第八章 植物基因工程
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(完整版)植物基因工程
5 Viruses can be used as vectors for whole plants
6 Guns and electric shocks transfer DNA into plant cells
7 Molecular cloning of plant genes
8 Arabidopsis is being used as a model organism for molecular genetic analysis of plants
Ⅳ Application of plant genetic engineering
Ⅴ Biosafety
Genetic Engineering of Plants
Ⅰ Plants are very important for mankind
1) Photosynthesis 2) Food 3) Environmental improvements
Genetic Engineering of Plants
Ⅲ Principles and methods
1 Whole plants can be grown from singe cells
2 Leaf disks are an important target for gene transfபைடு நூலகம்r
4 Reporter genes demonstrate transgene expression in plant tissues
5 Viruses can be used as vectors for whole plants
T-DNA contains: 1) opine systhesis genes 2) iaaM, iaaH—auxins 3) iptZ--phytohormone
6 Guns and electric shocks transfer DNA into plant cells
7 Molecular cloning of plant genes
8 Arabidopsis is being used as a model organism for molecular genetic analysis of plants
Ⅳ Application of plant genetic engineering
Ⅴ Biosafety
Genetic Engineering of Plants
Ⅰ Plants are very important for mankind
1) Photosynthesis 2) Food 3) Environmental improvements
Genetic Engineering of Plants
Ⅲ Principles and methods
1 Whole plants can be grown from singe cells
2 Leaf disks are an important target for gene transfபைடு நூலகம்r
4 Reporter genes demonstrate transgene expression in plant tissues
5 Viruses can be used as vectors for whole plants
T-DNA contains: 1) opine systhesis genes 2) iaaM, iaaH—auxins 3) iptZ--phytohormone
第七章 植物基因工程1-4
第八章植物基因工程基因工程：在基因的水平上改造生物的技术体系，是指在体外对生物DNA进行剪切、加工，把不同亲本的DNA分子重新组合，并把它引入细胞中表达出具有新的遗传特性的生物这一过程。
植物基因工程：又称植物遗传转化/转基因，是将外源基因转移到植物细胞内，并稳定地整合、表达与遗传的技术。
目的是改变植物性状，培育高产、优质high yield、抗逆新品种/系；或者利用转基因植物/细胞来生产外源基因的表达产物。
植物转基因研究的用途：1）理论研究：如基因功能分析；2）实践应用：如作物遗传改良。
基因工程的基本内容1）目的基因的分离；2）目的基因与载体连接；3）重组分子转入寄主细胞并繁殖；4）阳性克隆的筛选；5）从阳性克隆中提取已扩增的目的基因；6）目的基因克隆到表达载体，导入寄主细胞并表达。
