第七章 酵母基因工程
酵母基因工程综述
酵母基因工程综述姓名：张衡学号：060509215 班级：生工092酵母菌是一类群体庞大的单细胞真核微生物，种类繁多，至少包括 个属， 多种， 多菌株。
它有完整的亚细胞结构和严谨的基因表达调控机制，它既能通过有丝分裂进行无性繁殖，也可以通过减数分裂实现有性繁殖。
酵母菌作为单细胞真核生物，既具有细菌生长迅速、操作简单的特点，又具有真核细胞对翻译后蛋白的加工及修饰的能力，它是表达外源基因的理想宿主。
因此利用酵母基因工程成功的生产了人类、动物、植物或微生物来源的异源蛋白，在医药生物技术上发挥了重要作用。
一、酵母基因工程的发展现状和发展趋势酵母既具有原核生物生长快、遗传操作简单的特点，又有哺乳类细胞的翻译后加工和修饰功能，如二硫键的正确形成、糖基化作用等，用来生产来源于真核生物的生物活性蛋白有很多优点。
目前在酵母基因工程中发展和应用的较多的酵母有酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、巴斯德毕赤酵母等，其应用主要体现在两个方面，一是改造酵母本身用以提高发酵性能；二是利用酵母作为宿主表达异源蛋白。
、酿酒酵母自身的改造： 、将葡萄糖淀粉酶基因导入酿酒酵母； 、将外源的蛋白水解酶基因导入酿酒酵母； 、将β—葡聚糖酶基因导入酵母； 、将 硫酸化酶和腺苷酰硫酸激酶基因在酿酒酵母体内表达； 、将人血清清蛋白（ ）的基因转化到酿酒酵母。
、酵母表达异源蛋白： 、表达水平； 、表达质量。
对于酵母基因工程，在构建各种表达载体、建立新的表达系统方面取得了一系列进展。
在未来一段时间内，酵母基因工程的研究将逐步转移到完善现有的表达系统、解决存在的缺陷、扩大应用领域等方面。
对酵母自身的改造集中体现在如何通过转基因技术使酿酒酵母能利用纤维素和半纤维素等可再生物质来生产廉价的酒精，缓解能源紧张。
、解决酵母基因工程中还存在的缺陷； 、在人类基因组计划中的应用研究是一个重要的发展方向； 、利用酵母基因工程筛选更多的新药； 、改造酿酒酵母自身，降低生产酒精的成本； 、酵母的生理承受极限研究将引起人们的关注。
酵母菌的基因工程
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有CEN的YCp质粒的构建
CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列 将CEN DNA插入含ARS的质粒中，获得的新载体称为YCp YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1～5个
含有TEL的YAC质粒的构建
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建
转化质粒在酵母细胞中的命运
单双链DNA均可转化酵母菌，但单链的转化率是双链的10～30倍 含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制
不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体
这对于体内定点突变酵母基因组极为有利 克隆在YIp整合型质粒上的外源基因，如果含有受体细胞的染色体 DNA的同源序列，会发生高频同源整合，整合子占转化子总 数的50%～80%
酵母菌的转化程序
碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化
酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+等）、PEG、热休克 处理后，也可高效吸收质粒DNA，而且具有下列特性： 吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA，两者相差80倍 共转化现象极为罕见
酵母菌的转化程序
酵母菌电击转化法
酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA， 但在此过程中应避免使用PEG，它对受电击的细胞具有较很大的负 作用。电击转化的优点是不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件 适用范围广，而且转化率可高达105 / mg DNA。
酵母菌的转化程序
酵母菌原生质体转化法
早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化 法，在Ca2+和PEG的存在下，转化细胞可达原生质体总数的1%～ 2%。但该程序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重 制约。 原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳 多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的25%～ 33%。
