp，是酵母 的附加体型质粒。
在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列或标记基因，构 建出来的质粒称为YIp。YIp质粒转化频率低（小于102转化子/ugDNA ） ，整合拷贝数只有1-2个。
同源重组的两种方式： 同源重组的两种方式：单交换整合和双交换整合
D 酵母菌的转化系统
酵母菌的转化程序 转化质粒在酵母细胞中的命运 用于转化子筛选的标记基因
作用位点 Ca2+-ATPase/转录后 转录后 转录 转录后 羧肽酶Y 转录
ssc1 ssc2 rgr1 ose1 ss11 rho-
抑制超糖基化作用的突变宿主菌
野生型酿酒酵母对外源蛋白呈超糖基化倾向。
能抑制超糖基化的突变菌株 突变菌株 mnn alg och 生物学效应 甘露糖生物合成缺陷型 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型 外侧糖链添加缺陷型
酵母菌共有七个泛素连接酶基因：
UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7
3. 泛素降解途径衰减的酿酒酵母
UBI 4缺陷型： 在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4-突变株能 正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多。 Ubc4 - ubc5 双突变型： 七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效。
受体细胞基因组 (MATa-hmlα2-102-sir3-8ts基因型) 25℃ Sir3-8TS a1
重组质粒
a 型启动子 hmlα2-102 35℃ Sir3-8TS α2变体 a1 a 型启动子 MATa
α 型启动子
hmlα2-102 α1
MATa
α 型启动子
外源基因在酵母菌中表达的限制因素
其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯 德毕赤酵母表达外源基因最理想。
提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌
突变类型
产生的异源蛋白 凝乳酶原/牛生长因子 凝乳酶原/牛生长因子 鼠α-淀粉酶 鼠α-淀粉酶 人溶菌酶 人溶菌酶
生物效应 改善重组蛋白分泌 改善重组蛋白分泌 提高重组蛋白表达 提高重组蛋白分泌 改善重组蛋白分泌 提高重组蛋白表达
用于转化子筛选的标记基因
1. 营养缺陷型的互补基因
氨基酸和核苷酸生物合成基因，如LEU、TRP、HIS、LYS、 URA、ADE等。
2. 显性标记基因
显性标记基因的编码产物主要是毒性物质的抗性蛋白
标记基因 编码产物 氨基糖苷磷酸转移酶 氯霉素乙酰转移酶 二氢叶酸还原酶 铜离子螯合物 蔗糖转化酶 乙酰乳糖合成酶 遗传表型 抗G418 抗氯霉素 抗氨甲喋呤和磺胺 耐受铜离子 耐受高浓度蔗糖 抗硫酰脲除草剂
（1）巴斯德毕赤酵母表达系统的载体及重组表达载体的构建
Gene of interest
（2）重组表达载体的转化 常用的受体菌为GS115和KM71株，它们均为HIS4-突变株。 转化方法有原生体转化法、电穿孔转化法、氯化锂转化法等。
（3）重组表达载体在受体细胞内的同源整合
Gene of interest TT
② 泛素化蛋白的降解
2. 酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因
酵母菌共有四个泛素编码基因：
UBI 1 编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 对数生长期表达 稳定期关闭 UBI 2 编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 对数生长期表达 稳定期关闭 UBI 3 编码泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76） 对数生长期表达 稳定期关闭 UBI 4 编码泛素五聚体 对数生长期关闭稳定期表达
E
酵母菌的表达系统
酵母菌启动子的可控性 外源基因在酵母菌中表达的限制因素 酵母菌表达系统的选择
酵母菌启动子的可控性
1. pho4TS-PHO5启动子：
酿酒酵母PHO5启动子在培养基中游离磷酸盐耗尽时才能打开； PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子； PHO4温度敏感型突变基因pho4TS的编码产物在35℃时失活； 装在pho4TS-PHO5启动子下游的外源基因在35℃时关闭，23℃诱 导表达。
3. 酵母菌电击转化法
酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA， 但在此过程中应避免使用PEG，它对受电击的细胞具有较很大的负 作用。电击转化的优点是不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件， 适用范围广，而且转化率可高达105 / µg DNA。
转化质粒在酵母细胞中的命运
（1） 单双链DNA均可转化酵母菌，但单链的转化率是双链的10-30倍。 （2） 含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制。 （3）不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体。 3 （4）线性质粒和带缺口的双链DNA分子能高效转化酵母菌。
2. 巴斯德毕赤酵母表达系统
巴斯德毕赤酵母的生物学特性： 巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能代谢甲醇作为其唯 一碳源。染色体上有两个基因AOX1和AOX2编码醇氧化酶，其 中AOX1是细胞内醇氧化酶活性的主要来源。它的表达受严格 地双重调控，当巴斯德毕赤酵母在以葡萄糖或甘油为碳源的培 养基上生长时，AOX1基因的表达受到抑制；而在以甲醇为唯 一碳源时，AOX1基因的表达受到诱导。AOX1基因的5’ PAOX1 是一个极强的启动子，可由甲醇诱导表达出较高水平的醇氧化 酶，因此是表达外源基因的理想启动子。
第５章 真菌基因工程
酵母菌的基因工程
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 B 酵母菌的宿主系统 C 酵母菌的载体系统 D 酵母菌的转化系统 E 酵母菌的表达系统 F 利用重组酵母生产乙肝疫苗
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征
酵母菌的生物学特征
酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细 胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母 菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。如 果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最 成熟的真核生物表达系统。