植物基因工程的一般流程目的基因的分离→表达载体的构建→植物遗传转化→转化体的筛选、鉴定与植株再生→转基因植物的分子检测→转基因植物的表型鉴定→转基因植物的遗传分析、田间试验经遗传改良的生物, 统称：genetically modified organism (GMO)；Genetically engineered organism (GEO)。
转基因植物(transgenic plants), 又称：genetically modified plant (GMP)；genetically modified crop (GMC)。
第一节目的基因的分离目的基因：已经或准备要分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA 片段，称为~。
可能是:1）全长基因：外显子+内含子+转录启动区+终止区；2）全长cDNA：UTR区+编码区（ORF）；3）开放读框/编码区（ORF，CDS）；信使核糖核酸(mRNA)分子中能翻译成多肽的那部分序列。
来自DNA分子中的外显子。
4）一个完整的操纵子或基因簇；5）只含启动子或终止子等元件的DNA 片段。
《基因工程》第八章基因工程的安全防护
基因工程的安全防护
二. 生物公害的控制
1. 实验人员适应性训练 随着学科之间的交叉和渗透, 大量其它专业的科学家( 随着学科之间的交叉和渗透, 大量其它专业的科学家( 物 理、化学、工程学、数学等) 进入了这一领域. 这些人缺乏生 化学、工程学、数学等) 进入了这一领域. 物学, 特别是有关病原微生物的知识. 物学, 特别是有关病原微生物的知识. 对从事基因操作的实验人员进行以下几方面的训练: 对从事基因操作的实验人员进行以下几方面的训练: 不同危险度微生物的操作技术; 不同危险度微生物的操作技术; 关于物理防护的技术知识; 关于物理防护的技术知识; 关于生物防护的技术知识; 关于生物防护的技术知识; 有关拟开展的实验的安全知识; 有关拟开展的实验的安全知识; 处理事故的能力； 处理事故的能力；
基因工程的安全防护－生物公害的控制 2.生物防护 2.生物防护 ( Biological Containment ) 2) 宿主细胞 宿主细胞应当具有在特定的有选择的条件下生存、 宿主细胞应当具有在特定的有选择的条件下生存、繁 殖, 而在一般自然条件下很难生存和繁殖的生物特性( 例如, 而在一般自然条件下很难生存和繁殖的生物特性( 例如, 营养缺陷型菌株、低温条件生长菌株等) 营养缺陷型菌株、低温条件生长菌株等)。 DNA重组体 3) DNA重组体 DNA重组体在自然条件下对人类和生态环境应当是安全 DNA重组体在自然条件下对人类和生态环境应当是安全 无害的。 无害的。
基因工程的安全防护－生物公害的控制
4. 重组体的保管 除了上述的安全防护外, 除了上述的安全防护外, 还应该 : 建立特殊实验的管理和健康监督安全管理机构和规则; (1) 建立特殊实验的管理和健康监督安全管理机构和规则; (2) 对安全性没有把握的实验, 要进行特殊管理, 对安全性没有把握的实验, 要进行特殊管理, 并进行临 床人体实验; 床人体实验; 在实验前和实验后一年内, 应对实验人员进行健康检查. (3) 在实验前和实验后一年内, 应对实验人员进行健康检查.
第八章植物基因工程总结
农杆菌
Vir 帮助质粒
左 外源基 右 感染植物
进入植物细胞核， 整合，表达
Vir 左 外源基因 右
农杆菌
双元系统的特点
双元系统是穿梭质粒和Ti质粒两个质粒 ，在接合 后可以自主性地共存于同一农杆菌细胞中。
穿梭质粒编码植物选择标记、表达信号、多克隆 位点、两个T-DNA
④Ori区(origin of replication，复制起 始区)：Ori区上的基因调控Ti 质粒的自我 复制。
(2). 农杆菌的感染和生存
第一步:植物受伤 乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮诱导Ti
质粒的毒性基因表达。 第二步 感染植物
脓杆菌吸附于植物的表面伤口部位 第三步 毒性基因（vir）表达 第四步 T-DNA转移
ori
(7) Ti载体的类型
共整合载体（cointegrate vectors） 由比利时科学家P.Zambrisky等1983年改造 的pGV3850 受体载体，需要同源重组才能插入外源基因。
双元载体（binary vectors） 既有大肠杆菌复制起点也有农杆菌复制起点， 是个穿梭载体。
①pGV3850
外源基因插入pGV3850 的过程
pBR322不能在土壤农杆菌中复制，只能同 pGV3850重组。只有这样，土壤农杆菌才能得 到抗卡那霉素性状。
外源基因 插入
Kanr pBR322
抗卡那霉素 卡那霉素筛选
转化
