第七章植物基因工程

必须同处于一个植物细胞中，方能形成有感染力的病
毒。双生病毒具有广泛的宿主细胞范围，因此是一种 很有潜力的植物病毒载体。
TGMV A 链
转染植物组
TGMV dsDNA
体外复制 用目的基因和标记基因取代病毒包衣基因
织 双生病毒家
族成员蕃茄 金花叶病毒 （ TGMV ） 克隆表达载 体的构建程 序
农杆菌筛选标记
（6）第六步 土壤农杆菌代谢冠瘿碱。
(3).Ti质粒转化的对象 裸子植物、双子叶被子植物、禾谷类单子叶 植物（玉米 (4). Ti质粒作为载体的可能性 能够自发地整合到植物的染色体上。 能转化多种植物。 强启动子 T-DNA的opine合成酶基因上有一个强 启动子，能启动外源基因的表达。
（5）Ti 质粒致瘤的分子机制： 损伤的植物根部会分 泌出乙酰丁香酸和羟基乙酰 丁香酸，它们能诱导Ti质粒 上的vir基因以及根瘤菌染 色体上的一个操纵子表达。 vir基因产物将Ti质粒上的 T-DNA单链切下，而根瘤菌 染色体上的操纵子表达产物 则与单链T-DNA结合形成复 合物，转化植物根部细胞。
pBR322不能在土壤农杆菌中复制，只能同 pGV3850重组。只有这样，土壤农杆菌才能得 到抗卡那霉素性状。 外源基因
插入
Kanr pBR322
转化
抗卡那霉素 卡那霉素筛选 土壤农杆菌 的土壤农杆菌 pBR322与 pGV3850重组 含pGV3850 感染 外源基因 胭脂碱筛选 植物组织 表达鉴定 整合到
很多高等植物拥有比人类更大的基因组，并以 多倍体的形式存在。大约三分之二的禾本科植物 呈多倍体型，其染色体数目范围从24至144不等。 这种多倍体植物在组织培养过程中呈现出较高的 遗传不稳定性，导致体细胞变异
高等植物基因工程的发展历程
1983 年美国和比利时首次将外源基因导入烟草和胡萝卜 1994 年世界上第一种耐储藏的番茄在美国批准上市 1995 年转基因抗虫、抗除草剂玉米和棉花在美国投入生产 2000 年美国转基因大豆的种植面积首次超过普通大豆 迄今为止世界上共批准了12种作物、6大类性状的48 个转基因品种进行商业化生产，其中包括水稻、玉米、马 铃薯、小麦、黑麦、红薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、 油菜、亚麻、甜菜、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡萝卜 、黄瓜、芦笋、苜蓿、草莓、木瓜、猕猴桃、越橘、茄子 、梨、苹果、葡萄等。
三、高等植物的基因转移系统
Ti 质粒介导的整合转化程序
植物病毒介导的转染程序 植物细胞的直接转化程序
植物原生质体的再生程
序
（一）Ti 质粒介导的整合转化程序 Ti 质粒的结构与功能
几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部
常常会形成根瘤（冠瘿瘤），这是由于植物根部被一
种革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌（A.tumefaciens
②毒性基因（vir） 决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的转 移， 进入和整合。使根癌农杆菌表现出毒性。 ③Con 区(regions encoding conjugations，接合转移编码区)：该区 段上存在与细菌间接合转移的有关基因， 调控Ti 质粒在农杆菌之间的转移。
④Ori区(origin of replication，复制起 始区)：Ori区上的基因调控Ti 质粒的自我 复制。
Ti的精髓：Vir基因（转移）和左右界（整合）
②双元载体的转化 1）基因插入 转化农杆菌之前，所有的克隆步骤都 在大肠杆菌里操作。 2）帮助质粒（ helper plasmid） 受体农杆菌内要求带有整套vir基因 （但缺失T-DNA及左右边界）的“帮助 质粒”提供vir产物。 Vir产物使双元载体上的T-DNA左右 边界及其外源基因转入到植物细胞， 并整合到植物染色体上。
换上外源基因，体外包装成有感染力的病毒颗
粒，转染植物细胞原生质体，并由此再生成整
株植物。
植物病毒介导的转染程序 转染植物组织
植物双生病毒（Geminiviruses）为一单链DNA
病毒，成熟的双生病毒呈双颗粒状，每一个颗粒中含 有一条不同的DNA单链。其中A链能单独在植物细胞 中复制，并含有一部分病毒包衣蛋白基因； B链编码 另一部分包衣蛋白基因及感染性基因。 A、 B两条链
E.coli 左 外源基因 右 双元载体 转化
农杆菌 Vir 帮助质粒
左 外源基因 右 感染植物
进入植物细胞核， 整合，表达
Vir 左 外源基因 右
农杆菌
双元系统的特点
• 双元系统的特点是两个质粒即穿梭质粒和Ti质粒，在接合 后可以自主性地共存于同一农杆菌细胞中。 • 穿梭质粒编码植物选择标记，表达信号，并具有位于两个 T-DNA边界序列之间的用于外源基因的多克隆位点。 • 双元系统中的农杆菌质粒是一个经过改造的Ti质粒，具有 Vir基因和农杆菌复制起始子(OriA)，但没有T-DNA边 界序列。 • 接合后，两个质粒在选择压下可以自主共存于同一农杆菌 细胞中。当农杆菌感染受伤的植物时，Ti质粒上的Vir基 因与穿梭质粒上的左右边界序列发生相互作用，从而将 T-DNA转移进入植物基因组。