酵母基因工程
2）碱金属离子介导转化法 酵 母 菌 完 整 细 胞 经 碱 金 属 离 子 ( 如 Li+) 、
PEG、热休克处理后，可高效吸收质粒DNA。 特点：
共转化现象极为罕见；
吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA， 二者相差80倍。
3）电击转化法
酵母菌完整细胞或原生质体可在电击下 吸收质粒DNA。 特性：
幻灯片 5
第二节 常用酵母表达系统
一、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
表达系统
酿酒酵母中的2环状质粒：
野生型，双链、环状，
REP1
FLP
IR
6kb，拷贝数50-100。 RAF A
STB
IRs: 反向重复序列，同源重组
ori IR
REP2
同源重组
FLP: 编码产物驱动IRs同源重组
四、酵母菌的转化方法 原生质体转化法 碱金属离子介导转化法 电击转化法
原生质体转化法
在Ca2+和PEG存在下，转化子可达原生质体 总数的1-2%。 特点： 1个受体细胞可同时接纳多个质粒分子，这种 共转化的原生质体占转化子总数的25-33%； 对线型和环状DNA的吸收没有特异性。
原生质体转化法的缺点： 操作周期长； 转化率受原生质再生率的严重制约。
1974 Clarck-Walker和Miklos发现在多数酿酒酵 母中存在质粒。
1978 Hinnen将来自一株酿酒酵母的leu2基因导 入另一株酿酒酵母，弥补了后者leu2的缺陷，标
志着酵母表达系统建立 1981 Hitzeman用酿酒酵母成功表达人IFN。 1983 我国首次用酵母菌表达HBV HBsAg基因。 1996 完成第一个真核生物--酿酒酵母全基因组测
基因工程在酵母菌中的应用
基因工程在酵母菌中的应用酵母菌是一种非常常见的单细胞真菌，被广泛应用在工业生产、基因工程、生物学研究等领域。
其中，基因工程在酵母菌中的应用越来越受到关注，因为它可以通过改变酵母菌的基因来产生更高效、更安全、更低成本的产品。
一、酵母菌的基因工程基因工程（Genetic Engineering）、也称基因修饰（Genetic Modification），是指人工干预生物基因的技术。
通过将外源基因从别的物种引入到酵母菌中，或者利用已有技术将酵母菌原有的基因进行修改，来达到目的。
以酿酒酵母为例，使用基因工程技术可以让酵母在发酵过程中增强种类芳香、味道、颜色等方面的特性，减少酒类生产中对添加剂的依赖。
此外，基因工程还可以增强酵母在生产生物质和生产酶等方面的能力，提高生产效益和质量。
二、基因工程在生物药品中的应用随着基因工程技术的发展，越来越多的药品开始使用酵母菌系统进行生产，因为酵母菌可以产生大量的复杂蛋白，在药品生产中发挥重要作用。
1. 重组蛋白重组蛋白是由酵母菌制造的人造蛋白质，它由通过DNA技术人工合成的基因进行控制。
重组蛋白可以用于治疗多种疾病，如肿瘤、结缔组织疾病、感染症等。
2. 抗生素一些抗生素是由酿酒酵母制造的，包括属于毒素类的青霉素、链霉素和司云生素等。
这些抗生素可以用于治疗许多细菌感染病，如耳炎、肺炎、中耳炎、胃肠炎等。
三、基因工程在生物燃料中的应用生物燃料是使用生物质或燃料酒精等生物产物，进行发电或其他能源生产的一种新型能源，基因工程在此方面的应用也十分广泛。
1. 生物酒精将酿酒酵母与一种名为琼脂糖的发酵物混合后，然后加入蔗糖，在发酵的过程中，酵母细胞可以将蔗糖转化成酒精。
用于生产生物酒精的酿酒酵母与市面上的酿酒酵母相比，有着更高的酒精浓度和收率，可以使得生产效益更高。
2. 生物柴油利用基因工程技术获得的淀粉酵母株，可以将淀粉直接转化成脂肪酸甲酯（生物柴油）；利用酿酒酵母株，在发酵过程中将纤维素分解为糖分，再将糖分转化成脂肪酸甲酯，生产生物柴油。
基因工程 第七章 酵母基因表达体系(55P)
• 该质粒上共有4个基因：FLP、REP1、 REP2和D．其中FLP基因的编码产物催化 两个IRS序列之间的同源重组，使质粒在A 与B两种形态中转化，REP1、REP2和D基 因均为控制质粒稳定性的反式作用因子编 码基因．上述基因共转录出7种不同分子量 的mRNA分子。
• 2u质粒还含3个顺式作用元件．其中单一的 自主复制子结构(ARS)位于一个IRs的边界 上，REP3(STB)区域是REP1和REP2蛋白 因子的结合位点．对质粒在细胞有丝分裂 时的均匀分配起着重要作用，FRT存在于 两个IRs序列中，大小为50bP，是FLP蛋白 的识别位点。
缺陷在于：
1. 表达效率相对低 2. 酵母常有密码子偏性，真核基因在其中表达时需要人工 修正。