的土壤农杆菌 pBR322与 土壤农杆菌 感染 pGV3850重组 含pGV3850
植物组织
物的细胞中 筛选转化细胞，并诱导产生转基因植株 转基因植株大规模种植
三、外源基因导入植物的方法
（一）DNA直接转移法
化学刺激法
植物基因工程
转化体的鉴定
转基因植物的鉴定主要集中在DNA、RNA和目的蛋白三个层面上。 1.DNA水平
southern 杂交；斑点杂交（dot blotting）:是在southern 杂交基础上发展而来的
快速检测特异核酸的方法。其基本的原理是通过抽真空的方式将加在多孔过滤进样器 上的核酸样品直接转移到杂交膜上，然后再按southern 杂交法进行杂交；PCR。 2. RNA水平 Northern 杂交；RT-PCR（逆转录PCR）：先将mRNA转录成cDNA，再设计一对 引物扩增杂交分子。 3.蛋白质水平 western 杂交,elisa等。
• 后来的研究表明，在Ti质粒中，只有一小
Ti质粒的构成 Ti质粒的基因结构：T-DNA区、Vir区、 Onc区和Ori区共4个区段。 1 、Vir区(毒性区) 在Ti质粒T-DNA区的上游的一组基 因。表达产物激活T-DNA向植物细 胞转移，使植物引发肿瘤。 2、 Onc区 含有农杆菌之间接合转移有关的基
•构建植物基因Biblioteka 程载体 •将外源基因导入植物受体 •转基因植物的鉴定
1.目的基因的分离和克隆
已知基因的获得： • 化学合成法 • PCA显示差异技术筛选差异表达基因， • 差异蛋白谱表达技术筛选功能基因
2.构建植物基因工程的载体
导入体细胞，是否启动表达的一类特殊用途的基因。它应用不依赖于外界选 择压力的存在，这一点也是它与选择基因的区别之处。 理想报告基因的基本要求： 受体细胞不存在相应的内源等位基因的活性。 它的产物是唯一的，且不会损害受体细胞。 具有快速、廉价、灵敏、定量和可重复性的检测特性。
最常用的报告基因
ß -葡萄糖苷酸酶基因（gus）; 氯霉素乙酰转移酶基因； 荧光素酶基因; 分泌型碱性磷酸酶 ; 荧光蛋白家族
Tan第八章植物基因工程及应用
9/27/2018 11:06 AM
欢迎02级农业生物技术班同学们听课！
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双元载体系统
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农杆菌转化植物细胞
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(三). 改良植物性状的策略
课程要求
• 通过本课程的学习，掌握基因工程的 一些基本原理和基本操作技术等。 • 总成绩＝平时（20％）＋实验（30％） ＋考试（50％） • 平时成绩(考查迟到、早退，课堂提问、 讨论、遵守课堂纪律等方面)
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教材和参考文献
授课课时: 40 学时， 实验：20 学时 (S502),第3周开始(1单2双周)
考试方式: 笔试
上课地点: 1－208，3－511（6－9周）
任课教师:谭志远教授，办公室，S508
联系电话: 85288311, Email zytan@
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Ti质粒的结构
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表达载体pBIn19的结构
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农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮这些酚类物质可以诱导virvirulenceregion基因的启动表达vir基因的产物将ti质粒上的一段tdna单链切下而位于根瘤染色体上的操纵子基因产物则与单链tdna结合形成复合物转化植物根部细胞
基因工程-8-植物基因工程
3.1 T-DNA功能 致瘤基因 冠瘿碱合成酶及其分解基因
3.2 Vir 的基因功能
① 细菌附着到植物受伤细胞上 ② Vir基因产物加工T-DNA形成单股DNA片段 ③ T－股（T Strand）被转入植物细胞，整合到寄 主基因组中 ④ T－DNA基因被表达，使植物细胞增殖并产生冠 瘤碱
4. Ti质粒的改造
① 基因附加：通过添加1个或多个基因改变植物的性状。 ② 基因扣除：使一个或多个植物已经存在的基因失活
利用反义RNA延迟番茄果实的成熟
多聚半乳糖醛酸酶基因
第二节 植物基因工程技术的应用