(2). 农杆菌的感染和生存
①第一步:植物受伤
植物受伤后能分泌酚类化合物（如乙 酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮），诱导 Ti质粒上的毒性基因表达。
②第二步 感染植物 脓杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常 在茎的基部）。 第三步 毒性基因（vir）表达 virA、virG、virD、virB ④第四步 T-DNA转移 T-DNA被vir基因产物切下来，并运送到植 物细胞核里，整合到植物基因组中。 ⑤第五步 诱导冠瘿瘤 T-DNA上的产物催化产生过量的生长 素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。
（8）、Ti 质粒的改造
除去生长素（tms）和分裂素（tmr）生物合成基因； 除去T-DNA上的有机碱生物合成基因（tmt）； 除去 Ti 质粒的其它非必需序列，最大限度地缩短长度；
安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制，以利于克 隆操作； 安装植物细胞的筛选标记，如 neor 基因，使用植物基因的
第七章 植物基因工程
一、高等植物的遗传特性
植物的基本特征
遗传操作的简易性
整株植物的再生性 染色体的多倍体性
植物的基本特征
植 物 低等植物 高等植物
无根、茎、叶等分化器官 合子不经胚直接发育为个体 藻类 地衣
含根、茎、叶、花、果分化器官 合子经胚再发育为个体 苔藓门 蕨类门 裸子门 被子门
遗传操作的简易性
①T-DNA（transfer-DNA）
转移DNA，编码冠瘿碱的合成，能随机整合到植物 的染色体上。长度一般为12-24kb，是Ti质粒最重 要的部分。 左边界 生长素 细胞分裂 基因 素基因 冠瘿碱 合成 右边界
生长素基因: tms、tmr基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促 使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤 ; iaaM（tms1）和iaaH（tms2）控制由色氨酸产生生长 素吲哚乙酸的生物合成途径.
）感染所致，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质 粒 Ti质粒（Tumor-inducing plasmid）介导的，又 称肿瘤诱导质粒。
（1） Ti 质粒的图谱区
整个质粒160 -240 kb T-DNA区、Vir区、 Con区、Ori区 其中T-DNA 12 -24 kb tms的编码产物负责： 合成吲哚乙酸 tmr的编码产物负责： 合成植物分裂素 tmt的编码产物负责： 合成氨基酸衍生物冠瘿 碱
染色体上
转化后可诱导愈伤组织分化成转基因植物
共 整 合 转ectors） 既有大肠杆菌复制起点也有农杆菌复制 起点，是个穿梭载体。 ①双元载体的结构 Ti质粒被剔除了T-DNA、冠瘿碱代谢 基因、vir基因。 大幅度减小质粒的体积。（<10kb）
tmt 基因编码产物催化合成冠瘿碱(Opines)。冠瘿 碱的代谢产物为氨基酸和糖类，是根癌农杆菌生长 必需的物质，供根癌农杆菌作为营养使用。是农杆 菌的碳源和氮源。大部分其他土壤微生物都不能利 用冠瘿碱。 在T-DNA 的两端还含有左右2 个边界，左边界 (left border, LB)和右边界(right border, RB) 是长为25bp的末端重复顺序，在切除及整合过程 具有重要意义。
（6）T-DNA的染 色体整合机制
(7). 天然Ti质粒作载体的缺点
①野生型Ti 分子大（200kb）操作起来十分麻烦； ②各种限制型酶切位点多，切割产生很大片段。且单一的 酶切位点很少；
③tms和tmr 基因产物干扰植物内源激素的平衡，产生 冠瘿瘤，阻碍转基因植物细胞的分化和再生；
④冠瘿碱的合成过程消耗大量的精氨酸和谷氨 酸，直接 影响转基因植物细胞的生长代谢； ⑤无大肠杆菌的复制起点和作为转化载体的选择标记基因。
② 选择标记
1）脓杆菌选择标记 宿主土壤农杆菌的选择标记是位于中间 载体pBR322上的卡那霉素抗性（Kanr） 基因。 2）最终受体植物的选择标记
卡那霉素抗性（ Kanr ）基因（卡那霉 素对植物有剧毒！） 位于T-DNA右半部分的胭脂碱合成酶基 因（nos）。
③ 外源基因插入 pGV3850的过程
转染植物细胞原生质体 以双链 DNA 病毒花椰菜花斑病毒（ CaMV
）基因组作为载体，去除有关的致病性基因，
换上外源基因，体外包装成有感染力的病毒颗
粒，转染植物细胞原生质体，并由此再生成整
株植物。
植物病毒介导的转染程序
转染植物细胞原生质 体 以双链 DNA 病毒花椰菜花斑病毒（ CaMV
）基因组作为载体，去除有关的致病性基因，
• 插入外源基因的重组穿梭质粒直接转化含 有Ti质粒的根瘤农杆菌，经筛选后直接感 染植物细胞。 • 与共整合系统所不同的是，含外源基因的 质粒可在农杆菌内自主复制并保留下来。 农杆菌侵染植物细胞后，植物的创伤信号 启动Ti质粒上的Vir基因，随后将穿梭质粒 的T-DNA切割下来，转移到植物细胞中。