酵母菌的基因工程
酵母菌作为基因工程受体菌的特征 酵母菌表达外源基因的优势
全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操
作简便 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统
大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 能将外源基因表达产物分泌至培养基中 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全 基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe
减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 泛素降解途径衰减的酿酒酵母 UBI4缺陷型： 在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表达，UBI4-突变 株正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要 低的多，因此UBI4缺陷突变株是外源基因表达理想的受 体。 UBA1缺陷型： UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株式致死性的，但 其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导 的蛋白降解。 Ubc4-ubc5双突变型： 七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效。
酵母菌的基因工程课件
拷贝数为50-100个，分别携带K1 K2两种能使多种酵母菌致死的毒
反向重复序列
pGKL1 8.9 kb
素蛋白编码基因（a b g），同时含有毒素蛋白抗性基因。
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有ARS的YRp质粒的构建
ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-40kb 就有一个ARS元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标 记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒DNA。
原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳 多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的25%～ 33%。
酵母菌的转化程序
碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化
7 酵母菌的基因工程
A 酵母菌作为基因工程受体菌的特征 酵母菌的分类学特征
酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细 胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母 菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。如 果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最 成熟的真核生物表达系统。
泛素降解途径衰减的酿酒酵母
UBI 4缺陷型： 在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4-突变株能 正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多， 因此UBI 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体
UBA 1缺陷型： UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株是致死性的，但其等位 基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解
生物效应
改善重组蛋白分泌 提高重组蛋白表达 提高重组蛋白表达 提高重组蛋白表达 改善重组蛋白分泌 提高重组蛋白表达
作用位点
钙离子依赖型的ATP酶 转录后加工 转录水平 转录水平 羧肽酶Y 转录水平
酵母基因工程