抗病 抗虫 四“抗” 抗药 一提高 抗逆（寒，旱，盐） 提高营养价值 1、高营养价值的基因工程植物 双子叶植物 单子叶植物 大豆 小麦，水稻，玉米 赖氨酸 高 低 蛋氨酸 — 高（16％） 设计多种必须氨基酸密集基因 复合Aa蛋白质
2、抗病基因工程植物 烟草花叶病毒外壳蛋白基因 烟草，番茄 1986年，美国第一次，棉花枯萎病 黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因 黄瓜 抗性株 大豆花叶病毒外壳蛋白基因 大豆 抗性株 3、抗虫基因工程植物 烟草 番茄 苏云金杆菌 马铃薯 抗性植株 产毒基因 玉米 （15个） 大豆 油菜
（96年）从苍蝇 中分离抗菌基因
4、抗除草剂基因工程植物
以除草剂为底物的酶的基因
5 5、抗逆基因工程植物
抗冻、旱，抗缺氧
6、转基因工程植物产生药物
① 转基因烟草生物单克隆抗体 ② 荷兰用转基因马铃薯产生人血清蛋白 ③ 南朝鲜用基因烟草产生人胰岛素
第三节 植物基因工程的完全性
• • • • • 毒性问题 过敏反应问题 营养问题 对抗生素的抵抗作用 对环境的威胁
第七章
植物基因工程
植物基因工程操作的一般程序
基因工程-第八章植物基因工程
第八章植物基因工程因原文件较大，特转换为灰色PDF格式，有需要PPT 格式的，请下载后索取。
QQ:312161752植物基因工程研究内容▪1、从植物群体中分离有用的目的基因▪2、寻找或构建能够承受人们感兴趣的外源基因的插入和进行遗传转化等特性的克隆载体▪3、将重组载体通过体外转化等方法导入植物受体细胞，并整合到寄主染色体上▪4、使有重组载体DNA的植物细胞或组织，再生形成形态正常的后代▪5 、理想的情况下，使这些植物能够通过有性过程，将外源目的基因持续的传给后代第一节高等植物的转化系统▪有三大类植物转基因方法：▪质粒整合▪病毒感染▪物理转移一、Ti质粒介导的整合转化系统土壤杆菌属和根瘤菌属的细菌，是同属于根瘤菌科的格兰氏阴性菌，在土壤中的含量极为丰富。
土壤杆菌区别于绝大多数其它细菌最主要的特征是，它们能够诱发植物产生肿瘤能够引发冠瘿的土壤杆菌分类为根瘤土壤杆菌，而能够诱发茎瘿的土壤杆菌分类为毛根土壤杆菌，它们是分布广泛的植物疾病“冠瘿病”、“毛根病”的病原菌，又称为毒性菌株。
▪病原土壤杆菌▪这些细菌所携带的特殊质粒，具有用作植物基因克隆载体的潜在可能性。
其中有两种土壤杆菌,即根瘤土壤农癌杆菌(Agrobacterium tumefaciens)发根土壤农癌杆菌(Agrobacterium rhizogenes)▪冠瘿瘤是由一种土壤农癌杆菌细菌在感染部位形成的植物肿瘤。
当受伤的植物被土壤农癌杆菌感染时，土壤农癌杆菌并不进入植物细胞，而是把一种环状染色体肿瘤诱导质粒(Ti)中的T-DNA片段转移入细胞。
▪来自天然Ti质粒的基因表达，其表达产物刺激细胞无休止分裂，由快速分裂的细胞形成的结构即为冠瘿瘤。
冠瘿瘤细胞可获得独立、非调节性生长特性。
培养时，这些细胞可在正常细胞无法生长的缺乏植物激素的培养基上生长。
T-DNA能够进行高频转移，而且这种转移常常是以未发生变化的完整形式整合到植物的核基因组上。
同时，Ti质粒几乎不存在包装的限制问题，大到50kb的外源DNA也能被顺利的包装和转移。
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图11-4 用二元载体系统将多聚半乳糖醛酸酶的反义 基因导入蕃茄细胞
第三节 植物外源基因的表达
一、植物表达病毒的外壳蛋白、核酶和反义 ＲＮＡ提高植物的抗病毒的能力。
二、植物表达微生物毒素提高对昆虫的抗性 三、物表达抗除草剂基因提高对除草剂 的
抗性 四、植物表达不同影响花的颜色、形态和生
长特性的基因产生新的花卉品种
复制的质粒克隆位点上。 • ２、将一中间穿梭质粒引入大肠杆菌细胞，通过在pBR322序列上编
码的氨苄青霉素抗性基因选择转化子。
• ３、然后通过大肠杆菌和土壤农癌杆菌的交配特此质粒转移到土壤农 癌杆菌细胞内。
• ４、两种质粒上的T-DNA序列发生同源重组，穿梭质粒（中间载体） 整合入整合质粒（pＧＶ３８５０）。这一过程使穿梭质粒全部融入 T-DNA的左右边界内。没有整合的质粒不会累积，因为它们不含土壤 农癌杆菌的复制起点。
1、培育抗病毒作物
• (1)、 外壳蛋白介导的抗性 • (2)、 反义RNA介导的抗性 • (3)、 利用缺损的复制酶 • (4)、 干扰运动蛋白 • (5)、 卫星RNA介导的抗性
• 烟草花叶病毒(TMV)是一种6．5kb大小的 RNA病毒。通过克隆病毒cDNA，发现该病 毒基因组编码4种多肽：两种复制酶亚单位， 一种外壳蛋白和一种与细胞间运动有关的