酵母基因工程一酵母基因工程的发展现状1.酿酒酵母自身的改造（1）将葡萄糖淀粉酶基因导入酿酒酵母（2）将外源的蛋白水解酶基因导入酿酒酵母（3）将β—葡聚糖酶基因导入酵母（4）将ATP硫酸化酶和腺苷酰硫酸激酶基因在酿酒酵母体内表达（5）将人血清清蛋白（HAS）的基因转化到酿酒酵母2酵母表达异源蛋白（1）表达水平（2）表达质量2酵母基因工程的发展趋势（1）解决酵母基因工程中还存在的缺陷（2）在人类基因组计划中的应用研究是一个重要的发展方向（3）利用酵母基因工程筛选更多新药（4）改造酿酒酵母自身，降低生产酒精的成本（5）酵母的生理承受极限研究引起人们的关注3发展历程1.1974年rlarck—walker和Miklos发现在大多数酿酒酵母中存在质粒。
2.1978年Hmnen将来自一株酿酒酵母的leu 2基因导入另一株酿酒酵母，弥补了后者的Leu2缺陷，标志着酵母表达系统的建立。
3.1981年Hinnen等用酵母基因表达系统表达了人干扰素。
4.我国也在1983年首次用酵母菌表达了乙型肝炎病毒表面抗原基因。
5.1996年在全世界科学家的通力合作下，完成了第一个真核生物——酿酒酵母全基因组的测序。
二．酵母基因工程的优点1.安全无毒，不致病；2.有较清楚的遗传背景，容易进行遗传操作；3.容易进行载体DNA的导入。
DNA转化技术的不断发展优化，多数酵母菌可以取得较高的转化率；4.培养条件简单，容易进行高密度发酵；5. 能将外源基因表达产物分泌到培养基中；6.有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能三．酵母表达系统（1）酵母表达载体①载体的基本构架：大肠杆菌和酵母菌的“穿梭”质粒。
原核部分：大肠杆菌中复制的起点序列(ori)和抗生素抗性基因序列。
酵母部分：1酵母菌中维持复制的元件：2μ质粒复制起点；自主复制序列(ARS)；整合型载体的整合介导区。
2营养缺陷型基因序列、抗生素抗性基因序列3基因启动子和终止子序列4信号肽序列②载体的复制形式附加型载体：在酵母染色体外自主复制1酿酒酵母2μ质粒的DNA的复制元件所构建的2酵母基因组DNA的自主复制序列ARS所构建的整合型载体：随同酵母染色体一起复制1含有与受体菌基因组有某种程度同源性的一段DNA序列，介导载体与宿主染色体之间发生同源重组。
酵母基因工程
2
甲醇酵母表达系统具有以下优点: （1）启动子强并受甲醇严格诱导，因此可用于调控外源 蛋白的表达。 （2）作为真核表达系统，能对重组蛋白进行翻译后必要 的剪接、折叠和修饰，糖基化也更接近高等真核生物甚至 人类。 （3）甲醇酵母在转化、基因转换、基因替换、基因敲除 等基因操作技术上与酿酒酵母相似，简单易行，但是外源 蛋白的表达量却比酿酒酵母增加了10—100倍。 （4）重组菌的遗传性质稳定，表达量和分泌效率高，适 于大规模发酵。 （5）能在无机盐培养中迅速生长，易进行工业化生产， 高密度培养干细胞量可达100g/L以上。
酵母基因工程的发展现状
目前酵母基因工程中发展和应用较多有酿 酒酵母、乳酸克鲁维酵母等，其应用主要 体现在以下两方面： 1、酿酒酵母自身的改造 （1）将葡萄糖淀粉酶基因导入酿酒酵母（可 自身分泌葡萄糖淀粉酶） （2）将外源的蛋白水解酶基因导入酿酒酵母 （可自身分泌蛋白水解酶）
（3）将β-葡聚糖酶基因导入酵母（有效地降 解麦牙汁中的β-葡聚糖，改善啤酒的过滤效 率） （4）将ATP硫酸化酶和腺苷酰硫酸激酶基因在 酿酒酵母体内表达（促进SO2 的生成，维持啤 酒风味的稳定） （5）将人血清清蛋白（HAS）的基因转化到酿 酒酵母（生产出富含HAS的啤酒新品种）
(1)载体的发展 由于巴斯德毕赤酵母没有稳定的附加体质粒，所以一般用整合型质粒作 为外源基因的表达载体。整合为点一般位于组氨醇脱氢酶编码基 因HIS4区或 AOX1区，典型的巴斯德毕赤酵母表达载体含有乙醇氧 化酶基因5’AOX1启动子、3’AOX1终止子，其中还有供外源基因插入 的多克隆位点，以HIS4基因作为互补选择标记或抗Zeocin作为抗 性选择标记。 (2)受体菌 常用毕赤酵母宿主菌主要有GS115和KM71 ，均为HIS4突变 型 (3)转化方式 巴斯德毕赤酵母的转化方法有原生质体法、电激法、氯化 锂法和PEG法等。 (4)整合方式 党政和载体转化受体菌时，它有3种整合方式。一是 5'AOX1和3'AOX1能与染色体发生同源重组，使受体染色体带有一 个拷贝的外源基因；二是染色体AOX1区与载体质粒的AOX1区发生 单位点互换；三是染色体HIS4基因与载体的HIS4基因发生置换。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Dividing Saccharomyces cerevisiae (baker’s yeast) cells
一. 酵母克隆载体