下来。
•
（３）、植物可产生大量的后代，稀有突变体和重组体就得以保
留。
•
（ment)，它们可用作
载体或作为插入诱变剂。
•
（５）、可利用植物的再生能力，可由单个细胞再生成一个完整
的植株。
• ２、缺点
• （１）、许多植物是多倍体，因而具有庞 大的基因组。
重要蛋白。转基因植物在土壤农癌杆菌基 因转移介质中将表达TMV的外壳蛋白 (CP)(图10—11)。
• （二）、Ti质粒的T-DNA部分转移至植物
• １、3种成分与Ti质粒肿瘤诱导有关(图10—4)。
• （1）、T-DNA，它可转移至宿主细胞，是一种可 移动因子。
• （２）、vir基因(virulence的缩写)可产生转移活 动蛋白，它对增强植物细胞的转化是必须的。
• （３）、间接参与转化的基因，它们位于土壤农 癌杆菌染色体上，负责将细菌细胞接合于植物上。
• ２、Ｔ－ＤＮＡ整合进植物染色体的机制
• （１）、土壤农癌杆菌中的vir基因被植物细胞伤口产生 的化学物质所开启(图10—4)。
• （２）、Vir基因的活动，T-DNA因子脱离开质粒DNA。 T-DNA两侧是Ｔi质粒序列，各25如长。这些傍侧序列称 作边界(border)，它们参与T-DNA序列的切割。使T-DNA 以单股链形式脱离。
第八章 植物的基因工程
• 植物育种已成为应用遗传学的一个非常重要的分 支。传统的植物育种方法速度慢，且具不确定性。 要引入一个或一套所需基因，传统的方法需要两 系间的有性杂交，然后进行杂种后代与一亲本间 的重复回交，直到植物获得所需性状。
• 重组DNA技术的出现突破了上述限制。植物遗传 专家可将所需性状的基因(如抗虫害基因)克隆， 并将此类基因引入到有价值的植物品种当中。
第一节 再生植株
•
一、植物在遗传工程方面的优缺点
•
１、优点
•
（１）、拥有在分子水平上可加以利用的大量植物品种，这些
品种携带有遗传上各具特点的突变。
•
（２）、许多植物可自体受精，使其特别适合于遗传操作。当一
具有某一突变的植物杂合子自体受精时，谱系中就包含了野生型
植株、杂合型植株和含有突变的纯合型植株，这样突变就保留了
•
图11-5 共整合载体克隆外源基因的过程
双元载体系统
• 两个分别含有T-DNA和Vir区的相容性突变T i质粒，即微型Ti质粒和辅助Ti质粒。
• 微型Ti质粒是含有T-DNA边界，缺失V ir基 因的Ti质粒，为一个广谱质粒，能够在大肠 杆菌和农杆菌中进行复制。还含有选择标 记基因。
• 辅助Ti质粒含有Vir区段，T-DNA缺失的突 变型质粒，完全丧失了致瘤功能。
第二节 植物基因转移的途径
• 一、土壤农杆菌法 • 土壤农癌杆菌(Agrobacterium tumefaciens)
是一种革兰氏阴性菌，它的质粒转入植物 之后导致植物产生冠瘿瘤(crown gall)。这 个菌一般只侵染双子叶植物。
• （一）、土壤农杆菌的Ti质粒引起冠瘿瘤
• 冠瘿瘤是由一些土壤农癌杆菌细菌在感染 部位形成的植物肿瘤(图10－3)。
• （２）、组织培养的植物细胞由于多倍体 的原因可能会引起体细胞克隆变异 (somaclonal variation)现象。
• 二、 单个细胞可生长成完整植株
• 当植物受到机械损伤时，在损伤处将长出一片软 细胞称作愈伤组织(callus)。若将一片幼嫩的愈伤 组织取下并放置于含有适当营养成分和植物激素 的培养基中培养，细胞将继续生长和分化成为悬 浮培养物(悬浮在液体培养基中，含有单个细胞或 小细胞团的培养物)。这些细胞取出后置于平板上， 将形成新的愈伤组织。有时需要用其他细胞作为 保育培养(nurse culture)，相似于用作哺乳类细胞 培养中的细胞滋养层。然后愈伤组织会分化出根 和茎，最后生长成一个完整的开花植株。
• 三、用叶盘再生植株
• １、叶盘在含有土壤农癌杆菌的培养基中短暂培 养后，叶盘边缘的细胞开始再生，这些细胞就充 分暴露在转染剂中(图10—2)。
• ２、将叶盘转移至含有刺激茎枝发育的营养培养 基中培养数日。
• ３、携带质粒的细胞通过刺激茎枝发育培养基中 的适宜抗生素如卡那霉素加以选择。
• ４、茎枝发育几周后，可移至含刺激根生长的培 养基中诱发根的形成。
• （３）、T-DNA从细菌细胞到植物细胞的转移类似于细菌 的接合过程，就像土壤农癌杆菌与植物细胞的交配。
• （４）、多拷贝T-DNA以单个随机位点整合入植物染色体。
• （三）、 T-DNA经过改造后作为基因载体 • 一种称作共整合(cointegration)的方法最初用来与土壤农癌杆菌系统
中的Ti质粒上的T-DNA一起进行基因转移(图10—5)。 • 1、把克隆的基因首先插入到含有T-DNA片段、且能够在大肠杆菌中