① 能在E.coli中克隆和扩增。 Ori ②有大肠杆菌的选择标记 Ampr、Tetr。 ③ 有酵母的选择标记 Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+;
如pYF92:
pBR322 2m 酵母his 3+
2m质粒： 酿酒酵母的内源质粒，长度是2m 。含有自主 复制起始区ori和STB序列（使质粒在供体中维 持稳定）。
特点：
①很高的转化活性（103-105转化子/微克 DNA）. ②拷贝数多（25-100分子/细胞）。 ③比YRp稳定。
YEp24
亮氨酸lue2—β-异丙基苹果酸脱 氢酶
• 该酶是把丙酮酸转化成亮氨酸的代谢酶之 一．只要使用亮氨酸lue2突变的营养缺陷型 酵母作受体，载体上带有亮氨酸lue2基因就 能在不含亮氨酸的培养基上实现转化克隆 的筛选（书１７０页图）．
四. 酵母表达系统的特点
（1）优点 ①对其遗传学和生理学的研究比较深入。 ②小量培养和大规模反应器中都能生长。 ③已经分离出很强的启动子。 ④有翻译后的加工。 ⑤本身自然分泌很少，便于胞外蛋白的纯 化。 ⑥安全性高（FDA确认的安全生物），不 需要宿主的安全性检验。
④不稳定，容易丢失。
（3）着丝粒质粒(YCp) 在YRp质粒中插入酵母染色体的着丝粒 区。 YRp质粒 酵母着丝粒 特点： ①行为像染色体，能稳定遗传。 ②单拷贝存在。
③不易从细胞中提取。
（4）附加体型载体(YEp) 由大肠杆菌质粒、2m质粒及酵母染色体 DNA选择标记构成。 大肠杆菌质粒 2m质粒 酵母选择标记
诊断试剂
人类治疗用蛋白药物 上皮生长因子 胰岛素 类胰岛素生长因子 血小板源生长因子 胰岛素前体 成纤维细胞生长因子 集落刺激因子 1抗胰蛋白酶 凝母中表达 嗜甲烷酵母（Pichia pastoris）的特点 • 在大型发酵反应器中容易生长； • 以甲醇作唯一的碳源和能源，成本低。 • 有甲醇时，表达的乙醇氧化酶高达胞内总 蛋白的40%！
二. 酵母转化和表达的一般过程
Leu- 酵母 酶去壁 原生质体
CaCl2、 感受态 PEG
提取 大肠杆菌 酵母载体
插入外源基因 转化
Leu营养 转化子克隆生长 缺陷型 整合到染色体上， 或独立在酵母细胞内 培养基 筛选 外源基因产物 鉴定克隆 发酵表达 分离、纯化
三.用于转化子筛选的标记
• 大多数是以酵母菌氨基酸或碱基合成途径中的结 构基因作为选择标记，如lue2，trp1， his3和 ura3 。使用这些遗传标记时，受体菌应是相应标 记基因的突变型，且是稳定的突变体（缺失突变 或多点突变），利用遗传互补进行转化体选择的。 • 组氨酸his3—咪唑磷酸甘油脱氢酶; • 亮氨酸lue2—β-异丙基苹果酸脱氢酶; • 赖氨酸lys2—β-氨基已二酸还原酶; • 色氨酸trp1—N-邻氨基苯甲酸异构酶; • 尿嘧啶ura3—乳清苷-5`-磷酸脱羧酶;
④ 有合适的克隆位点。
（1）整合型载体(YIp) 由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片断（选 择标记）构成。
如 PYeleu10: ColE1 酵母Leu 2+
特点： ①转化率低（1-10转化子/微克DNA）。 ②不能在酵母细胞中自主复制 载体上只有细菌的复制区，没有 酵母的自主复制区。 ③整合到酵母的染色体上 可与受体细胞的染色体DNA同源重组， 随染色体一起复制。 ④不能从酵母细胞中提取载体。
（2）复制型载体(YRp) 由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片断(选择标记 和酵母DNA自主复制顺序ARS）构成。
大肠杆菌质粒 酵母ARS 酵母选择标记
ARS
ARS（automously replicating sequence）:
250bp
保守区
ATTTTATATTTA T G T
特点： ①转化率高（102-103转化子/微克DNA) 。 ②可从大肠杆菌和酵母中提取质粒。 ③穿梭载体（shuttle vector） 既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母 细胞中自主复制。
表达载体构建（整合型）：
HBsAg: 乙肝表面抗原。可以作为疫苗。 Aox1：乙醇氧化酶基因1启动子（受甲醇激活调控）。 His4：组氨酸合成所需的组氨酸脱氢酶基因。 3’-aox1：整合到特定染色体的位点序列。
诱导物：甲醇。
产量：9×106剂疫苗/240L发酵罐。
整 合 到 染 色 体 中
（2）缺点 ①表达量普遍低。 ②常常发生质粒丢失。 ③重组蛋白常常超糖基化 每个N-寡糖链上含有100多个甘露糖，
正常的高甘露糖寡糖链上仅有8-13个甘露糖。
④分泌困难。 分泌型蛋白有时会留在壁膜间隙，
五. 在啤酒酵母中表达的重组蛋白
种类 疫苗 名称 乙肝病毒表面抗原 疟原虫环子孢子蛋白 HIV-1外壳蛋白 丙肝病毒蛋白 HIV-1抗原